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Comment réguler la production de protéines lors de la conception de plasmides ?


Je pense qu'il ne devrait pas être surprenant que, comme beaucoup d'autres, je m'intéresse aux nouveaux vaccins COVID-19 en cours de développement. Dans ma région du monde, il y a deux candidats à la mairie. L'un est basé sur l'ARNm et l'autre, à ma connaissance, sur le plasmide.

J'ai une compréhension passable du vaccin à base d'ARNm. Je sais aussi ce qu'est un plasmide et comment il est transféré entre les cellules, mais ma compréhension est par ailleurs limitée.

Autant que je sache, nous voulons que le plasmide soit "débouclé" et greffé sur l'ADN de nos cellules cibles. Ceci, pour autant que je pense, devrait permettre à la cellule de produire n'importe quelle protéine pour laquelle le plasmide a codé. Dans les vaccins cela permet de disposer d'anti-mesures (vagues à cause de mon manque de connaissances) contre le virus… Mais, comment réguler la production de ces anti-mesures ? Peut-on inclure un « régulateur » de la production dans le plasmide, afin que les cellules modifiées ne produisent les protéines que lorsque le virus est présent ? Ou bien laissons-nous simplement les cellules produire en continu les protéines anti-mesure, quelle que soit leur nécessité ?

Mon intérêt principal ici réside dans l'endroit où se situe la permanence des changements induits par les vaccins. Avec le vaccin à ARNm, je comprends que la permanence réside dans le système immunitaire régulé, les autres cellules étant par ailleurs inchangées après la décomposition de l'ARNm. Concernant le vaccin ADN/plasmide, je suis encore imprudent.

Merci pour votre temps et bonnes vacances.


L'Institut de recherche sur la création

L'article de l'Impact de mars 1998"Le clonage - Qu'est-ce que c'est et où cela nous mène-t-il ?" a discuté de la procédure de clonage par transfert de cellules somatiques. Dans cette procédure, le noyau d'une cellule dérivée d'un embryon, d'un fœtus ou du tissu d'un adulte est inséré dans un ovule dont le noyau a été retiré. Après le développement de l'ovule au stade approprié, l'embryon est inséré dans l'utérus d'une femelle correctement préparée et laissé se développer jusqu'à terme. Cela produit une progéniture essentiellement génétiquement identique à l'animal qui a fourni le noyau qui a été inséré dans l'œuf. Cet article discutera de la transfert de gènes d'une espèce à une autre afin de doter l'espèce receveuse de propriétés bénéfiques, ou pour permettre au receveur de produire des protéines humaines à injecter à des patients humains dépourvus d'une protéine d'importance vitale.

Production de protéines thérapeutiques par transfert de gènes

Il existe de nombreuses protéines essentielles à une bonne santé que certaines personnes ne peuvent pas produire en raison de défauts génétiques. Ces protéines comprennent divers facteurs de coagulation sanguine provoquant l'hémophilie, l'insuline (entraînant le diabète), l'hormone de croissance (entraînant un manque de croissance appropriée) et d'autres protéines, dont l'administration corrige les conditions pathologiques ou entraîne d'autres avantages thérapeutiques. Les premiers travaux dans ce domaine employaient des bactéries. Certaines bactéries dans une culture bactérienne peuvent contenir de petites molécules d'ADN circulaires appelées plasmides. Ces plasmides ne font pas partie de l'ADN chromosomique que possèdent toutes les bactéries de la culture. Comme ces cellules bactériennes exceptionnelles se reproduisent par fission binaire ou division cellulaire, les plasmides sont transmis aux cellules filles. Ils peuvent également être transmis à d'autres cellules par conjugaison. Les scientifiques ont appris à utiliser des plasmides pour transférer des gènes humains à des cellules bactériennes. Si le gène inséré dans le plasmide de la bactérie est le gène humain de l'insuline par exemple, la bactérie dans laquelle ce gène est inséré produit de l'insuline humaine.

Insertion d'une coupe d'ADN dans un plasmide

Les scientifiques ont identifié et isolé des enzymes (appelées enzymes de restriction ou endonucléases de restriction) dont chacune coupe des gènes à des endroits très spécifiques. Plus de 100 de ces enzymes ont été isolées. Après que la position du gène humain qui code pour la protéine thérapeutique souhaitée a été localisée sur le chromosome, le gène est découpé en utilisant les enzymes de restriction appropriées et le gène est isolé. Les mêmes enzymes de restriction sont utilisées pour découper un morceau du plasmide d'ADN circulaire. Ainsi, les deux extrémités du gène humain seront celles qui se relieront aux extrémités ouvertes du plasmide. Une enzyme appelée ADN ligase est utilisée pour coupler chaque extrémité du gène aux extrémités ouvertes du plasmide, restaurant une molécule d'ADN circulaire avec le gène humain remplaçant le morceau coupé du plasmide. Ces plasmides, incluant désormais le gène humain, sont réinsérés dans des bactéries. Ces bactéries sont cultivées, produisant de grandes quantités de bactéries identiques portant le gène humain qui se reproduit avec l'ADN bactérien. De plus, ces bactéries produisent la protéine humaine codée par le gène humain épissé. La protéine est isolée de la culture bactérienne, purifiée et injectée aux patients souffrant de pathologies car leur corps ne peut pas produire des quantités suffisantes de protéine.

Avant le génie génétique, ces protéines devaient être minutieusement isolées des tissus ou du sang, mais comme elles sont produites en quantités aussi infimes, l'isolement de quantités importantes nécessitait le traitement de grandes quantités de matériel. En conséquence, ils étaient très chers. Des quantités relativement beaucoup plus importantes ont été obtenues à partir de cultures bactériennes génétiquement modifiées, mais le coût, bien que moindre, était encore élevé. Les bioréacteurs (c'est-à-dire la machinerie requise pour cultiver de grandes quantités de bactéries contenant le gène humain) sont extrêmement coûteux et doivent être exploités par plusieurs scientifiques et assistants techniques. De plus, le bon fonctionnement du bioréacteur est sensible aux petits changements de température et de composition du bouillon de culture.

Heureusement, une méthode alternative a été développée qui promet d'être beaucoup moins chère et beaucoup plus efficace. Cette méthode utilise un animal, tel qu'un porc, comme bioréacteur. Il a fallu des années aux scientifiques pour concevoir, développer et construire le bioréacteur très coûteux et difficile à exploiter conçu par l'homme. Dieu avait déjà conçu un bioréacteur beaucoup plus efficace et beaucoup moins cher. Les scientifiques ont finalement réalisé qu'il serait possible, par manipulation génétique, d'inciter une femelle porcine, une vache ou un autre animal à produire les protéines humaines souhaitées dans son lait.

Génie génétique d'une protéine de lait

Cette procédure a maintenant été couronnée de succès chez les porcs et les vaches. Parmi les animaux, le porc présente un certain nombre d'avantages. Sa période de gestation n'est que de quatre mois. À 12 mois, le porc est fertile et produit de grandes portées (généralement 10 à 12 porcelets). Un porc en lactation produit 300 litres (environ 315 pintes) de lait par an. La procédure se déroule comme suit :

  1. Le fragment d'ADN (gène) qui code pour la protéine humaine nécessaire est isolé.
  2. Le fragment d'ADN qui favorise la production de protéines dans les glandes mammaires est isolé et lié ou combiné au gène humain.
  3. Des œufs fécondés provenant d'un porc donneur sont obtenus.
  4. L'ADN humain est injecté dans un ovule dans la région du pronucléus mâle (ADN du sperme avant qu'il ne s'unisse à l'ADN de l'ovule) à l'aide d'une micro pipette très fine. L'ADN humain est ainsi incorporé dans l'ADN nucléaire de porc.
  5. L'œuf est implanté dans l'utérus d'un autre porc et se développe en une femelle porcine nouveau-née.
  6. La protéine désirée est isolée du lait de la truie une fois élevée.

Cette procédure a été menée avec succès par des scientifiques américains et les résultats ont été publiés en 1994. 1 Le gène humain qu'ils ont utilisé code pour la protéine C qui agit pour contrôler la coagulation du sang. Ils ont obtenu un gramme de protéine C de chaque litre de lait produit par le porc. C'est 200 fois la concentration trouvée dans le plasma sanguin humain. Environ un tiers seulement de la protéine C obtenue était biologiquement active. La raison en est que de nombreuses modifications d'une protéine doivent être effectuées dans une cellule après la formation de la chaîne protéique. Par exemple, des sections sont découpées dans le complexe protéique. Des groupes de sucre peuvent être attachés à certains endroits dans la chaîne protéique et des groupes d'ancrage de la paroi cellulaire peuvent être ajoutés. Les scientifiques ont découvert qu'une enzyme de transformation clé, appelée furine, était présente en quantités insuffisantes. Ils ont donc ajouté à leur complexe génétique le gène qui code pour la furine. Cela a augmenté le rendement en protéine C active. Les protéines humaines produites de cette manière doivent être testées pour leur sécurité et leur efficacité. Au moment d'écrire ces lignes, une protéine anticoagulante appelée anti-thrombine est actuellement testée dans des essais cliniques.

La comparaison de cette procédure avec l'utilisation de machines à bioréacteur illustre le fait qu'une génération d'ingénieurs biochimistes n'a pas réussi à égaler les capacités d'un outil de fabrication de protéines (le cochon) que Dieu avait préparé. La glande mammaire est optimisée pour maintenir une densité élevée de cellules afin de leur fournir une quantité suffisante de nutriments et de canaliser les protéines qui sont produites sous une forme qui peut facilement être isolée et purifiée. Cette procédure s'est avérée fructueuse et promet de fournir une méthode pour produire des protéines thérapeutiques précieuses à un coût beaucoup plus bas.


Applications des peptides synthétiques

L'invention de la synthèse peptidique dans les années cinquante et soixante a stimulé le développement de différents domaines d'application dans lesquels les peptides synthétiques sont maintenant utilisés, notamment le développement d'anticorps spécifiques d'épitopes contre les protéines pathogènes, l'étude des fonctions des protéines et l'identification et la caractérisation des protéines. De plus, les peptides synthétiques sont utilisés pour étudier les interactions enzyme-substrat au sein de classes d'enzymes importantes telles que les kinases et les protéases, qui jouent un rôle crucial dans la signalisation cellulaire.

En biologie cellulaire, la liaison au récepteur ou la spécificité de reconnaissance de substrat d'enzymes nouvellement découvertes peuvent souvent être étudiées à l'aide d'ensembles de peptides synthétiques homologues. Les peptides synthétiques peuvent ressembler à des peptides naturels et agir comme des médicaments contre le cancer et d'autres maladies majeures. Enfin, les peptides synthétiques sont utilisés comme étalons et réactifs dans les applications basées sur la spectrométrie de masse (MS). Les peptides synthétiques jouent un rôle central dans la découverte, la caractérisation et la quantification des protéines basées sur la SEP, en particulier celles qui servent de biomarqueurs précoces pour les maladies.

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Résultats et discussion

Ingénierie de la biosynthèse du LPS dans E. coli

Nous avons commencé notre construction sans LPS E. coli K-12 en utilisant la souche KPM22 L11 appauvrie en Kdo [12]. Cette souche contient des délétions de kdsD et gutQ, qui codent pour les isomérases d -arabinose 5-phosphate essentielles à la biosynthèse de Kdo [13,14], et une transition C:G à T:A en position 52 de msbA, qui agit comme un suppresseur du phénotype ∆Kdo normalement mortel [12]. Pour produire une souche qui contient du lipide IVUNE en tant que seul composant de la membrane externe du LPS et qui ne peut pas revenir pour synthétiser des dérivés endotoxiques, nous avons généré séquentiellement des souches mutantes avec des délétions non marquées des gènes lpxL, lpxM, pagP, lpxP et eptA. Ces gènes codent pour des enzymes agissant en aval de l'incorporation de Kdo dans le lipide IVUNE, et font soit partie de la voie constitutive de Kdo2-hexaacyl lipide A biosynthèse (le Kdo2-lipide IVUNE lauroyl-ACP acyltransférase LpxL et le Kdo2-lauroyl-lipide IVUNE myristoyl-ACP acyltransférase LpxM), modifier le lipide A avec des chaînes acyles supplémentaires (le phospholipide:lipide A palmitoyl transférase PagP et le Kdo2-lipide IVUNE palmitoléoyl-ACP acyltransférase LpxP), ou adjoindre de la phosphoéthanolamine (P-EtN) dans certaines conditions (le lipide A P-EtN transférase EptA) [15] (Figure 1). L'analyse du LPS isolé de cette souche, désignée KPM318, en utilisant la spectrométrie de masse à cyclotron ionique à transformation de Fourier (ESI FT-ICR) a révélé un seul pic primaire à 1404,85 u, cohérent avec la structure du tétraacyl-1,4 non modifié -bisphosphate LPS précurseur lipide IVUNE (Figure 2A).

Réactions biosynthétiques ciblées lors de la construction de E. coli souches KPM318 et KPM404. Les acyltransférases tardives LpxL et LpxM de la voie constitutive transfèrent respectivement le laurate et le myristate à Kdo2-lipide IVUNE pour former les unités acyloxyacyles caractéristiques du Kdo hexaacylé2-lipide A. En revanche, LpxP, PagP et EptA sont régulés en réponse à certains stimuli tels que l'incorporation de palmitoléate à la place du laurate par LpxP à basse température de croissance ou la palmitoylation catalysée par PagP du lipide A lors de la translocation des phospholipides vers le feuillet externe de la membrane externe, par exemple, chez les souches défectueuses dans la biosynthèse du LPS. La protéine porteuse acyl-acyl (ACP) sert de donneur d'acyle préféré pour diverses lipides A-acyltransférases.

Chargez les spectres de masse ESI FT-ICR déconvolués en mode ion négatif du lipide IVUNE isolé à partir de mutants dérivés de BW30270. Le lipide IVUNE (masse calculée 1404,854 u) a été extraite de E. coli (K-12) souches KPM318 (UNE) et KPM335 (B). Les nombres de masse donnés se réfèrent aux masses monoisotopiques des molécules neutres. Les pics représentant des molécules avec des variations de longueur de chaîne acyle sont marqués par des astérisques (∆m = 14,02 u). L'ion moléculaire à 1484,82 u en panneau B indique la présence d'une fraction mineure de lipide 1-diphosphate IVUNE. Les structures du lipide IVUNE et 1-diphosphate lipide IVUNE sont montrés comme encarts en panneaux UNE et B, respectivement.

La construction réussie de KPM318 a démontré la viabilité de E. coli contenant uniquement du lipide IVUNE. Cependant, comme d'autres E. coli Les souches K-12 avec des membranes externes partiellement défectueuses telles que la souche prototype ∆Kdo KPM22 [11], KPM318 présentaient des défauts de croissance à des températures supérieures à 40°C. Pour surmonter cela, nous avons isolé une série de dérivés stables et résistants à la température de KPM318 capables de croître de façon exponentielle à 42°C. KPM335 était le plus robuste des mutants spontanés. Le séquençage du génome entier de KPM335 a identifié un seul de novo mutation par rapport à la souche parentale sensible à la température KPM318, une transversion G:C à T:A à la base numéro 181 de la frr gène (Fichier supplémentaire 1 : Tableau S1). Les frr gène code pour un facteur essentiel de recyclage du ribosome qui a été décrit pour jouer plusieurs rôles cellulaires, tels que le désassemblage du complexe post-terminaison [16], la prévention des erreurs de traduction [17], la promotion du couplage traductionnel [18] et l'augmentation de la viabilité cellulaire par stimulation polyamine de la phase stationnaire E. coli culturelle [19]. La dérivation de KPM335 plaide fortement en faveur d'une corrélation directe entre le développement de la frr181 allèle et la capacité de la souche à tolérer le phénotype ∆Kdo à 42°C. Cependant, l'élucidation du mécanisme sous-jacent doit attendre d'autres investigations.

L'analyse ESI FT-ICR du LPS isolé de KPM335 n'a révélé aucun changement significatif dans la composition du LPS, avec le lipide IVUNE restant la molécule prédominante liée au LPS comme dans la souche parente KPM318 (figure 2B). Cependant, contrairement à KPM318, les spectres de KPM335 ont affiché un pic mineur avec une masse moléculaire de 1484,82 u, compatible avec la structure du lipide 1-diphosphate IVUNE. Touzé et ses collaborateurs ont montré précédemment que le transfert d'un second groupement phosphate en position 1 du lipide A est catalysé par LpxT, une protéine membranaire interne de la famille des undécaprényl-pyrophosphate phosphatase, capable de phosphoryler le Kdo2-lipide IVUNE in vitro, mais pas les accepteurs de lipides dépourvus de Kdo [20]. Ainsi, la présence d'un mineur tris-lipide phosphorylé IVUNE fraction dans KPM335 plaide contre une exigence absolue de LpxT pour les accepteurs de lipide A Kdo-glycosylés sous in vivo conditions. On ne sait pas, cependant, pourquoi la phosphorylation du lipide IVUNE, bien qu'avec une efficacité très faible, peut se produire dans KPM335, mais apparemment pas dans sa souche parente KPM318.

Séparé de frr181 mutation dans KPM335, un total de 12 mutations étaient spécifiques à la fois à KPM318 et KPM335, y compris ∆kdsD, ∆gutQ, ∆lpxL, ∆lpxM, ∆pagP, ∆lpxP, ∆eptA et msbA52 comme condition préalable à la synthèse du lipide IVUNE comme composant de membrane externe lié au LPS prédominant. Pour quatre autres mutations, nous pensons qu'elles sont apparues spontanément lors de la génération de souches mutantes, à savoir une mutation silencieuse localisée dans yqiI, deux mutations faux-sens dans gor et waaY, et une mutation ponctuelle dans la région non codante en amont de la délétion eptA gène. Cette dernière mutation est très probablement le résultat de la construction de KPM274 en tant que souche donneuse dueptA::kan cassette. La mutation est localisée dans la séquence de la région d'homologie de l'amorce ECOeptAH1 (Fichier supplémentaire 2 : Tableau S2) et suggère une erreur d'amplification PCR de la cassette de résistance à la kanamycine ciblant le eptA gène et finalement l'intégration dans le génome de KPM318. Par rapport à la séquence de référence du génome du commun E. coli Progéniteur MG1655, les souches BW30270, KPM318 et KPM335 partagent des variations de séquence à six endroits. Parmi ceux-ci, à la fois une substitution nucléotidique silencieuse à la position 114 et une seule insertion nucléotidique à la base numéro 253 de ylbE, et délétion du nucléotide 151 dans le glpR gène ont été décrits récemment comme des variations génétiques en commun E. coli Cultures mères MG1655 [21]. De plus, alors que E. coli Il a été démontré que MG1655 exprime une ribonucléase PH défectueuse en raison d'un décalage du cadre de lecture par délétion du premier nucléotide du codon 223 du pseudogène rph-1 [22], insertion d'un seul nucléotide comme première base du codon 224 de rph-1 prédit la reconstitution de la fonction RNase PH et l'élimination de l'effet polaire de la rph-1 mutation en aval bûcher gène dans BW30270, KPM318 et KPM335.

Ensuite, nous avons décidé de répliquer l'ensemble unique de délétions génomiques non marquées dans le fond génétique du populaire E. coli souche d'expression BL21 (DE3). Comme première étape vers la construction d'un système sans LPS E. coli Dérivé BL21 (DE3), nous avons remplacé le type sauvage msbA gène avec le msbA148 allèle suppresseur de la souche KPM22 L1 [12]. Cela a permis à la souche résultante, MWB03, de tolérer des mutations nulles dans des gènes autrement essentiels de la voie de biosynthèse du LPS. Nous avons ensuite supprimé séquentiellement les mêmes gènes qui avaient été supprimés lors de la création de KPM318. Le séquençage du génome entier de la souche finale, KPM404, a confirmé la présence de la msbA148 mutation suppresseur (Fichier complémentaire 3 : Tableau S3), et vérifié l'absence de la kdsD, gutQ, lpxL, lpxM, pagP, lpxP et eptA gènes. Par rapport à la séquence du génome de E. coli BL21 (DE3), nous avons en outre identifié une mutation silencieuse dans yceJ, trois changements faux-sens dans les séquences codantes de YadG, ECD_00513 et RstA, et une mutation ponctuelle dans la région intergénique entre nudC et hemE. Enfin, un total de cinq substitutions de nucléotides simples ont été comptés dans la région entre les nucléotides 46 et 222 du basR gène en aval de ∆eptA. Ces substitutions correspondaient parfaitement aux sites de basR variations de séquence dans E. coli B et K-12, indiquant qu'environ un tiers du gène codant pour BasR de KPM404 a été remplacé par le basR séquence de E. coli K-12. Tout comme pour la construction du KPM318, le E. coli La souche K-12 KPM274 a servi de donneur pour le transfert dueptA::kan cassette via P1vir transduction pour produire la souche KPM403, ce qui explique bien la génération d'un basR séquence hybride par co-transduction dueptA::kan cassette et adjacent basR séquences. En fait, comme décrit ci-dessus, l'utilisation du KPM274 commeeptA::kan souche donneuse explique également pourquoi KPM404 porte une mutation ponctuelle à la même position en amont de la souche supprimée eptA gène comme dans KPM318.

Les analyses par spectrométrie de masse des profils LPS de mutants établis dans le fond génétique BL21 (DE3) ont souligné la nécessité d'une modification radicale de la biosynthèse du LPS pour accomplir la synthèse du seul lipide IVUNE dans KPM404 (Figures 3 et 4). Alors que la perturbation de la gutQ, kdsD et lpxL gènes dans la souche mutante intermédiaire KPM396 ont entraîné la synthèse de lipide IV non glycosyléUNE précurseurs dépourvus des chaînes secondaires lauroyle et myristoyle, la spectrométrie de masse a révélé un mélange plutôt hétérogène de lipide IV différemment modifiéUNE espèce. Les spectres présentaient quatre pics proéminents avec des masses moléculaires de lipide IVUNE substitué par un groupe P-EtN (1527,86 u), lipide IVUNE modifié avec deux fragments P-EtN (1650,87 u) et lipide palmitoylé IVUNE molécules portant soit un (1766,09 u) soit deux (1889,10 u) résidus P-EtN. Étant donné que la palmitoylation du lipide A semble être une indication d'une réponse adaptative à la translocation aberrante des phospholipides vers le feuillet externe de la membrane externe [23], nous soupçonnons que le transfert médié par PagP du palmitate vers le lipide IVUNE est déclenchée par des perturbations de l'asymétrie lipidique de la membrane externe dans les souches appauvries en Kdo de la série KPM. Comme indiqué pour l'échantillon LPS de KPM400, perte complète du lipide palmitoylé IVUNE fraction a été obtenue par suppression de la pagP gène, laissant le lipide IVUNE les molécules modifiées avec un ou deux groupes P-EtN ne sont pas affectées.

Chargez les spectres de masse ESI FT-ICR déconvolués en mode ion négatif du LPS isolé de mutants dérivés de BL21 (DE3). Les nombres de masse donnés se réfèrent aux masses monoisotopiques des molécules neutres. Les pics représentant des molécules avec des variations de longueur de chaîne acyle sont marqués par des astérisques (∆m = 14,02 u). Les spectres de masse illustrent les progrès dans l'élimination du lipide IVUNE hétérogénéité par délétion séquentielle de gènes codant pour l'ajout de chaînes acyle et P-EtN au précurseur du lipide A.

Structures et masses moléculaires du lipide IVUNE molécules identifiées par spectrométrie de masse ESI FT-ICR dans des mutants KPM dérivés de BL21 (DE3). Les spectres de masse ESI FT-ICR sont illustrés à la figure 3. Modifications du lipide IVUNE avec palmitate (vert) et P-EtN (magenta) sont catalysés par PagP et EptA, respectivement.

En raison du blocage de la biosynthèse de Kdo et du manque de LpxL, Kdo2-lipide IVUNE et Kdo2-(lauroyl)-lipide IVUNE, les substrats préférés pour LpxP et LpxM, respectivement [24-26], ne peuvent pas être synthétisés dans des souches dérivées de KPM396. De plus, des travaux antérieurs ont montré que l'expression de LpxP est induite dans des conditions de choc froid (12°C) pour incorporer une chaîne acyle C16:1 insaturée au détriment d'un laurate (C12:0), reflétant peut-être la demande d'ajustement fluidité membranaire au froid [25,27]. Il n'est donc pas surprenant que la suppression de la lpxP et lpxM les gènes n'ont pas montré d'effet évident sur le lipide IVUNE composition de KPM400 et KPM402, respectivement. Il n'y a pas de données indiquant que LpxP et LpxM sont capables d'utiliser le lipide IVUNE comme substrat accepteur. Il semble cependant tout à fait possible que les deux enzymes présentent de faibles niveaux d'activité dans des conditions spécifiques. Contrairement au rôle physiologique proposé de LpxP dans l'adaptation de E. coli cellules à des températures de croissance basses, l'induction limitée de l'expression de LpxP a été démontrée comme un mécanisme compensatoire potentiel même à 30°C dans lpxL et lpxL lpxM mutants de E. coli W3110 [28]. De même, LpxM a pu transférer une chaîne myristoyle directement à Kdo2-lipide IVUNE dans E. coli Manque de souches W3110 lpxL et lpxL lpxP [28].

Comme PagP et LpxP, la modification EptA-dépendante du lipide A avec P-EtN fait partie du réseau réglementaire complexe associé à la refonte structurelle du LPS lors de l'exposition à des conditions environnementales changeantes ou à des facteurs de stress de l'enveloppe. Comme indiqué pour E. coli K-12, la modification du lipide A avec P-EtN se produit dans certaines conditions telles qu'en réponse à des stimuli externes comme le métavanadate d'ammonium [29] ou un pH acide doux [30]. Bien que P-EtN semble être transféré principalement au groupe 1-phosphate du lipide A [31], des doubles substitutions P-EtN aux positions 1- et 4′-phosphate étaient évidentes dans le lipide A de E. coli K-12 sans activité LpxT [32] et lipide IVUNE d'une souche mutante défectueuse dans la translocation dépendante de MsbA du LPS à travers la membrane interne [12]. Sur la base de l'analyse ESI FT-ICR présentée ici, la suppression du eptA gène était clairement nécessaire et suffisant pour empêcher le lipide IVUNE de KPM404 d'être substitué par un ou deux résidus P-EtN. Ainsi, nos données corroborent non seulement les résultats antérieurs sur la capacité de l'EptA à transférer le P-EtN aux groupes 1- et 4′-phosphate du lipide A [32], mais fournissent également des preuves expérimentales de sa capacité à utiliser le lipide IV.UNE comme substrat pour les modifications P-EtN simples et doubles.

Contrairement au E. coli K-12 souche KPM318, intégration du lipide IVUNE dans la membrane externe de KPM404 n'a pas donné lieu à un phénotype sensible à la température du mutant dérivé de BL21 (DE3) (données non présentées). Bien qu'étroitement liées au niveau génomique [33], l'analyse combinée des génomes, transcriptomes, protéomes et phénomes de E. coli K-12 et BL21 (DE3) ont révélé des différences significatives dans leur physiologie cellulaire et leur métabolisme [34], ce qui peut expliquer les différences dans la capacité de KPM318 et KPM404 à maintenir l'intégrité de la membrane externe en présence de lipide IVUNE à des températures supérieures à 40°C.

Activité biologique de l'ingénierie E. coli cellules et LPS

Pour tester le potentiel endotoxique de l'ingénierie E. coli K-12 et B, nous avons effectué des tests d'activation TLR4/MD-2 en utilisant des cellules HEK-Blue hTLR4. La stimulation de ces cellules, qui expriment les TLR4, MD-2 et CD14 humains à leur surface, induit la production de la phosphatase alcaline embryonnaire sécrétée (SEAP) dépendant de NF-κB- et activator protein-1 (AP-1) rapporteur. Les taux de phosphatase peuvent être déterminés en lisant l'absorbance à 655 nm à l'aide d'un substrat colorimétrique. Afin de répondre à la question de savoir si NF-κB est spécifiquement induit via la voie de signalisation hTLR4/MD-2, les cellules HEK-Blue Null2, la lignée cellulaire parentale des cellules HEK-Blue hTLR4 dépourvues du complexe récepteur hTLR4/MD-2, ont été utilisés comme contrôle dans tous les tests d'activation de hTLR4/MD-2. Les souches KPM318, KPM335 et KPM404 telles qu'elles ont été analysées en défiant les cellules HEK-Blue hTLR4 avec un nombre croissant d'unités formant des colonies (ufc) allant jusqu'à 10 6 ufc/ml étaient pratiquement exemptes d'activité stimulant le hTLR4/MD-2, alors que leur les souches parentales BW30270 et BL21 (DE3) ont provoqué une activation substantielle de hTLR4/MD-2 déjà à 103 cfu/ml (figures 5A, B, 6A et B). Lorsque le LPS extrait des souches a été soumis au dosage spécifique du TLR4, nous avons pu confirmer l'absence d'activité endotoxique des échantillons isolés de KPM318, KPM335 et KPM404 (Figures 5C, D, 6C et D). Les données ont également démontré que la palmitoylation du lipide IVUNE (lorsque PagP a été exprimé) et/ou modification du lipide IVUNE avec un ou deux groupes P-EtN (lorsque EptA a été exprimé) dans KPM396, KPM400 et KPM402 sont capables de conférer une certaine activité stimulatrice de hTLR4/MD-2 sur le précurseur du lipide A tétraacylé autrement inactif sur le plan endotoxique (figure 6). Nos résultats nous permettent de tirer la conclusion majeure que l'inactivation du lipide IV réguléUNE les modifications telles que démontrées ici comme étant présentes dans les souches mutantes intermédiaires à base de BL21 (DE3) sont une condition préalable cruciale pour obtenir systématiquement une absence d'endotoxine E. coli souches.

Courbes dose-réponse de l'induction de NF-κB par des cellules bactériennes entières et du LPS de E. coli souches K-12. Les échantillons ont été testés avec des cellules HEK-Blue hTLR4 pour l'induction de NF-κB médiée par hTLR4/MD-2 par détermination colorimétrique de l'activité SEAP dépendante de NF-κB (UNE et C). Des cellules HEK-Blue Null2, la lignée cellulaire parentale des cellules HEK-Blue hTLR4 dépourvues du complexe récepteur hTLR4/MD-2, ont été utilisées comme contrôle (B et RÉ). Les cellules HEK-Blue hTLR4 et Null2 ont été stimulées avec des dilutions en série dix fois de cellules bactériennes entières (UNE et B) et extraits de LPS (C et RÉ) de KPM318 et KPM335 par rapport à leur souche parentale BW30270, respectivement. Les valeurs représentent les moyennes et les écarts types de trois expériences individuelles. Dans toutes les expériences, les échantillons analysés ont montré une faible stimulation des cellules HEK-Blue Null2, indiquant que l'expression SEAP dépendante de NF-κB était spécifiquement induite via la voie de signalisation hTLR4/MD-2 dans les cellules HEK-Blue hTLR4.

Courbes dose-réponse de l'induction de NF-κB par des cellules bactériennes entières et du LPS de E. coli souches BL21 (DE3). Les échantillons ont été dosés avec HEK-Blue hTLR4 (UNE et C) et Null2 (B et RÉ) cellules pour l'induction relative de NF-κB par détermination colorimétrique de l'activité SEAP dépendante de NF-κB. L'induction relative de NF-κB a été mesurée après stimulation des cellules HEK-Blue hTLR4 et Null2 avec des dilutions en série de dix fois des cellules bactériennes entières (UNE et B) et extraits de LPS (C et RÉ) de E. coli Mutants KPM dérivés de BL21 (DE3) et BL21 (DE3), respectivement. Les valeurs représentent les moyennes et les écarts types de trois expériences individuelles. Dans toutes les expériences, les échantillons analysés présentaient une activation négligeable des cellules parentales HEK-Blue Null2, suggérant une induction spécifique de l'expression SEAP dépendante de NF-κB via la voie de signalisation hTLR4/MD-2 dans les cellules HEK-Blue hTLR4.

En tant que l'un des médiateurs critiques induits en réponse à l'endotoxine, nous avons testé la libération de TNF-α lors de la stimulation des macrophages humains par le lipide IV.UNE échantillons de KPM318, KPM335 et KPM404. Les échantillons présentaient une activité biologique très faible comme le démontre leur faible capacité à provoquer la production de TNF-α dans les macrophages humains même à des concentrations de 0,1 à 1 g/ml (figure 7A). Par rapport au LPS des souches parentales, qui induisait une libération maximale de TNF-α à 0,01 g/ml, l'induction de TNF-α était réduite d'environ 80 à 95 %, même à des niveaux 100 fois plus élevés d'extraits mutants. La capacité bien documentée du lipide IVUNE agir comme un antagoniste de la voie de signalisation hTLR4/MD-2 [35,36] nous a incités à examiner l'inhibition de l'activité agoniste du LPS de forme S de Salmonella enterica sous-espèce enterique sérovar Abortusequi (S. Abortusequi) par lipide IVUNE échantillons de KPM318, KPM335 et KPM404. Comme le montre la figure 7B, pré-exposition des macrophages à 0,1 g/ml et 1 g/ml du lipide IVUNE les extraits ont entraîné une inhibition de 72,0 ± 11,2 % et 75,9 ± 2,0 % (pourcentage moyen d'inhibition ± ET) de la production de TNF-α induite par le LPS de S. Abortusequi, respectivement. Ainsi, le lipide IVUNE de KPM318, KPM335 et KPM404 présentaient une puissante activité antagoniste contre le LPS de type sauvage biologiquement actif.

Activité biologique du LPS de mutants KPM dans les macrophages humains. Les macrophages ont été différenciés des monocytes sanguins humains de donneurs sains. Au septième jour de la différenciation, les macrophages ont été ensemencés à 1 × 10 5 cellules/puits et stimulés avec du LPS aux quantités indiquées (LPS de S. Abortusequi, BW30270 et BL21 (DE3) à 0,01 g/ml LPS des souches KPM318, KPM335 et KPM404 à 0,1 g/ml et 1 g/ml, respectivement) pendant 4 h à 37°C (UNE). Pour déterminer l'activité antagoniste du LPS des souches KPM, des macrophages ont été incubés avec des échantillons de LPS de KPM318, KPM335 ou KPM404 à 0,1 µg/ml ou 1 µg/ml pendant 30 min à 37°C, suivi d'une stimulation des cellules avec 0,01 µg /ml de LPS de S. Abortusequi pendant 4 h (B). Les surnageants acellulaires ont été analysés pour la teneur en TNF-α par ELISA. Les valeurs représentent les moyennes et les écarts types de trois expériences indépendantes utilisant des cellules de différents donneurs.

Expression sans endotoxine d'ApoA-1 et Hsp70

Des études antérieures ont montré qu'un BL21 (DE3) ∆lpxM::chat un mutant synthétisant un LPS non myristoylé peut être utilisé pour exprimer des protéines hétérologues avec une activité stimulatrice réduite dans des cellules humaines sensibles au LPS [37]. Pour tester la capacité de KPM318, KPM335 et KPM404 à servir d'hôtes pour la production de protéines recombinantes sans endotoxine, nous avons sélectionné les protéines humaines exprimées de manière hétérologue ApoA-1 et Hsp70 comme systèmes modèles. L'ApoA-1, un composant majeur des lipoprotéines de haute densité et un médiateur important dans le maintien de l'homéostasie du cholestérol [38], est particulièrement difficile car la protéine de 28 kDa est connue pour être directement impliquée dans la neutralisation de la toxicité du LPS et, par conséquent, difficile à séparer de l'activité endotoxique [39,40]. Encore une autre protéine difficile capable de s'associer au LPS est Hsp70 [41]. De plus, il a été suggéré que le chaperon moléculaire de 70 kDa fonctionne comme une protéine de motif moléculaire endogène associée aux dommages pour l'activation de la voie de signalisation TLR4 lors d'une lésion tissulaire [42]. Comme la stimulation induite par la Hsp70 des cellules du système immunitaire inné ressemble à bien des égards aux effets du LPS, l'élimination de la contamination par les endotoxines, fréquemment présente dans les préparations de Hsp recombinante [43], reste un problème clé pour discriminer entre les effets induits par LPS et Hsp.

Pour la production d'ApoA-1, nous avons utilisé le plasmide pApo404 basé sur le promoteur T5 dans E. coli souches BW30270, KPM318 et KPM335, tandis que Hsp70 a été exprimée à partir de pHsp70His sous le contrôle d'un promoteur T7 dans BL21 (DE3) et KPM404. L'analyse SDS-PAGE des échantillons de protéines après purification minimale de chaque extrait de protéine soluble, par chromatographie d'affinité sur métal immobilisé (IMAC), a révélé que les souches sans endotoxine KPM318/pApo404, KPM335/pApo404 et KPM404/pHsp70His produisaient une ApoA-1 et Hsp70 en quantités approximativement égales et avait des profils d'impuretés similaires à ceux de leurs souches parentales, respectivement (Figure 8). Comme l'ApoA-1 a été décrite comme s'associant également aux protéines de la cellule hôte [44], il n'était pas surprenant de détecter des niveaux relativement élevés de contaminants protéiques dans les échantillons d'ApoA-1 purifiés par IMAC. Quoi qu'il en soit, nous n'avons effectué aucune autre étape de purification des protéines ou d'élimination des endotoxines pour étudier l'activité biologique des échantillons d'ApoA-1 et de Hsp70.

Gels SDS-PAGE d'ApoA-1 et Hsp70. Les protéines ont été exprimées dans des dérivés sans endotoxine de E. coli souches BW30270 (UNE) et BL21 (DE3) (B), respectivement, et minimalement purifié en utilisant IMAC sur des colonnes HisTrap HP (1 ml). Les échantillons recombinants d'ApoA-1 et de Hsp70 (6 g chacun) ont été résolus dans des conditions dénaturantes en utilisant des gels de polyacrylamide à 12 % et 10 %, respectivement. Des marqueurs de protéines de masse moléculaire (kDa) ont été passés dans les pistes M. Les flèches indiquent les positions d'ApoA-1 et Hsp70.

Le premier test d'activité biologique utilisé a été le Limulus test de lysat d'amibocytes (LAL), une méthode approuvée par la FDA qui est basée sur l'activation d'une cascade de coagulation dans le LAL par des traces d'endotoxine [45]. Dans cet essai, les équivalents d'unité d'endotoxine déterminés dans les échantillons d'ApoA-1 de KPM318/pApo404 et KPM335/pApo404 ont été significativement réduits de 92,7 ± 1,3 % et 82,2 ± 3,9 % (pourcentage moyen d'inhibition ± ET) par rapport à ceux trouvés dans l'ApoA- 1 échantillon de BW30270/pApo404, respectivement (Figure 9). De plus, lorsque KPM404/pHsp70His a été utilisé comme hôte pour la production de Hsp70, la réponse LAL à la protéine a diminué de 97,2 ± 0,5 % par rapport à la réponse induite par Hsp70 obtenue à partir de BL21 (DE3)/pHsp70His. Le test LAL, bien que largement utilisé pour la détection et la quantification des endotoxines, est une méthode inappropriée pour faire la distinction entre le LPS hexaacylé endotoxiquement actif et le lipide tétraacylé endotoxiquement inactif IVUNE en raison de la présence du squelette 4′-monophosphoryl-diglucosamine activant LAL dans les deux structures lipidiques [46,47]. En tant que telle, la cascade de coagulation LAL est activée par un spectre plus large de variants LPS/lipide A que les cellules sensibles au LPS du système immunitaire humain. La réactivité LAL résiduelle des protéines du lipide IVUNE souches hôtes reflète très probablement la nature non spécifique du test, donnant lieu à des résultats endotoxiques faussement positifs.

Réactivité de l'ApoA-1 et de la Hsp70 dans le Limulus dosage du lysat d'amibocytes (LAL). ApoA-1 a été produit en E. coli souche BW30270/pApo404 et ses dérivés sans endotoxine KPM318/pApo404 et KPM335/pApo404, tandis que Hsp70 a été obtenu à partir de KPM404/pHsp70His et de sa souche parentale BL21 (DE3)/pHsp70His. Les protéines ont été minimalement purifiées par IMAC et dosées avec le test LAL. Les mesures représentent les moyennes et les écarts types de trois expériences individuelles.

Afin de traiter spécifiquement l'activité endotoxique des échantillons ApoA-1 et Hsp70, nous avons utilisé le test d'activation cellulaire HEK-Blue hTLR4/MD-2. Les échantillons ApoA-1 et Hsp70 dérivés des souches sans endotoxine n'ont pas déclenché de réponse endotoxique dans les cellules HEK-Blue hTLR4, même lorsqu'elles étaient présentes dans le test à 10 g/ml, alors que les protéines produites dans les souches parentales ont montré une NF substantielle. -Activation de κB déjà à des concentrations comprises entre 0,1 g/ml et 1 g/ml (Figure 10). Ces résultats étaient en excellent accord avec l'incapacité des cellules KPM318, KPM335 et KPM404 et du LPS à stimuler la voie de signalisation hTLR4/MD-2 (Figures 5 et 6).

Stimulation de hTLR4/MD-2 par ApoA-1 et Hsp70 produites sans endotoxine E. coli souches. Les protéines ont été minimalement purifiées par IMAC et testées avec des cellules HEK-Blue hTLR4 pour leur capacité à activer l'expression SEAP dépendante de NF-κB (UNE et C). Les cellules HEK-Blue Null2 ont servi de contrôle (B et RÉ). L'induction relative de NF-κB a été mesurée après stimulation des cellules HEK-Blue hTLR4 et Null2 avec des dilutions en série de dix fois d'ApoA-1 (UNE et B) et Hsp70 (C et RÉ) échantillons obtenus par expression hétérologue dans BW30270/pApo404, KPM318/pApo404 et KPM335/pApo404, et BL21 (DE3)/pHsp70His et KPM404/pHsp70His, respectivement. Les valeurs représentent les moyennes et les écarts types de trois expériences individuelles. Dans toutes les expériences, les échantillons ApoA-1 et Hsp70 n'ont pas activé l'expression SEAP dépendante de NF-κB dans les cellules HEK-Blue Null2, suggérant que l'expression SEAP dépendante de NF-κB était due à une activation spécifique de la signalisation hTLR4/MD-2 voie dans les cellules HEK-Blue hTLR4.

Comme illustré ici par l'expression hétérologue d'ApoA-1 et de Hsp70, des protéines préparées à partir de E. coli les souches sont naturellement exemptes d'activité endotoxique dans les cellules humaines sensibles au LPS, ce qui est cohérent avec les observations antérieures selon lesquelles KPM335 est également un hôte approprié pour la production de corps d'inclusion fonctionnels sans endotoxine de la protéine de fusion fluorescente sujette à l'agrégation VP1GFP [48]. Cependant, il faut tenir compte du fait que le lipide IVUNE peut agir de manière agonistique chez d'autres hôtes mammifères tels que les cellules de souris [49], de hamster chinois [50] ou d'équidé [36], ce qui reflète le lipide IV spécifique à l'espèceUNE détection par le complexe TLR4/MD-2 [51,52]. L'application de protéines dans des cellules autres que les cellules humaines peut donc également nécessiter des lipides IVUNE épuisement. En raison du manque de spécificité, le test LAL ne peut pas être utilisé pour évaluer l'activité endotoxique mais est idéalement adapté pour détecter les lipides résiduels IVUNE dans des protéines recombinantes préparées à partir de LPS E. coli souches. Nous sommes conscients que nous ne pouvons actuellement pas répondre à la question de savoir si une purification supplémentaire d'ApoA1 et de Hsp70 entraînerait une perte complète de lipide IV.UNE. Cependant, nos données sur les réactivités LAL significativement réduites des protéines ApoA1 et Hsp70 minimalement purifiées provenant de bactéries sans endotoxines donnent des raisons de supposer que le lipide IVUNE, étant homogène, est beaucoup plus facile à éliminer des produits en aval que les LPS matures. Malgré une structure de squelette commune, le LPS est synthétisé sous la forme d'un mélange hétérogène de molécules structurellement apparentées qui sont décorées avec divers substituants, généralement présents en quantités non stoechiométriques [53]. Ces substitutions, qui peuvent varier considérablement en fonction des conditions de croissance, contribuent à une hétérogénéité physico-chimique considérable des molécules de LPS, posant un défi majeur au développement d'une méthode généralement applicable pour l'élimination des endotoxines des protéines produites en commun. E. coli souches d'expression [5].


Stabilité de l'ARN et microARN

En plus des RBP qui se lient à et contrôlent (augmentent ou diminuent) la stabilité de l'ARN, d'autres éléments appelés microARN peuvent se lier à la molécule d'ARN. Ces microARN, ou miARN, sont de courtes molécules d'ARN qui ne mesurent que 21 à 24 nucléotides. Les miARN sont fabriqués dans le noyau sous forme de pré-miARN plus longs. Ces pré-miARN sont découpés en miARN matures par une protéine appelée dés. Comme les facteurs de transcription et les RBP, les miARN matures reconnaissent une séquence spécifique et se lient à l'ARN. Cependant, les miARN s'associent également à un complexe ribonucléoprotéique appelé le Complexe de silençage induit par l'ARN (RISC). RISC se lie avec le miARN pour dégrader l'ARNm cible. Ensemble, les miARN et le complexe RISC détruisent rapidement la molécule d'ARN.

Questions pratiques

Parmi les éléments suivants, lesquels sont impliqués dans le contrôle post-transcriptionnel ?

  1. contrôle de l'épissage de l'ARN
  2. contrôle de la navette ARN
  3. contrôle de la stabilité de l'ARN
  4. Tout ce qui précède

La liaison d'une protéine de liaison à l'ARN ________ la stabilité de la molécule d'ARN.

  1. augmenter
  2. diminuer
  3. ni augmenter ni diminuer
  4. augmenter ou diminuer

Décrire comment les RBP peuvent empêcher les miARN de dégrader une molécule d'ARN.

Comment les stimuli externes peuvent-ils altérer le contrôle post-transcriptionnel de l'expression des gènes ?

En résumé : Régulation des gènes épigénétiques eucaryotes

Dans les cellules eucaryotes, la première étape du contrôle de l'expression génique se produit au niveau épigénétique. Les mécanismes épigénétiques contrôlent l'accès à la région chromosomique pour permettre aux gènes d'être activés ou désactivés. Ces mécanismes contrôlent la façon dont l'ADN est emballé dans le noyau en régulant la manière dont l'ADN est enroulé autour des protéines histones. L'ajout ou la suppression de modifications chimiques (ou d'indicateurs) aux protéines histones ou aux signaux d'ADN envoyés à la cellule pour ouvrir ou fermer une région chromosomique. Par conséquent, les cellules eucaryotes peuvent contrôler si un gène est exprimé en contrôlant l'accessibilité aux facteurs de transcription et la liaison de l'ARN polymérase pour initier la transcription.

Pour démarrer la transcription, les facteurs de transcription généraux, tels que TFIID, TFIIH et autres, doivent d'abord se lier à la boîte TATA et recruter l'ARN polymérase à cet emplacement. La liaison de facteurs de transcription régulateurs supplémentaires à cis-les éléments agissants augmenteront ou empêcheront la transcription. En plus des séquences promotrices, les régions amplificatrices aident à augmenter la transcription. Les amplificateurs peuvent être en amont, en aval, dans un gène lui-même ou sur d'autres chromosomes. Les facteurs de transcription se lient aux régions amplificatrices pour augmenter ou empêcher la transcription.

Le contrôle post-transcriptionnel peut se produire à n'importe quel stade après la transcription, y compris l'épissage de l'ARN, la navette nucléaire et la stabilité de l'ARN. Une fois l'ARN transcrit, il doit être traité pour créer un ARN mature prêt à être traduit. Cela implique l'élimination des introns qui ne codent pas pour les protéines. Les spliceosomes se lient aux signaux qui marquent la frontière exon/intron pour éliminer les introns et ligaturer les exons ensemble. Une fois que cela se produit, l'ARN est mature et peut être traduit. L'ARN est créé et épissé dans le noyau, mais doit être transporté vers le cytoplasme pour être traduit. L'ARN est transporté vers le cytoplasme à travers le complexe de pores nucléaires. Une fois que l'ARN est dans le cytoplasme, la durée pendant laquelle il y réside avant d'être dégradé, appelée stabilité de l'ARN, peut également être modifiée pour contrôler la quantité globale de protéine synthétisée. La stabilité de l'ARN peut être augmentée, conduisant à un temps de résidence plus long dans le cytoplasme, ou diminuée, conduisant à un temps plus court et à une synthèse protéique moindre. La stabilité de l'ARN est contrôlée par les protéines de liaison à l'ARN (RPB) et les microARN (miARN). Ces RPB et miARN se lient à l'UTR 5' ou à l'UTR 3' de l'ARN pour augmenter ou diminuer la stabilité de l'ARN. Selon la RBP, la stabilité peut être augmentée ou diminuée de manière significative, cependant, les miARN diminuent toujours la stabilité et favorisent la décroissance.


Protocole général de transfection

Préparation des cellules pour la transfection

Éliminer les cellules adhérentes à l'aide de trypsine

La trypsination des cellules avant la sous-culture ou le comptage cellulaire est une technique importante pour une culture cellulaire réussie. La technique suivante fonctionne toujours bien lors du passage des cellules.

Matériaux nécessaires:

  • Solution 1X trypsine-EDTA
  • 1X PBS ou 1X HBSS
  • cellules adhérentes à repiqué
  • milieu de croissance approprié (par exemple, DMEM) avec du sérum ou des facteurs de croissance ou les deux ajoutés
  • boîtes de culture, flacons ou plaques multipuits, au besoin
  • hémocytomètre
  1. Préparer une solution stérile de trypsine-EDTA dans une solution de sel sans calcium et magnésium telle que 1X PBS ou 1X HBSS. La solution 1X peut être congelée et décongelée pour une utilisation future, mais l'activité de la trypsine diminuera à chaque cycle de congélation-décongélation. La solution de trypsine-EDTA peut être conservée jusqu'à 1 mois à 4°C.
  2. Retirer le milieu de la boîte de culture tissulaire. Ajouter suffisamment de PBS ou de HBSS pour couvrir la monocouche cellulaire : 2 ml pour un flacon de 150 mm, 1 ml pour une plaque de 100 mm. Secouez les plaques pour répartir la solution uniformément. Retirer et répéter le lavage. Retirez le dernier lavage. Ajouter suffisamment de solution de trypsine pour couvrir la monocouche cellulaire.
  3. Placer les plaques dans un incubateur à 37°C jusqu'à ce que les cellules commencent juste à se détacher (généralement 1 à 2 minutes).
  4. Retirer le flacon de l'incubateur. Frappez le fond et les côtés du récipient de culture fortement avec la paume de votre main pour aider à déloger les cellules adhérentes restantes. Observez les cellules au microscope pour vérifier si toutes les cellules se sont détachées de la surface de croissance. Si nécessaire, les cellules peuvent être remises dans l'incubateur pendant 1&ndash2 minutes supplémentaires.
  5. Lorsque toutes les cellules se sont détachées, ajoutez du milieu contenant du sérum aux cellules pour inactiver la trypsine. Pipeter doucement les cellules pour briser les amas cellulaires. Les cellules peuvent être comptées à l'aide d'un hémocytomètre, distribuées dans des plaques fraîches pour la sous-culture, ou les deux.

En règle générale, les cellules sont repiquées pour se préparer à la transfection le lendemain. La sous-culture doit amener les cellules d'intérêt à la confluence souhaitée pour la transfection. En règle générale, plaquez 5 × 10⁴ cellules par puits dans une plaque à 24 puits ou 5,5 &fois 10⁵ cellules pour une boîte de culture de 60 mm pour

80% de confluence le jour de la transfection. Changer les numéros de cellules proportionnellement pour différentes plaques de taille (voir le tableau 3).

Tableau 3. Superficie des plaques de culture pour la croissance cellulaire.

Taille de la plaque Zone de croissance a (cm²) Aire relative b
24 puits 1.88 1 FOIS
96 puits 0.32 0.2X
12 puits 3.83 2X
6-puits 9.4 5X
35 mm 8.0 4.2X
60mm 21 11X
100 mm 55 29X

a Cette information a été calculée pour les boîtes de culture Corning®.
b L'aire relative est exprimée en tant que facteur de l'aire de croissance totale de la plaque à 24 puits recommandée pour les études d'optimisation. Pour déterminer la densité de placage appropriée, multipliez 5 × 10⁴ cellules par ce facteur.

Préparation de l'ADN pour la transfection

Un ADN de haute qualité exempt de nucléases, d'ARN et de produits chimiques est aussi important pour une transfection réussie que le réactif de transfection choisi. Voir le chapitre du Guide des protocoles et applications sur la purification de l'ADN pour plus d'informations sur la purification de l'ADN de qualité transfection.

Exemple de protocole utilisant le réactif ViaFect&trade

Nous vous recommandons fortement d'optimiser les conditions de transfection pour chaque lignée cellulaire. Si vous avez optimisé les paramètres de transfection, utilisez les conditions déterminées empiriquement pour vos transfections expérimentales.

Si vous choisissez de ne pas optimiser les paramètres de transfection, utilisez les conditions générales recommandées ci-dessous.

Matériaux nécessaires:

  • milieu de culture cellulaire avec du sérum approprié pour le type cellulaire à transfecter
  • milieu de culture cellulaire sans sérum pour la formation de complexes (comme le milieu à sérum réduit Opti-MEM® I)
  • 96 puits ou autres plaques de culture
  • Plaques de dilution à fond en U ou en V ou tubes de microcentrifugation

Le volume total de complexe de transfection (milieu, ADN et réactif de transfection ViaFect&trade) à ajouter par puits d'une plaque à 96 puits est de 5&ndash10&mul. Le protocole suivant est un guide pour la transfection d'environ 10&ndash20 puits, selon le volume de ViaFect&trade Transfection Reagent:DNA mélange utilisé. Pour les puits supplémentaires, ajustez les volumes en conséquence.

  1. Dans un tube stérile ou une plaque à fond en U ou en V, ajouter 90&ndash99&mul de milieu sans sérum préchauffé à température ambiante de sorte que le volume final après avoir ajouté l'ADN soit de 100&mul. Ajouter 1 & tasse d'ADN plasmidique au milieu et mélanger. Pour un ratio de réactif de transfection ViaFect&trade de 3:1 : ADN, ajoutez 3&mul de réactif de transfection ViaFect&trade et mélangez immédiatement.
  2. Incuber le mélange réactif de transfection ViaFect&trade:ADN pendant 5 à 20 minutes à température ambiante.
    Optionnel: Ajouter le mélange aux cellules sans période d'incubation.
    Noter: Des incubations plus longues peuvent nuire aux transfections.
  3. Ajouter 5&ndash10&mul du mélange réactif de transfection ViaFect&trade:ADN par puits dans une plaque à 96 puits contenant 100&mul de cellules dans un milieu de croissance. Nous suggérons 10&mul de mélange comme point de départ. Mélanger doucement par pipetage ou à l'aide d'un agitateur de plaque pendant 10 à 30 secondes. Remettre les cellules dans l'incubateur pendant 24 et 48 heures.
    Noter: Le volume total du milieu de croissance peut varier en fonction du format du puits et des pratiques courantes de votre laboratoire.
  4. Mesurer l'efficacité de la transfection à l'aide d'un test approprié pour le gène rapporteur. Pour la transfection transitoire, les cellules sont généralement dosées 24 à 48 heures après la transfection.

Optimiser la transfection avec les réactifs lipidiques

Dans les sections précédentes, nous avons discuté des facteurs qui influencent le succès de la transfection. Nous présentons ici une méthode pour optimiser la transfection d'une lignée cellulaire particulière avec un seul réactif de transfection. Pour les réactifs à base de lipides plus modernes tels que le réactif de transfection ViaFect&trade, nous recommandons de tester initialement 50&ndash100ng d'ADN par puits d'une plaque à 96 puits à des ratios réactif:ADN de 3:1 ou 4:1 pour les lignées cellulaires adhérentes ou 2:1 pour les lignées cellulaires en suspension. La figure 4 présente une matrice d'optimisation typique. Lors de la préparation du complexe réactif de transfection ViaFect&trade:ADN, le temps d'incubation peut nécessiter une optimisation, nous recommandons 5 à 20 minutes.

Figure 4. Optimisation de la transfection à l'aide du réactif de transfection ViaFect&trade. Les cellules TF-1 ont été ensemencées dans des milieux de croissance sans antibiotiques à 30 000 cellules par puits dans une plaque d'essai blanche à 96 puits et transfectées avec un CMV-luc2 plasmide utilisant divers rapports lipide (ViaFect&trade Transfection Reagent):ADN. La concentration d'ADN a été maintenue constante à 1 µg pour 100 µmul de milieu à sérum réduit Opti-MEM®, et la quantité de réactif de transfection ViaFect® a été modifiée pour obtenir les rapports indiqués. Soit 5 ou 10 pi de complexe de transfection ont ensuite été ajoutés aux cellules dans la plaque à 96 puits. Vingt-quatre heures après la transfection, le dosage ONE-Glo&trade + Tox Luciferase a été réalisé. Notez que 0:1 est le contrôle négatif avec de l'ADN mais pas de lipide. Ces résultats montrent que, pour cette lignée cellulaire particulière, un rapport 2:1 ViaFect&trade Transfection Reagent:DNA a donné des résultats optimaux.

Pour les réactifs lipidiques cationiques traditionnels, nous recommandons de tester différentes quantités d'ADN transfecté (0,25, 0,5, 0,75 et 1 µg par puits dans une plaque à 24 puits) à deux rapports de charge du réactif lipidique à l'ADN (2:1 et 4:1 voir Figure 5). Cette brève optimisation peut être effectuée en utilisant un intervalle de transfection de 1 heure dans des conditions sans sérum. Une plaque de culture à 24 puits par réactif est nécessaire pour la brève optimisation avec des cellules adhérentes (trois répétitions par quantité d'ADN).

Figure 5. Format de placage suggéré pour l'optimisation initiale des conditions de transfection des lipides cationiques.

Une optimisation plus approfondie peut être effectuée pour cribler des rapports de charge supplémentaires, des points de temps et des effets du milieu contenant du sérum aux quantités d'ADN jugées optimales lors des études d'optimisation initiales. Une heure ou deux heures pour l'intervalle de transfection est optimal pour de nombreuses lignées cellulaires. Dans certains cas, cependant, il peut être nécessaire de tester les rapports de charge et les intervalles de transfection en dehors de ces plages pour obtenir un transfert de gène optimal.

Certaines méthodes de transfection nécessitent l'élimination du milieu avec le réactif après l'incubation, d'autres non. Lisez la documentation technique accompagnant le réactif de transfection sélectionné pour savoir quelle méthode est appropriée pour votre système. Cependant, s'il y a une mort cellulaire excessive pendant la transfection, envisagez de réduire le temps d'exposition au réactif de transfection, de diminuer les quantités d'ADN et de réactif ajoutées aux cellules, d'étaler des cellules supplémentaires et de retirer le réactif après la période d'incubation et d'ajouter un milieu complet.

Tests de point final

De nombreux tests d'expression transitoire utilisent des tests rapporteurs lytiques tels que le système de test Dual-Luciferase® (Cat. # E1910) et le Bright-Glo&trade Assay System (Cat. # E2610) 24 heures après la transfection. Le système de dosage Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay (Cat.# N1610) permet une détection en quelques heures seulement après la transfection. Cependant, le délai pour la plupart des tests peut varier (24 à 72 heures après la transfection), en fonction des niveaux d'expression des protéines. Les dosages de la protéine rapporteur utilisent des méthodes colorimétriques, radioactives ou luminescentes pour mesurer l'activité enzymatique présente dans un lysat cellulaire. Certains dosages (par exemple, le système de dosage de la luciférase) nécessitent que les cellules soient lysées dans un tampon après avoir retiré le milieu, puis mélangées avec un réactif de dosage séparé pour déterminer l'activité de la luciférase. D'autres sont des dosages homogènes (par exemple, Bright-Glo&trade Assay System) qui incluent le réactif de lyse et le réactif de dosage dans la même solution et peuvent être ajoutés directement aux cellules dans le milieu. Examinez les résultats du test du rapporteur et déterminez où la plus grande expression (lecture la plus élevée) s'est produite. Ce sont les conditions à utiliser avec vos constructions d'intérêt.

Les méthodes de détection alternatives incluent la coloration histochimique des cellules (détermination du pourcentage de cellules colorées en présence du substrat du gène rapporteur Figure 6), la microscopie à fluorescence (Figure 7) ou le tri des cellules si vous utilisez un rapporteur fluorescent comme la protéine fluorescente Monster Green® phMGFP Vecteur (Cat. # E6421).

Figure 6. Coloration histochimique des cellules RAW 264.7 pour Activité &bêta-galactosidase. Des cellules RAW 264.7 ont été transfectées en utilisant 0,1 & microg d'ADN par puits et un rapport de 3:1 de FuGENE & reg HD à l'ADN. Des complexes ont été formés pendant 5 minutes avant d'appliquer 5 microlitres du mélange complexe à 50 000 cellules/puits dans une plaque à 96 puits. Vingt-quatre heures après la transfection, les cellules ont été colorées pour l'activité &-galactosidase en utilisant X-gal. Données gracieusement fournies par Fugent, LLC.

Figure 7. Microscopie à fluorescence des cellules transfectées avec le réactif de transfection ViaFect&trade. Les cellules de tissus humains iCell® dans des plaques à 96 puits ont été transfectées avec le réactif de transfection ViaFect&trade et un plasmide rapporteur GFP au rapport réactif:ADN spécifié et l'expression de la GFP a été imagée après transfection. Panneau A. iCell® Hépatocytes avec un ratio réactif:ADN de 6:1 imagés un jour après la transfection. Panneau B. Cardiomyocytes iCell® avec un ratio réactif:ADN de 2:1 imagé un jour après la transfection. Panneau C. iCell® DopaNeurons avec un ratio réactif:ADN de 4: 1 imagé trois jours après la transfection. Données avec l'aimable autorisation de Cellular Dynamics International.

Dosages en temps réel

Pour certains types d'expériences de transfection, en particulier celles qui examinent les changements dans les niveaux d'expression génique associés aux mécanismes pathologiques, la surveillance de l'activité du rapporteur dans les cellules vivantes est souhaitable. De tels tests en temps réel peuvent fournir des informations précieuses sur l'expression de plusieurs gènes de manière dynamique. Les options de détection de cellules vivantes Nano-Glo® (Cat.# N2011) sont conçues pour détecter la luminescence NanoLuc® à partir de cellules vivantes à l'aide de protocoles non lytiques. Ces tests surveillent la luminescence à un moment unique ou en continu jusqu'à 72 heures sans compromettre la viabilité cellulaire.


La signalisation dans les cellules peut se produire par le biais d'interactions protéine-protéine. Chen et al. décrire la conception de portes logiques qui peuvent réguler l'association de protéines. Les portes ont été construites à partir de petites protéines conçues qui ont toutes une structure similaire mais où un module peut être conçu pour interagir spécifiquement avec un autre module. L'utilisation de monomères et de monomères connectés de manière covalente comme entrées et la spécificité de codage via des réseaux de liaisons hydrogène conçus ont permis la construction de portes à deux ou trois entrées basées sur une liaison compétitive. Les éléments de contrôle modulaires ont été utilisés pour réguler l'association d'éléments de machinerie de transcription et d'enzymes fractionnées in vitro et dans des cellules de levure.

La conception d'une logique protéique modulaire pour réguler la fonction des protéines au niveau post-transcriptionnel est un défi pour la biologie synthétique. Ici, nous décrivons la conception de portes AND, OR, NAND, NOR, XNOR et NOT à deux entrées construites à partir de protéines conçues de novo. Ces portes régulent l'association d'unités protéiques arbitraires allant des enzymes fractionnées à la machinerie transcriptionnelle in vitro, dans la levure et dans les cellules T humaines primaires, où elles contrôlent l'expression de la TIM3 gène lié à l'épuisement des cellules T. La coopérativité d'interaction de liaison conçue, confirmée par la spectrométrie de masse native, rend les portes largement insensibles aux déséquilibres stoechiométriques dans les entrées, et la modularité de l'approche permet une extension facile aux portes à trois entrées OU, ET et de forme normale disjonctive. La modularité et la coopérativité des éléments de contrôle, associées à la capacité de concevoir de novo un nombre essentiellement illimité de composants protéiques, devraient permettre la conception d'une logique de contrôle post-traductionnelle sophistiquée sur un large éventail de fonctions biologiques.

Les interactions protéine-protéine sont omniprésentes dans la prise de décision cellulaire et leur contrôle sera de plus en plus important en biologie synthétique (14). Bien que les interactions protéiques soient au cœur des circuits biologiques naturels, les efforts pour créer de nouveaux circuits logiques se sont concentrés sur le contrôle au niveau de l'ADN (5, 6), transcription (718), ou ARN (13, 1922). Récemment, des circuits à base de protéines ont été générés en recâblant des voies de signalisation natives (2328), rassemblant des protéines avec des bobines enroulées (29), ou en créant des cascades de protéases (30, 31) cependant, ces circuits ont été construits à partir d'un nombre limité de blocs de construction, ce qui entrave leur évolutivité. La capacité de concevoir de novo des portes logiques à base de protéines modulant des interactions protéine-protéine arbitraires pourrait ouvrir la porte à de nouveaux systèmes de contrôle à base de protéines à l'intérieur et à l'extérieur des cellules.

En principe, il devrait être possible de concevoir une large gamme de portes logiques de novo en utilisant un ensemble de molécules hétérodimères. Par exemple, étant donné des paires d'hétérodimères hypothétiques A : A′, B:B′, et C:C′, une porte ET modulant l'association de UNE avec C′ peut être construit en fusionnant génétiquement UNE' et B, et B′ et C: l'association n'a lieu qu'en présence des deux UN B, et AVANT JC (ici et ci-dessous ":” désigne une interaction non covalente et “-” une fusion génétique via des linkers flexibles). Plusieurs propriétés de bloc de construction sont souhaitables pour construire de telles portes logiques associatives. Premièrement, il devrait y avoir de nombreuses paires hétérodimères mutuellement orthogonales de sorte que la complexité de la porte ne soit pas limitée par le nombre d'éléments individuels. Deuxièmement, les blocs de construction doivent être modulaires et de structure similaire afin que les différences de forme des blocs de construction et d'autres propriétés n'aient pas à être prises en compte lors de la construction des portes. Troisièmement, des blocs de construction uniques devraient être capables de se lier à plusieurs partenaires avec des affinités différentes et réglables, permettant aux entrées d'effectuer des opérations de négation en perturbant les interactions préexistantes de faible affinité. Quatrièmement, les interactions doivent être coopératives afin que l'activation de la porte ne soit pas sensible aux déséquilibres stoechiométriques dans les entrées. Dans la porte ET ci-dessus, par exemple, si les interactions ne sont pas coopératives, alors un grand excès de UN B tirera l'équilibre vers des complexes partiellement assemblés (UN B soit UNE ou AVANT JC mais pas les deux), ce qui limitera l'activation du portail.

Ici, nous avons exploré la possibilité de concevoir des portes logiques satisfaisant aux quatre critères ci-dessus en utilisant des hétérodimères de protéines conçus de novo avec une spécificité médiée par le réseau de liaisons hydrogène (32). Ensembles d'hétérodimères mutuellement orthogonaux (DHD, ci-après désignés par des nombres, par exemple, 1 et 1′ forment un tableau de paires apparentées S1) avec une spécificité médiée par le réseau de liaisons hydrogène (par exemple, voir la figure 1A, en médaillon) sont disponibles pour la construction de portes logiques, satisfaisant la condition 1 (orthogonalité). Les interfaces hétérodimères partagent toutes la même topologie de faisceau à quatre hélices (Fig. 1A), satisfaisant la condition 2 (modularité). L'interface d'interaction partagée permet une quantité limitée de diaphonie entre les paires, conduisant à une hiérarchie d'affinités de liaison, satisfaisant la condition 3 (spécificités de liaison multiples). Inspiré des systèmes coopératifs dans la nature (33, 34), nous avons cherché à atteindre la condition 4 (coopérativité) en construisant les fusions de monomères (UN B et AVANT JC dans l'exemple ci-dessus) de telle sorte que les surfaces d'interaction (avec UNE et C′) sont enfouis dans les fusions. L'énergie libre requise pour exposer ces interfaces enterrées s'opposerait à l'activation de la porte, et nous avons pensé que le système pourrait être réglé de manière à ce que la somme des énergies de liaison des deux partenaires, mais pas l'un seul, soit suffisante pour surmonter cette barrière, assurant l'activation de la porte coopérative. Si la condition 2 (modularité) est vérifiée, alors un seul schéma pour assurer la coopérativité pourrait en principe fonctionner pour une large gamme de configurations de portes.

(UNE) À gauche : structure de l'épine dorsale de A : A′ bloc de construction hétérodimère, avec son réseau de liaisons hydrogène montré dans l'encart. En bas : représentations abrégées utilisées dans les figures. (B) Cycle thermodynamique décrivant le système de dimérisation induite. (C) Simulation du système de dimérisation induite en équilibre thermodynamique. UNE et B′ les monomères ont été maintenus constants à 10 M chacun tout en titrant dans diverses quantités initiales de la UN B protéines dimérisantes. Si la liaison n'est pas coopérative (petite c), puis la quantité finale de complexes trimériques diminue lorsque la protéine dimérisante est en excès. () Expériences de dénaturation à l'équilibre surveillées par CD pour les conceptions avec des lieurs de 6 et 12 acides aminés (AA). Les cercles représentent les données expérimentales et les lignes correspondent au modèle de dépliement unimoléculaire à trois états. (E) Profil expérimental SAXS de 1′-2′ avec un linker à six résidus (en noir) ajusté au profil calculé de 1:1′ hétérodimère (en rouge). (F) Schéma du système de dimérisation induite (avec un lieur à six résidus) résultats expérimentaux dans (G) et (H). (g) titrage nMS de 2 contre 10 M de 1′-2′ en présence (rouge) ou absence (bleu) de 10 M de 1. (H) titrage nMS de 1′-2′ contre 10 M chacun de 1 et 2. Les dimères 1 et 2 font référence à des complexes dimères partiels constitués du dimériseur se liant à l'un ou l'autre des monomères. A titre de comparaison, le résultat du modèle thermodynamique avec c = 991 000 est affiché en cyan. (je) Schéma de test du système de dimérisation induite dans la levure, avec des résultats in vivo présentés dans (J). Pg, progestérone. (K) Schéma de porte ET à deux entrées, avec les résultats de titrage nMS indiqués dans (L). Les trimères 1 et 2 font référence à des complexes trimères partiels des deux protéines dimérisantes se liant à l'un ou l'autre des monomères. (M) Une porte ET à trois entrées, avec les résultats de titrage nMS indiqués dans (N). Les tétramères 1 et 2 font référence à des complexes tétramères partiels des trois protéines dimérisantes se liant à l'un ou l'autre des monomères. Toutes les barres d'erreur sont des écarts types de m = 3 répétitions indépendantes.

Pour explorer la conception de blocs de construction coopératifs, nous nous sommes concentrés sur le système simple UNE + UN B + B′ (nous l'appelons ci-dessous dimérisation induite, UNE et B′ comme monomères, et UN B comme dimériseur). Si la liaison n'est pas coopérative, la quantité de complexe trimérique diminue lorsque UN B est en excès stoechiométrique par rapport à UNE et B′: la formation d'espèces dimères intermédiaires du dimériseur se liant à l'un ou l'autre des monomères entre en compétition avec la formation de complexes trimériques. Au contraire, si la liaison est coopérative de telle sorte qu'aucune liaison à l'un des monomères ne se produise en l'absence de l'autre, alors la quantité de complexe trimérique formée devient insensible à un excès du dimériseur. Un modèle thermodynamique simple de l'effet de la coopérativité de liaison sur la dépendance stoechiométrique de ces systèmes de dimérisation induite (Fig. 1B et voir la section de modélisation dans les matériaux supplémentaires) montre que, à mesure que la coopérativité de liaison diminue, il y a une diminution correspondante de la population de complexes trimériques complets à des concentrations élevées de dimérisation (Fig. 1C).

Nous avons émis l'hypothèse qu'un état de type faisceau plié à quatre hélices du UN B dimériseur pourrait s'opposer à la liaison soit UNE ou B′ parce que les surfaces d'interaction relativement hydrophobes seraient probablement séquestrées dans la structure pliée (fig. S1A). Nous avons testé différentes longueurs de linker flexibles connectant UNE' avec B utilisant des hétérodimères 1:1′ et 2:2′ comme système modèle. À toutes les longueurs de lieur testées (entre 0 et 24 résidus), les constructions ont été repliées et stables dans des expériences de dénaturation de chlorhydrate de guanidine de dichroïsme circulaire (CD), avec des énergies libres de déploiement >13 kcal/mol (Fig. 1D, fig. S2 et tableau S3) . Même si 1′-2′ les constructions de dimérisation avec des linkers courts de 0 et 2 résidus, ou avec un linker de 24 résidus très long, pouvaient être purifiées en tant que monomères (fig. S1B), elles étaient sujettes à l'agrégation, peut-être en raison d'un échange de domaine. En revanche, les conceptions avec des lieurs à 6 et 12 résidus sont restées largement monomères (tableau S4). Expériences de diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) (35) ont indiqué que leurs rayons hydrodynamiques sont proches de ceux des DHD en faisceaux à quatre hélices pliés (Fig. 1E et tableau S2). Les lieurs dans cette plage de longueurs permettent probablement aux deux monomères (1′ et 2′) se replier les unes sur les autres de telle sorte que les surfaces d'interaction largement hydrophobes soient enfouies les unes contre les autres, une telle structure devrait se déplier partiellement pour 1′-2′ interagir avec soit 1 ou 2. L'amplitude de l'énergie de déploiement (Δgouvert sur la figure 1B) détermine l'étendue de la coopérativité pour la porte. Nous avons sélectionné des longueurs de lieur de 6, 10 ou 12 résidus pour toutes les expériences suivantes.

Nous avons étudié la coopérativité du système de dimérisation induite in vitro en utilisant la spectrométrie de masse native (nMS, 36, 37), qui permet de mesurer directement les populations de différentes espèces oligomériques dans un échantillon (tableaux S5 à S8 pour courbe d'étalonnage, voir fig. S3). Nous avons d'abord mesuré dans quelle mesure 1 active la liaison de 2 à 1′-2′ (Fig. 1F). 1, 2, et 1′-2′ ont été exprimés séparément en Escherichia coli et purifié. A 10 M de 1′-2′ et 20 M de 2, nous avons observé une augmentation de 33 fois de la liaison entre 2 et 1′-2′ après ajout de 10 M de 1 (Fig. 1G), une multiplication par rapport aux systèmes allostériques naturels (33). Pour évaluer la sensibilité de la liaison au déséquilibre stoechiométrique, 10 M 1 et 2 ont été titrés avec des concentrations croissantes de 1′-2′ (Fig. 1H) et les espèces formées ont été déterminées par nMS. L'hétérotrimère 1:1′-2′:2 complexe a été observé sur une large gamme de 1′-2′ concentrations (Fig. 1H). Même en présence d'un excès de 6 fois 1′-2′, il n'y a pas eu de diminution du montant 1:1′-2′:2 formé, et ni 1:1′-2′ ni 1′-2′:2 a été détecté (Fig. 1H). On définit un paramètre de coopérativité c comme le rapport des affinités en présence et en absence de l'autre monomère, qui dans notre modèle est directement lié à l'énergie libre d'ouverture du dimériseur ( c = e G o p e n / RT voir matériaux complémentaires). L'estimée c la valeur des ajustements du modèle thermodynamique aux données nMS (Fig. 1H, ligne cyan) est de 991 000 ± 21 (pour référence, le c la valeur naturelle du système N-Wasp est de 350, mais les différences de système compliquent les comparaisons quantitatives). Cette valeur de c correspond àgouvert de 8,2 kcal/mol, soit environ la moitié de l'énergie libre de déploiement mesurée de 1′-2′ (tableau S3), suggérant que la liaison peut ne pas nécessiter le dépliement complet de l'état du faisceau à quatre hélices du dimériseur.

Pour étudier la coopérativité du système de dimérisation induit dans les cellules vivantes, nous avons utilisé un essai de type double hybride dans la levure. 11′ a été fusionné au domaine de liaison à l'ADN ZF43 (14), 7 au domaine de transactivation VP16, et le dimériseur 11-7′ a été placé sous le contrôle d'un élément sensible à la progestérone. L'association des domaines de liaison à l'ADN et d'activation entraîne la transcription de la protéine fluorescente rouge (RFP) (Fig. 1I). Le traitement des cellules avec une quantité croissante de progestérone a entraîné une augmentation jusqu'à 4,5 fois du signal RFP, avec seulement une petite baisse aux concentrations de progestérone saturantes (Fig. 1J). A partir de courbes d'étalonnage, dans ces conditions, 11-7′ devrait être en excès molaire >5 fois supérieur à 11′ et 7 (fig. S4), suggérant que 11-7′ se lie de manière coopérative à 11′ et 7 dans les cellules. Ainsi, la coopérativité du système de dimérisation le rend robuste aux fluctuations de la stoechiométrie des composants dans les cellules.

Avec des dimériseurs affichant une liaison coopérative, nous avons pensé que l'absence de dépendance vis-à-vis des excès stoechiométriques de l'un des composants devrait s'étendre à des portes plus complexes. En utilisant nMS, nous avons étudié la coopérativité d'une porte ET à deux entrées construite avec les deux dimérisations 1′-3′ et 3-2′ comme intrants et monomères 1 et 2 réunis par les deux entrées (Fig. 1K). Au fur et à mesure que la concentration des 2 entrées augmentait, la quantité de complexe hétérotétramère plafonnait à une stoechiométrie de 2:1, puis restait largement constante avec une petite baisse au rapport molaire de 6:1. Seules de très petites quantités de complexes partiels (hétérotrimères et hétérodimères) ont été observées, indiquant en outre une coopérativité élevée (Fig. 1L). Nous avons construit une porte ET à trois entrées à partir de 1′-4′, 4-3′, et 3-2′, qui contrôlent ensemble l'association de 1 et 2 (Fig. 1M). Semblable à la porte ET à deux entrées, l'abondance de complexes pentamériques complets n'a diminué que légèrement à des concentrations supérieures aux concentrations stoechiométriques d'entrées sans complexes tétramériques concurrents détectables (Fig. 1N).

Nous avons exploré la combinaison modulaire de DHD (tableau S1) pour générer une gamme de portes logiques d'hétérodimères de protéines inductibles de manière coopérative (CIPHR) à deux entrées. Les monomères de DHD individuels ont été liés à des protéines effectrices d'intérêt par fusion génétique de telle sorte que les entrées (sous-unités hétérodimères liées) contrôlent la colocalisation ou la dissociation des protéines effectrices. Tirer parti des matrices de spécificité tout-par-tout précédemment mesurées pour les DHD (32), nous avons exploré la construction de portes à partir de deux modalités d'interaction : la liaison apparentée entre les paires de protéines conçues et la liaison compétitive impliquant des interactions multispécifiques (Fig. 2A).

(UNE) Les portes CIPHR sont construites à partir de DHD (en haut) avec des monomères ou des monomères connectés de manière covalente comme entrées (à gauche), certaines portes n'utilisent que les interactions apparentées conçues (côté gauche du panneau du milieu), tandis que d'autres tirent parti des hiérarchies d'affinité de liaison observées (côté droit de panneau du milieu). (B et C) Portes logiques CIPHR à deux entrées ET (B) et OU (C) basées sur des interactions DHD orthogonales. ( à g) Portes logiques CIPHR NON (D), NOR (E), XNOR (F) et NAND (G) fabriquées à partir de liaisons protéiques multispécifiques et compétitives. Pour chaque porte, les points noirs représentent la mesure de croissance Y2H individuelle corrigée sur la croissance de fond, avec leurs valeurs moyennes indiquées dans les barres vertes. Les composants dans les cases grises indiquent les paires DHD utilisées. Les cases bleues indiquent les gradients d'affinité. *Pas de croissance de levure sur le fond. « 0 » et « 1 » dans les blocs du milieu et de droite représentent respectivement différents états d’entrée et sorties attendues.

Nous avons commencé par construire des portes ET et OU, en lisant la fonction de porte en utilisant une configuration levure à deux hybrides (Y2H) similaire aux systèmes levure à quatre hybrides décrits précédemment (38, 39). Pour construire une porte ET, nous avons fusionné 2 au domaine d'activation Gal4 (AD) et 1 au domaine de liaison à l'ADN Gal4 (DBD). Dans ce schéma, la colocalisation de l'AD et du DBD, et l'activation transcriptionnelle résultante du Son3 gène, devrait nécessiter l'expression des deux protéines d'entrée (1′-5, 5′-2′). En effet, la croissance dans un milieu dépourvu d'histidine nécessitait l'expression des deux entrées (Fig. 2B). Une porte OU a été construite de la même manière en reliant les 1-6 fusion à l'AD et 7′ au DBD. Expression de l'une ou l'autre des entrées, 1′-7 ou 6′-7, a entraîné une croissance en entraînant l'association de la MA avec DBD (Fig. 2C).

Nous avons exploré la construction de portes logiques booléennes supplémentaires en exploitant des hiérarchies d'affinité de liaison identifiées dans des expériences Y2H globales (32). 8 formé seul un homodimère, mais en présence de 8′ il s'est dissocié pour former le 8:8′ hétérodimère (fig. S5A). Nous avons construit une porte NOT en fusionnant 8 à la fois à AD et à DBD le 8:8 homodimère a soutenu la croissance des levures mais en présence de coexprimé 8′ protéine d'entrée, l'interaction a été interrompue et la croissance a été ralentie (Fig. 2D). Sur la base de la hiérarchie d'affinité 9:9′10:10′ > 9:10′ (fig. S5B), nous avons construit une porte NOR dans laquelle 9 a été fusionné à l'AD et 10′ au DBD, avec 9′ et 10 comme les deux entrées. L'une ou les deux entrées ont surpassé la 9:10′ interaction et la croissance des levures entravée (Fig. 2E). Sur la base de la hiérarchie d'affinité 9′:1′ > 9:9′1:1′ > 9:1 (fig. S5B), une porte XNOR a été construite en fusionnant 9 crapaud, 1 à DBD, et en utilisant 9′ et 1′ comme les deux entrées : la présence de l'un ou l'autre a supplanté le 9:1 la liaison et la croissance bloquée, mais lorsque les deux ont été exprimés, ils ont plutôt interagi les uns avec les autres et la croissance a été observée (Fig. 2F). De même, une porte NAND a été conçue sur la base de la hiérarchie d'interaction 1′:10′ > 1:1′10:10′ (fig. S5B). Ni 1 ni 10 seul pourrait surpasser le 1′:10′ l'interaction et donc la croissance se sont produites, mais lorsque les deux ont été exprimés, l'énergie libre de formation des deux 1:1′ et 10:10′ l'emportait sur celui de 1′:10′ et la croissance était bloquée (Fig. 2G).

Nous avons ensuite étudié les portes logiques CIPHR à trois entrées. Nous avons d'abord utilisé nMS pour caractériser une porte ET à trois entrées (Fig. 1M) dans laquelle les monomères 1 et 2 sont rapprochés par les trois entrées 1′-4′, 4-3′, et 3-2′. Nous avons testé expérimentalement les huit combinaisons d'entrées possibles (Fig. 3A) avec les deux 1 et 2 présent, quantifiant tous les complexes à l'aide de nMS. Compatible avec la fonction de porte ET à trois entrées, 1 et 2 n'a montré un coassemblage significatif que lorsque les trois entrées étaient présentes (Fig. 3B).

(UNE) Schéma d'une porte ET à trois entrées. (B) Les résultats nMS indiquent une activation correcte de la porte ET à trois entrées uniquement en présence des trois entrées. (C) Schéma d'une porte OU à trois entrées. () Les résultats Y2H confirment l'activation de la porte OU à trois entrées avec l'une des entrées. (E) Schéma d'une porte DNF. (F) Les résultats Y2H confirment l'activation correcte de la porte. Pour chaque porte, les points noirs représentent les mesures individuelles avec leurs valeurs moyennes indiquées dans les barres vertes. Pour les mesures basées sur Y2H [(D) et (F)], les mesures de croissance sont corrigées par rapport à la croissance de fond. Les composants dans les cases grises indiquent les paires DHD utilisées.

Pour tester la fonction de porte CIPHR à trois entrées dans les cellules, nous avons conçu deux portes supplémentaires utilisant les mêmes quatre paires de DHD et les avons testées par Y2H. Pour créer une porte OU à trois entrées, 1′-6-7 a été fusionné à AD et 11′ à DBD. N'importe laquelle des trois entrées (11-1, 11-6′, ou 11-7′) connecte l'AD au DBD via 1′, 6, ou 7, respectivement (Fig. 3C).Les résultats de Y2H ont confirmé le comportement attendu de cette porte logique dans les cellules : l'une des protéines d'entrée induit la croissance cellulaire (Fig. 3D). Nous avons en outre construit une forme normale disjonctive CIPHR [DNF (UNE ET B) OU C] porte par fusion 1′-6 à AD et 11′ vers DBD avec entrées 11-7′, 7-1, ou 11-6′ (Fig. 3E). Dans les expériences Y2H, la porte DNF a fonctionné comme prévu, avec de faibles niveaux de croissance de levure lorsqu'aucune entrée ou un seul des 11-7′ et 7-1 les protéines d'entrée étaient présentes et les niveaux de croissance de levure élevés sinon (Fig. 3F).

Pour tester la transférabilité des portes logiques CIPHR, nous avons exploré la capacité des portes logiques CIPHR à reconstituer l'activité enzymatique fractionnée en contrôlant l'association des deux moitiés du système de luciférase fractionnée NanoBiT (4042). Les monomères de 1:1′, 2:2′, 4:4′, et 9:9′ (Fig. 4A) ont été fusionnés par paires aux deux domaines divisés (smBiT et lgBiT) et produits par transcription et traduction in vitro, ce qui a facilité un cycle de test rapide permettant de déterminer la hiérarchie d'affinité de l'interaction 4 × 4 en surveillant l'activité de la luciférase après mélange (fig. S6A). Sur la base de cette hiérarchie, nous avons construit et vérifié expérimentalement un circuit de dimérisation induite avec 4-smBiT, 1-lgBiT, et 1′-4′ en tant qu'entrée (Fig. 4B et fig. S6, C et D), la caractérisation de la dépendance temporelle de la réponse a révélé une augmentation de 7 fois du signal 5 min après l'ajout d'entrées (fig. S6D). Nous avons également construit une porte ET avec 4-smBiT, 1-lgBiT, et 1′-2 et 2′-4′ comme les entrées (Fig. 4C) et une porte NOR avec 1′-smBiT, 2′-lgBiT, et 1 et 2 comme les entrées (Fig. 4D), qui avaient toutes deux la dépendance conçue de la fonction de porte (c'est-à-dire l'activité de la luciférase) sur les entrées. Nous avons étudié la réponse de la porte NOR à des concentrations variables des entrées par rapport aux composants NanoBiT maintenus à 5 nM et avons trouvé une forte baisse du signal autour de 5 nM pour les deux entrées, conformément à la logique NOR (Fig. 4E et fig. S6E).

(UNE) Quatre paires de DHD ont été combinées de manière modulaire pour construire des portes logiques CIPHR qui peuvent être utilisées pour contrôler différentes fonctions : activité catalytique de la luciférase fractionnée (B à E) et l'expression des gènes dans les cellules T humaines primaires (F et g). (B) le système de dimérisation induite, (C) la porte ET et (D) la porte NOR couplée au système de luciférase fractionné NanoBiT, testé par traduction in vitro et suivi de la luminescence. (E) Titrage in vitro des deux entrées de la porte NOR en D en gardant 1′-smBiT et 2′-lgBiT fixé à 5 nM. PAS de porte (F) et de porte OU (G) utilisant un système de répression TALE-KRAB divisé pour contrôler l'expression des protéines TIM3 dans les cellules T humaines primaires, testées par cytométrie en flux.

Les thérapies par cellules T modifiées sont des modalités thérapeutiques prometteuses (4345) mais leur efficacité pour le traitement des tumeurs solides est limitée au moins en partie par l'épuisement des lymphocytes T (46, 47). Gènes de point de contrôle immunitaire, y compris TIM3 sont censés jouer un rôle essentiel dans la modulation de l'épuisement des cellules T (4850). Pour placer la transcription de ces protéines sous le contrôle des portes logiques du CIPHR, nous avons profité de répresseurs transcriptionnels puissants et sélectifs des gènes de point de contrôle immunitaire dans les cellules T primaires qui combinent des domaines de liaison à l'ADN de type activateur de transcription (TALE) spécifique à la séquence. avec le domaine répresseur Krüppel-associated box (KRAB) (51). L'activité de répression est préservée dans des systèmes fractionnés associant un domaine de reconnaissance d'ADN fusionné à un monomère DHD avec un domaine répresseur fusionné au monomère DHD complémentaire (51). Nous avons pensé que ce système pourrait être exploité pour concevoir des dispositifs thérapeutiques programmables en rendant la jonction des fonctionnalités de reconnaissance de l'ADN et de répression transcriptionnelle dépendante des portes CIPHR. L'utilisation d'un domaine répressif inverse efficacement la logique des portes CIPHR lorsque le niveau d'expression du gène cible est mesuré en tant que sortie.

Pour tester la faisabilité de ce concept, nous avons utilisé une fusion TALE-KRAB conçue pour réprimer le gène du point de contrôle immunitaire TIM3 (51). Nous avons conçu une porte NON avec 1 fusionné au domaine de reconnaissance d'ADN TALE, 9′ fusionné à KRAB, et le 1′-9 protéine dimérisante comme entrée (voir fig. S7A pour la matrice de spécificité de la DHD des cellules T). Dans ce schéma, 1′-9 amène KRAB à la région promotrice liée par le TALE, déclenchant ainsi la répression de TIM3 (Fig. 4F). Profitant de l'interaction entre 9 et 1′, nous avons construit une porte OU avec 9-CONTE et 1′-Fusions KRAB TIM3 a été réprimé en l'absence d'intrants mais après ajout de l'un ou l'autre 9′ ou 1, le plus faible 9:1′ l'interaction a été surpassée en faveur de la plus forte 9:9′ et 1:1′ interactions, restauration TIM3 expression (Fig. 4G). Ces résultats suggèrent que la combinaison des systèmes CIPHR et TALE-KRAB pourrait être directement appliquée pour ajouter des capacités de traitement du signal à la thérapie par cellules T adoptive.

La conception systématique des portes logiques décrite ici tire parti des points forts de la conception de protéines de novo. Étant donné que les hétérodimères des blocs de construction sont conçus de novo, il est possible de générer beaucoup plus de composants pour la construction de portes avec une topologie globale presque identique que ce qui est disponible en réutilisant des motifs biologiques. Le codage de la spécificité à l'aide de réseaux de liaisons hydrogène conçus permet une large gamme d'affinités de liaison entre des monomères ayant des structures similaires, ce qui permet à son tour la construction de portes plus complexes basées sur une liaison compétitive. Du point de vue de la biophysique des protéines, nos résultats mettent en évidence la forte synergie entre la conception de novo de complexes protéiques et la nMS et, plus généralement, la capacité de la conception de novo de protéines à générer des assemblages coopératifs complexes. Par exemple, la détection et la quantification de l'activation de 33 fois de la liaison sur la figure 1G dépendaient de manière critique de la capacité à résoudre toutes les espèces formées en solution par nMS. L'analyse des portes logiques à trois entrées de la figure 3B a nécessité de distinguer les assemblages hétéropentamères conçus, qui sont composés de cinq chaînes protéiques distinctes, du très grand nombre de complexes hétérotétramères, trimères et dimères possibles. La capacité de générer des assemblages hautement coopératifs et bien définis composés de cinq chaînes polypeptidiques distinctes démontre que la conception de nouvelles protéines commence à approcher la complexité des assemblages de protéines naturelles, qui sont responsables d'une grande partie de la fonction biologique.

Contrairement aux portes logiques basées sur les acides nucléiques, les portes CIPHR peuvent être directement couplées à des domaines d'actionnement de protéines arbitraires, offrant une plus grande diversité dans les types de sorties fonctionnelles. Nous illustrons ici le couplage à l'activation et à la répression transcriptionnelles et à la reconstitution enzymatique fractionnée en principe, toute fonction pouvant être modulée par association protéine-protéine peut être placée sous le contrôle des portes CIPHR. Étant donné que les composants conçus sont des protéines hyperstables et qu'aucune machinerie cellulaire supplémentaire n'est requise, les portes doivent fonctionner dans un large éventail de conditions à l'intérieur et à l'extérieur des cellules (ici, nous avons démontré la fonction avec des composants purifiés dans des extraits acellulaires, des cellules de levure et cellules T). La petite taille des DHD et donc leur charge utile génétique les rendent attrayants pour l'ingénierie cellulaire des mammifères. La sophistication des circuits pourrait être encore augmentée par l'activation protéolytique comme dans de récentes études élégantes utilisant des circuits de protéines à base de protéase (30, 31) nos circuits purement basés sur les interactions protéiques présentent des avantages en termes de bioorthogonalité, d'évolutivité démontrée à trois entrées, de composabilité (la sortie, comme l'entrée et la machinerie informatique, consiste en des interactions entre des blocs de construction avec des caractéristiques de conception communes) et une extensibilité car un nombre essentiellement illimité répertoire de blocs de construction hétérodimères peut être créé en utilisant la conception de novo.


Enzymes

À la définition la plus basique, les enzymes sont des protéines spécialisées qui initient des changements dans le corps. Dans les milliers de milliards de réactions biochimiques qui se produisent dans nos cellules chaque minute, les enzymes jouent le rôle clé de catalyser ces réactions. Cela ne veut pas dire que ces réactions ne se produiraient pas normalement, mais les enzymes accélèrent la vitesse de ces processus. Les enzymes sont des protéines réutilisables qui sont adaptées à un type spécifique de réaction au sein d'une série ou d'un cycle de réactions. Un substrat est transformé en produit par son interaction avec une enzyme. Ce produit deviendra souvent le substrat de la prochaine réaction dans un cycle ou une voie métabolique, qui nécessitera un type d'enzyme différent.

L'interaction délicate des enzymes et des voies métaboliques élaborées est ce qui soutient les processus critiques dont nous avons besoin pour survivre, de la génération d'énergie utilisable à la réplication de l'ADN. Il existe environ 3 000 enzymes différentes dans le corps, chacune servant un objectif unique et précieux à nos cellules, tissus et organes !


La recherche pourrait permettre des avancées biotechnologiques : médecine, équipements de protection, capteurs

Crédit : Le laboratoire de recherche de l'armée

Une nouvelle recherche en biologie synthétique financée par l'armée a manipulé des micro-compartiments dans les cellules, permettant potentiellement des avancées en matière de bio-fabrication pour la médecine, les équipements de protection et les applications d'ingénierie.

Les mauvaises bactéries peuvent survivre dans des environnements extrêmement hostiles, y compris à l'intérieur de l'estomac humain très acide, grâce à leur capacité à séquestrer les toxines dans de minuscules compartiments.

Dans une nouvelle étude publiée dans ACS Science centrale, les chercheurs de la Northwestern University ont contrôlé l'assemblage des protéines et construit ces micro-compartiments en différentes formes et tailles, y compris de longs tubes et des polyèdres. Parce que ces travaux éclairent le développement des unités biologiques, telles que les virus et les organites, ils pourraient également éclairer de nouvelles façons de concevoir des médicaments, des cellules synthétiques et des nanoréacteurs essentiels à la nanotechnologie.

« Ces résultats constituent un pas en avant passionnant dans notre capacité à concevoir des compartiments complexes à base de protéines », a déclaré le Dr Stephanie McElhinny, responsable de programme au U.S. Army Combat Capabilities Development Command, connu sous le nom de DEVCOM, Army Research Laboratory. "Être capable de contrôler la taille et la forme de ces compartiments pourrait permettre des schémas de bio-fabrication sophistiqués qui sont personnalisés pour soutenir une production efficace de molécules complexes et de matériaux multifonctionnels qui pourraient fournir à la future armée des uniformes améliorés, des équipements de protection et des capteurs environnementaux. "

Plus tard, ces informations pourraient potentiellement conduire à de nouveaux antibiotiques qui ciblent les micro-compartiments des agents pathogènes tout en épargnant les bonnes bactéries.

Les chercheurs contrôlent l'assemblage des protéines et construisent des micro-compartiments cellulaires dans différentes formes et tailles qui pourraient conduire à des blocs de construction bio-inspirés pour diverses applications d'ingénierie.

"En concevant soigneusement des protéines pour qu'elles présentent des mutations spécifiques, nous avons pu contrôler l'assemblage des protéines qui forment les micro-compartiments bactériens", a déclaré le Dr Monica Olvera de la Cruz, professeur de science des matériaux et d'ingénierie et de chimie à Northwestern qui a dirigé les travaux théoriques. calcul. "Nous avons également utilisé cela pour prédire d'autres formations possibles qui n'ont pas encore été observées dans la nature."

Les chercheurs contrôlent l'assemblage des protéines et construisent des microcompartiments cellulaires dans différentes formes et tailles qui pourraient conduire à des blocs de construction bio-inspirés pour diverses applications d'ingénierie Crédit : Monica Olvera de la Cruz, Northwestern University

De nombreuses cellules utilisent la compartimentation pour garantir que divers processus biochimiques peuvent se produire simultanément sans interférer les uns avec les autres. Composés de protéines, ces micro-compartiments sont essentiels à la survie d'une grande variété d'espèces bactériennes.

« Sur la base d'observations antérieures, nous savons que la géométrie des micro-compartiments peut être modifiée », a déclaré le Dr Danielle Tullman-Ercek, professeur agrégé de génie chimique et biologique à Northwestern qui a dirigé les travaux expérimentaux. "Mais notre travail fournit les premiers indices sur la façon de les modifier pour obtenir des formes et des tailles spécifiques."

Pour étudier ces compartiments cruciaux, l'équipe de Northwestern s'est tournée vers Salmonella enterica, qui s'appuie sur des micro-compartiments pour décomposer les déchets des bonnes bactéries dans l'intestin. Lorsque les chercheurs ont manipulé génétiquement une protéine isolée de Salmonella, ils ont remarqué que les micro-compartiments formaient de longs tubes.

"Nous avons vu ces structures étranges et étendues", a déclaré Tullman-Ercek. "Il semblait qu'ils utilisaient les différents blocs de construction pour former différentes formes avec différentes propriétés."

En couplant les propriétés mécaniques du compartiment avec les produits chimiques à l'intérieur du compartiment, Olvera de la Cruz et son équipe ont utilisé des calculs théoriques pour prédire comment différentes mutations ont conduit à différentes formes et tailles. Lorsque les protéines à six côtés se sont réunies, elles ont formé de longs tubes. Lorsque les protéines à cinq côtés se sont réunies, elles ont formé des icosaèdres en forme de ballon de football. L'équipe a également prédit que les protéines pourraient s'assembler en une forme de samosa triangulaire, ressemblant à la collation frite d'Asie du Sud.

Comprendre ce processus pourrait conduire à des blocs de construction bio-inspirés pour diverses applications d'ingénierie qui nécessitent des composants de formes et de tailles variables.

"C'est comme construire avec des Legos", a déclaré Tullman-Ercek. "Il n'est pas souhaitable d'utiliser le même bloc de forme encore et encore, nous avons besoin de formes différentes. Apprendre des bactéries peut nous aider à construire de nouvelles et meilleures structures à cette échelle microscopique."


L'Institut de recherche sur la création

L'article de l'Impact de mars 1998"Le clonage - Qu'est-ce que c'est et où cela nous mène-t-il ?" a discuté de la procédure de clonage par transfert de cellules somatiques. Dans cette procédure, le noyau d'une cellule dérivée d'un embryon, d'un fœtus ou du tissu d'un adulte est inséré dans un ovule dont le noyau a été retiré. Après le développement de l'ovule au stade approprié, l'embryon est inséré dans l'utérus d'une femelle correctement préparée et laissé se développer jusqu'à terme. Cela produit une progéniture essentiellement génétiquement identique à l'animal qui a fourni le noyau qui a été inséré dans l'œuf. Cet article discutera de la transfert de gènes d'une espèce à une autre afin de doter l'espèce receveuse de propriétés bénéfiques, ou pour permettre au receveur de produire des protéines humaines à injecter à des patients humains dépourvus d'une protéine d'importance vitale.

Production de protéines thérapeutiques par transfert de gènes

Il existe de nombreuses protéines essentielles à une bonne santé que certaines personnes ne peuvent pas produire en raison de défauts génétiques. Ces protéines comprennent divers facteurs de coagulation sanguine provoquant l'hémophilie, l'insuline (entraînant le diabète), l'hormone de croissance (entraînant un manque de croissance appropriée) et d'autres protéines, dont l'administration corrige les conditions pathologiques ou entraîne d'autres avantages thérapeutiques. Les premiers travaux dans ce domaine employaient des bactéries. Certaines bactéries dans une culture bactérienne peuvent contenir de petites molécules d'ADN circulaires appelées plasmides. Ces plasmides ne font pas partie de l'ADN chromosomique que possèdent toutes les bactéries de la culture. Comme ces cellules bactériennes exceptionnelles se reproduisent par fission binaire ou division cellulaire, les plasmides sont transmis aux cellules filles. Ils peuvent également être transmis à d'autres cellules par conjugaison. Les scientifiques ont appris à utiliser des plasmides pour transférer des gènes humains à des cellules bactériennes. Si le gène inséré dans le plasmide de la bactérie est le gène humain de l'insuline par exemple, la bactérie dans laquelle ce gène est inséré produit de l'insuline humaine.

Insertion d'une coupe d'ADN dans un plasmide

Les scientifiques ont identifié et isolé des enzymes (appelées enzymes de restriction ou endonucléases de restriction) dont chacune coupe des gènes à des endroits très spécifiques. Plus de 100 de ces enzymes ont été isolées. Après que la position du gène humain qui code pour la protéine thérapeutique souhaitée a été localisée sur le chromosome, le gène est découpé en utilisant les enzymes de restriction appropriées et le gène est isolé. Les mêmes enzymes de restriction sont utilisées pour découper un morceau du plasmide d'ADN circulaire. Ainsi, les deux extrémités du gène humain seront celles qui se relieront aux extrémités ouvertes du plasmide. Une enzyme appelée ADN ligase est utilisée pour coupler chaque extrémité du gène aux extrémités ouvertes du plasmide, restaurant une molécule d'ADN circulaire avec le gène humain remplaçant le morceau coupé du plasmide. Ces plasmides, incluant désormais le gène humain, sont réinsérés dans des bactéries. Ces bactéries sont cultivées, produisant de grandes quantités de bactéries identiques portant le gène humain qui se reproduit avec l'ADN bactérien. De plus, ces bactéries produisent la protéine humaine codée par le gène humain épissé. La protéine est isolée de la culture bactérienne, purifiée et injectée aux patients souffrant de pathologies car leur corps ne peut pas produire des quantités suffisantes de protéine.

Avant le génie génétique, ces protéines devaient être minutieusement isolées des tissus ou du sang, mais comme elles sont produites en quantités aussi infimes, l'isolement de quantités importantes nécessitait le traitement de grandes quantités de matériel. En conséquence, ils étaient très chers. Des quantités relativement beaucoup plus importantes ont été obtenues à partir de cultures bactériennes génétiquement modifiées, mais le coût, bien que moindre, était encore élevé. Les bioréacteurs (c'est-à-dire la machinerie requise pour cultiver de grandes quantités de bactéries contenant le gène humain) sont extrêmement coûteux et doivent être exploités par plusieurs scientifiques et assistants techniques. De plus, le bon fonctionnement du bioréacteur est sensible aux petits changements de température et de composition du bouillon de culture.

Heureusement, une méthode alternative a été développée qui promet d'être beaucoup moins chère et beaucoup plus efficace. Cette méthode utilise un animal, tel qu'un porc, comme bioréacteur. Il a fallu des années aux scientifiques pour concevoir, développer et construire le bioréacteur très coûteux et difficile à exploiter conçu par l'homme. Dieu avait déjà conçu un bioréacteur beaucoup plus efficace et beaucoup moins cher. Les scientifiques ont finalement réalisé qu'il serait possible, par manipulation génétique, d'inciter une femelle porcine, une vache ou un autre animal à produire les protéines humaines souhaitées dans son lait.

Génie génétique d'une protéine de lait

Cette procédure a maintenant été couronnée de succès chez les porcs et les vaches. Parmi les animaux, le porc présente un certain nombre d'avantages. Sa période de gestation n'est que de quatre mois. À 12 mois, le porc est fertile et produit de grandes portées (généralement 10 à 12 porcelets). Un porc en lactation produit 300 litres (environ 315 pintes) de lait par an. La procédure se déroule comme suit :

  1. Le fragment d'ADN (gène) qui code pour la protéine humaine nécessaire est isolé.
  2. Le fragment d'ADN qui favorise la production de protéines dans les glandes mammaires est isolé et lié ou combiné au gène humain.
  3. Des œufs fécondés provenant d'un porc donneur sont obtenus.
  4. L'ADN humain est injecté dans un ovule dans la région du pronucléus mâle (ADN du sperme avant qu'il ne s'unisse à l'ADN de l'ovule) à l'aide d'une micro pipette très fine. L'ADN humain est ainsi incorporé dans l'ADN nucléaire de porc.
  5. L'œuf est implanté dans l'utérus d'un autre porc et se développe en une femelle porcine nouveau-née.
  6. La protéine désirée est isolée du lait de la truie une fois élevée.

Cette procédure a été menée avec succès par des scientifiques américains et les résultats ont été publiés en 1994. 1 Le gène humain qu'ils ont utilisé code pour la protéine C qui agit pour contrôler la coagulation du sang.Ils ont obtenu un gramme de protéine C de chaque litre de lait produit par le porc. C'est 200 fois la concentration trouvée dans le plasma sanguin humain. Environ un tiers seulement de la protéine C obtenue était biologiquement active. La raison en est que de nombreuses modifications d'une protéine doivent être effectuées dans une cellule après la formation de la chaîne protéique. Par exemple, des sections sont découpées dans le complexe protéique. Des groupes de sucre peuvent être attachés à certains endroits dans la chaîne protéique et des groupes d'ancrage de la paroi cellulaire peuvent être ajoutés. Les scientifiques ont découvert qu'une enzyme de transformation clé, appelée furine, était présente en quantités insuffisantes. Ils ont donc ajouté à leur complexe génétique le gène qui code pour la furine. Cela a augmenté le rendement en protéine C active. Les protéines humaines produites de cette manière doivent être testées pour leur sécurité et leur efficacité. Au moment d'écrire ces lignes, une protéine anticoagulante appelée anti-thrombine est actuellement testée dans des essais cliniques.

La comparaison de cette procédure avec l'utilisation de machines à bioréacteur illustre le fait qu'une génération d'ingénieurs biochimistes n'a pas réussi à égaler les capacités d'un outil de fabrication de protéines (le cochon) que Dieu avait préparé. La glande mammaire est optimisée pour maintenir une densité élevée de cellules afin de leur fournir une quantité suffisante de nutriments et de canaliser les protéines qui sont produites sous une forme qui peut facilement être isolée et purifiée. Cette procédure s'est avérée fructueuse et promet de fournir une méthode pour produire des protéines thérapeutiques précieuses à un coût beaucoup plus bas.


Voir la vidéo: DNA animations by for Science-Art exhibition (Janvier 2022).