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Pourquoi l'exonucléase T5 n'a-t-elle pas d'activité endonucléase dans l'assemblage Gibson ?


L'assemblage Gibson utilise l'exonucléase T5 pour mâcher l'extrémité 5' de l'ADNdb pour générer des surplombs. Cependant, l'exonucléase T5, contrairement à l'exonucléase lambda, aurait une activité endonucléase ADNsb (https://www.neb.com/products/m0363-t5-exonuclease#tabselect0). Pourquoi ne pose-t-il pas de problèmes lors du montage de la gibson ? Est-ce juste parce que ceux-ci ne produisent pas d'assemblages viables ? Ou est-ce parce que cette activité est inhibée d'une manière ou d'une autre, telle que la concentration en T5 est trop faible ?


Les conditions tampons utilisées dans la réaction atténuent également la réaction d'endonucléase, donc cela ne devrait pas être un problème si vous vous en tenez exactement aux protocoles. Je travaille sur cette enzyme depuis 1988 et j'étais le "cloner" original du surproducteur voir http://www.sayers.staff.shef.ac.uk/fen/ pour plus d'informations sur ces enzymes Jon Sayers, Université de Sheffield .


Je n'ai jamais fait d'assemblage Gibson, mais en regardant les protocoles sur le site Web de New England Biolabs, je pense que la réponse doit être que l'ADN ss exposé par l'exonucléase T5 est rapidement protégé de l'activité ssDNA-endonucléase car il (l'exonucléase exposée DNA) s'hybride avec la séquence complémentaire sur l'autre composant de la réaction d'assemblage. Ensuite, toutes les lacunes sont réparées et scellées par l'ADN polymérase et l'ADN ligase. Toutes ces enzymes sont bien entendu présentes en même temps dans la réaction d'assemblage en une étape.

En résumé, dans les conditions de la réaction d'assemblage, l'activité endonucléase ADNsb de faible niveau de l'exonucléase T5 est tout simplement dépassée par les autres réactions en cours.


SRSF3 et SRSF7 modulent la longueur 3′UTR par la suppression ou l'activation des sites de polyadénylation proximaux et la régulation des niveaux de CFIm

La polyadénylation alternative (APA) fait référence à la sélection régulée des sites de polyadénylation (PAS) dans les transcrits, qui détermine la longueur de leurs régions 3' non traduites (3'UTR). Nous avons récemment montré que SRSF3 et SRSF7, deux protéines SR étroitement liées, relient l'APA à l'exportation d'ARNm. Le mécanisme sous-jacent à la régulation de l'APA par SRSF3 et SRSF7 est resté inconnu.

Résultats

Ici, nous combinons iCLIP et le séquençage 3'-end et constatons que SRSF3 et SRSF7 se lient en amont des PAS proximaux (pPAS), mais ils exercent des effets opposés sur la longueur 3'UTR. SRSF7 améliore l'utilisation de pPAS d'une manière dépendante de la concentration mais indépendante de l'épissage en recrutant le facteur de clivage FIP1, générant de courts 3'UTR. Les domaines protéiques uniques à SRSF7, qui sont absents de SRSF3, contribuent au recrutement de FIP1. En revanche, SRSF3 favorise l'utilisation du PAS distal (dPAS) et donc de longs 3'UTR directement en contrecarrant SRSF7, mais aussi indirectement en maintenant des niveaux élevés de facteur de clivage Im (CFIm) via un épissage alternatif. Lors de l'épuisement de SRSF3, les niveaux de CFIm diminuent et les 3′UTR sont raccourcis. Les cibles indirectes de SRSF3 sont particulièrement sensibles aux faibles niveaux de CFIm, car ici CFIm remplit une double fonction, il améliore le dPAS et inhibe l'utilisation du pPAS en se liant immédiatement en aval et en assemblant des complexes de clivage improductifs, qui ensemble favorisent les longs 3'UTR.

Conclusion

Nous démontrons que SRSF3 et SRSF7 sont des modulateurs directs de l'utilisation de pPAS et montrons comment de petites différences dans l'architecture de domaine des protéines SR peuvent conférer des effets opposés sur la régulation de pPAS.


MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Oligonucléotides

Tous les oligonucléotides d'ADN ont été achetés auprès d'Integrated DNA Technologies avec purification par HPLC. Les oligonucléotides ont été dissous dans de l'eau de qualité PCR et les concentrations d'ADN ont été mesurées avec un spectromètre NanoDrop 2000. Les séquences des oligonucléotides utilisées dans ce travail sont répertoriées dans les informations supplémentaires (tableau supplémentaire S1).

Conditions expérimentales

Des expériences de digestion enzymatique ont été réalisées à 25°C. SELEX a été réalisé à température ambiante (∼20°C). Des expériences de calorimétrie à titrage isotherme (ITC) ont été réalisées à 23°C. Les expériences avec chaque aptamère ont utilisé les tampons de réaction suivants : aptamères ATP (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl2), MA aptamères (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 20 mM NaCl, 5 mM MgCl2), aptamères MMC (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 20 mM NaCl, 0,5 mM MgCl2), aptamère SCA2.1 (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 20 mM NaCl, 0,5 mM MgCl2) et aptamère de dopamine (tampon phosphate 10 mM, pH 7,4, NaCl 140 mM, KCl 4 mM, MgCl 2 mM2). Pour les expériences impliquant des exonucléases, 0,1 mg/ml d'albumine de sérum bovin a été inclus dans le tampon de réaction. Pour l'isolement de l'aptamère, le tampon suivant a été utilisé : Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, NaCl 20 mM, MgCl 0,5 mM2.

Dosages de digestion d'exonucléases et analyse d'électrophorèse sur gel

Pour tous les tests de digestion, 1 ul d'aptamère 50 uM a été mélangé avec 44 ul de tampon de réaction contenant la concentration appropriée de cible. Après une heure d'incubation, 5 l de 2 U/μl T5 Exo ou 5 l d'un mélange de 2 U/μl T5 Exo et 0,15 U/μl Exo I ont été ajoutés à la solution. Une quantité de 5 l du mélange réactionnel a été collectée à différents moments et mélangée avec 15 l de tampon de charge de formamide (75 % de formamide, 10 % de glycérol, 0,125 % de SDS, 10 mM d'EDTA et 0,15 % (p/v) de xylène cyanol ) pour arrêter la réaction. Les produits de digestion ont ensuite été analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant à 15 % (PAGE). La séparation a été effectuée à 20 V/cm pendant 2,5 à 3,5 h dans du tampon TBE 0,5 ×. Le gel a été coloré avec 1 × SYBR Gold pendant 25 min et imagé à l'aide d'un système d'image ChemiDoc MP (BioRad).

Dosages de microplaques de fluorescence de profilage à base d'exonucléases

Une quantité de 1 l de 50 M de MA-46 ou 50 M de MMC1, 25 M de SCA2.1 ou 25 M d'aptamère de dopamine a été mélangée avec 44 l de leur tampon de réaction respectif contenant une concentration appropriée de ligand. Pour la courbe d'étalonnage MA-46, 0, 25, 50, 100, 200, 400 et 800 µM de MDPV ont été utilisés (concentration finale). Pour les expériences de profilage aptamère-ligand, 400, 200, 50 ou 200 M de ligand ont été utilisés pour MA-46, MMC1, SCA2.1 ou aptamère dopamine respectivement (concentration finale) des contrôles sans ligand ont également été inclus. Pour le criblage des aptamères MMC liant la méphédrone, 0 ou 200 uM de méphédrone ont été utilisés (concentration finale). L'aptamère et le ligand ont été incubés pendant 1 h. Ensuite, 5 l d'un mélange contenant 2 U/μl de T5 Exo et 0,15 U/μl d'Exo I ont été ajoutés à la solution. Un temps de fluorescence a été enregistré pendant 1,5 h pour MA-46, 4 h pour MMC1, 3 h pour SCA2.1 ou 2,5 h pour dopamine aptamère en mélangeant 5 l du mélange réactionnel recueilli à différents moments avec 25 l de une solution de trempe (1,2 × SYBR Gold, 12 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 3,75 mM d'EDTA et 48 % (v/v) de formamide) préchargée dans les puits d'une microplaque noire de 384 puits. Les spectres d'émission de fluorescence de 500 à 800 nm et d'émission à 545 nm ont été acquis à l'aide d'un lecteur de microplaques Tecan M1000 Pro avec une excitation de 495 nm. La résistance d'un aptamère à la digestion (valeur de résistance) a été quantifiée en utilisant l'équation (AUC1 – ASC0)/ASC0 où ASC1 et ASC0 sont les aires sous la courbe des tracés de l'évolution temporelle de la fluorescence avec et sans ligand, respectivement. La réactivité croisée a été calculée en utilisant l'équation (AUCL – ASC0)/(ASCT – ASC0) × 100, où ASCL et ASCT est la résistance à la digestion de l'aptamère en présence d'un ligand donné et de la cible principale de l'aptamère (MDPV pour MA-46, méphédrone pour MMC1, MDPV pour SCA2.1 et dopamine pour l'aptamère de liaison à la dopamine), respectivement.

Détermination de la réactivité croisée par essai de fluorescence par déplacement de brin

Premièrement, pour optimiser la concentration du brin d'ADN complémentaire pour éteindre la fluorescence de l'aptamère de >90%, 40 l de différentes concentrations (concentrations finales : 0, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 nM) d'un ADN complémentaire de 15 nt Le brin marqué avec du 3'-dabcyl (appelé dab-15) a été incubé avec 40 ul de MA-46 marqué à la fluorescéine 5' (MA-FAM) dans un tampon de réaction à 95°C pendant 5 min. Ensuite, la solution a été refroidie en 30 minutes à température ambiante. Une quantité de 75 µl de cette solution a été chargée dans les puits d'une microplaque noire de 384 puits. Des spectres d'émission de fluorescence de 510 à 800 nm ont été enregistrés avec une excitation à 495 nm. Dans les conditions optimisées, une solution de 75 l contenant MA-FAM et dab-15 (concentrations finales 50 et 100 nM, respectivement) dissous dans le tampon de réaction a été incubée à 95°C pendant 5 min puis refroidie à température ambiante pendant 30 min . Ensuite, 5 µl de ligand (concentration finale : 400 µM) ont été ajoutés à la solution et incubés pendant 30 min. Une solution sans ligand a été préparée comme témoin. Ensuite, 75 µl de la solution ont été chargés dans les puits d'une microplaque noire de 384 puits. Les spectres d'émission de fluorescence ont été enregistrés de 510 à 800 nm avec une excitation de 495 nm. Le gain du signal a été calculé en utilisant l'équation (FF0)/F0, où F et F0 représentent l'intensité de fluorescence en présence et en l'absence de ligand, respectivement. La réactivité croisée a été calculée en utilisant l'équation (SL/ST) × 100, où ST est le gain de signal produit par la cible principale de l'aptamère (MDPV) et SL est le gain de signal produit par un ligand donné.


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Types de produits

Nous fournissons des solutions optimisées pour la recherche en sciences de la vie

La synthèse d'ADN est une technologie qui relie les acides désoxynucléiques (adénine, thymine, cytosine et guanine) pour former l'ADN. En tant que pierre angulaire de la biologie moléculaire moderne, la synthèse d'ADN joue un rôle central dans le domaine de la biologie synthétique. En plus de la synthèse d'oligos standard, nous fournissons également des services de recherche scientifique tels que la synthèse d'oligos longs, la synthèse d'oligos phosphorothioates (S-Oligo), la synthèse d'oligos modifiés, la synthèse d'oligos fluorescents et des sondes PCR quantitatives en temps réel pour répondre à vos différents besoins.

Les peptides sont synthétisés par réaction de condensation du groupe carboxyle d'un acide aminé avec le groupe aminé d'un autre acide aminé et sont largement utilisés dans divers domaines tels que la préparation d'anticorps, le développement de médicaments et le développement de vaccins polypeptidiques. Chacun de nos polypeptides est accompagné de données HPLC et de spectrométrie de masse fiables, des rapports de synthèse détaillés sont fournis et les produits sont envoyés à l'état lyophilisé. Un personnel expérimenté peut aider les utilisateurs à concevoir des chaînes peptidiques et faire des recommandations appropriées pour les différents besoins des utilisateurs, tels que les anticorps, les marqueurs spéciaux, la synthèse à grande échelle, etc. De plus, nous proposons également une synthèse PNA personnalisée de haute qualité.

Une bibliothèque de peptides est une nouvelle technique pour étudier la relation structure-fonction d'une protéine. Une banque de peptides contient un grand nombre de peptides qui ont une combinaison systématique d'acides aminés. La bibliothèque de peptides fournit un outil puissant pour la conception de médicaments, les interactions protéine-protéine et d'autres applications biochimiques et pharmaceutiques. Il a également de nombreuses applications dans le criblage de médicaments, la validation de cibles, la cartographie d'épitopes et le développement de vaccins.

La synthèse de gènes est une technologie qui synthétise des gènes par des méthodes artificielles, qui est l'un des moyens d'acquisition de gènes. Par rapport à l'acquisition de gènes à partir d'organismes existants, la synthèse de gènes n'a pas besoin de matrices et n'est donc pas limitée par la source des gènes. Nous utilisons un logiciel de conception de synthèse de gènes unique, qui comprend un ensemble complet d'outils pour concevoir des unités structurelles idéales, permettant ainsi une construction et une synthèse de gènes rapides et efficaces en une seule réaction. Ne vous limitez pas aux sites de restriction et aux polylinkers, nous synthétiserons les différentes séquences de gènes dont vous avez besoin.

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une méthode largement utilisée en biologie moléculaire, qui peut reproduire rapidement des millions à des milliards d'échantillons d'ADN spécifiques, permettant aux scientifiques d'extraire seulement une petite quantité d'échantillons d'ADN pour une recherche détaillée. Nous fournissons une variété d'ADN polymérases (Taq, Bst, Pfu) et des prémélanges PCR correspondants, couvrant un large éventail de scénarios tels que la haute fidélité, la haute spécificité et l'amplification rapide. Les kits de la série Scarlet™ offrent une solution parfaite pour la PCR directe sur le sang, et le kit de génotypage PrimeSNP™ utilise la méthode PCR Competitive Allele Specific pour le génotypage d'échantillons d'ADN purifiés. Des dNTP et des NTP (set, mix) de haute qualité sont également fournis.

L'acide ribonucléique (ARN), en tant que matériau clé pour la transmission de l'information génétique et la régulation cellulaire, a été largement étudié en biologie moléculaire. Comme l'ADN, l'ARN est assemblé sous forme de chaînes nucléotidiques, mais contrairement à l'ADN, l'ARN existe dans la nature sous forme de plis simple brin plutôt que de doubles brins appariés. Nous fournissons la RNasine (inhibiteur de la RNase) et la transcriptase inverse M-MLV pour fournir une solution complète de matières premières pour la recherche sur l'ARN. Les séries miAnalysis™ sont conçues pour la recherche quantitative sur les microARN. Et la série VirusMag™ est conçue pour l'isolement de l'ARN/ADN viral ou de l'ADN bactérien.

Chez SBS Genetech, nous sommes à l'avant-garde de l'offre de solutions d'amplification isotherme basées sur notre plateforme de classe mondiale. Notre ADN/ARN polymérase Bst est au cœur de cette plateforme, qui est un mélange de polymérase Bst et de transcriptase inverse extrêmement thermostable. Sur la base de cette enzyme spéciale, nous avons développé la série de microbilles d'amplification isotherme lyophilisées PrimeIamp TM. Cette série est constituée de master mix prêts à l'emploi, qui peuvent effectuer l'amplification isotherme directement lorsque les matrices et les amorces sont ajoutées. Grâce à la technologie de lyophilisation, ces master mix sont lyophilisés en microbilles solides, qui peuvent être transportées et stockées à température ambiante avec une grande commodité.

La technologie de silençage de l'ARN est devenue un outil puissant pour étudier la fonction des gènes. Le succès de toute expérience d'ARN dépend d'un siARN de haute qualité et d'un réactif de transfection efficace. Avec la modification chimique, notre ARNsi modifié chimiquement a une stabilité beaucoup plus élevée que l'ARNsi commun. La modification chimique améliore non seulement la durée de vie du siRNA dans le sérum et la culture cellulaire, mais améliore également son activité in vitro. En ce qui concerne le réactif de transfection, notre réactif de transfection siRNA prêt à l'emploi, Sirnafectamine, peut être utilisé pour une large gamme de lignées cellulaires, avec une cytotoxicité minimale et le meilleur état cellulaire après transfection. Comme la sirnafectamine protégera l'ARN pendant tout le processus, une très faible concentration de siARN peut produire une efficacité élevée de silençage génique.

La purification des acides nucléiques est une composante importante de la biologie moléculaire et a un large éventail d'applications en médecine et en sciences biologiques. Notre kit de purification d'acide nucléique utilise une technologie de colonne de gel de silice de première classe (SiMax™ Spin Column, SiMax™ Genomic DNA Extraction, SiMax™ PCR Products/Agarose Gel Purification, SiMax™ Plasmid DNA Miniprep) et la technologie de billes magnétiques (VirusMag™ Magnetic Beads, Séparateurs magnétiques VSep™, kit d'isolation ADN/ARN en une étape VirusMag™, kit d'isolation ADN/ARN VirusMag™), qui peuvent purifier l'ADN de diverses sources de manière rapide et fiable. La pureté de l'ADN purifié par notre kit est très élevée et il convient à de nombreuses applications en aval telles que la détermination de séquence, le clonage et le clivage.

Les marqueurs d'ADN sont utilisés pour déterminer la taille approximative des molécules sur le gel pendant l'électrophorèse, sur la base du principe que le poids moléculaire est inversement proportionnel à la mobilité à travers la matrice du gel. Nous fournissons des étalons de poids moléculaire d'ADN abondants qui peuvent être utilisés pour différentes longueurs de fragments. Nos fragments de marqueurs d'ADN ont été purifiés séparément par une technologie exclusive, leur qualité est donc supérieure aux normes de l'industrie.

CRISPR (Clustré Rrégulièrement jeespacé Scourt Palindromique Repeats) est une famille de séquences d'ADN trouvées dans les génomes d'organismes procaryotes tels que les bactéries et les archées. La technologie d'édition de gènes basée sur ce système a une grande variété d'applications. Ici, nous fournissons diverses nucléases Cas, sgRNA synthétiques et T7 Endonucléase I de haute qualité pour améliorer la précision et l'efficacité de vos expériences.


Résultats

Suppression et substitution de sites de restriction à l'aide de « Gibson Deletion »

L'assemblage Gibson est une technique de clonage puissante qui permet l'assemblage sans cicatrice de morceaux d'ADN avec des séquences homologues [4]. Ici, nous avons défié cette méthode de clonage pour assembler des morceaux d'ADN avec les séquences homologues présentes à un nombre défini de bases loin de l'extrémité de l'ADN (Fig. 1). Avec cette approche, un lambeau de séquence non homologue sera créé et supprimé très probablement par l'activité exonucléase 3'-> 5' de la polymérase Phusion présente dans le mélange Gibson (Fig. 1g et h). L'espace est ensuite comblé et ligaturé, entraînant une perte de l'ADN entre les séquences homologues et la fin de l'ADN. Nous avons testé cette approche en utilisant un petit plasmide de faible complexité (pUC19) et tenté de supprimer un site de restriction (KpnJE/Acc65I) et le remplacer par un autre (AflII) (Fig. 2). Pour tester si Gibson Deletion affiche un biais évident vers un surplomb spécifique, nous avons utilisé deux enzymes reconnaissant la même séquence d'ADN mais produisant des surplombs opposés (néoschizomères) : un surplomb de 5' avec Acc65I et un porte-à-faux de 3′ avec KpnI. Ces enzymes coupent le plasmide à l'extrémité 5' de l'enzyme -galactosidase codée, que nous avons utilisée pour le criblage des produits de clonage. Nous avons remplacé le KpnJE/Acc65I site avec un AflSite II utilisant la suppression Gibson. En particulier, nous avons utilisé des morceaux d'ADN double brin (oligos recuits) ainsi que des oligoes simple brin comme ADN donneur pour l'assemblage. L'ADN donneur contient un site de restriction AflII flanqué de 20 nucléotides de chaque côté, homologue à l'ADN pUC19, flanquant le KpnJE/AccSite 65I (Fig. 2a, encadrés rouges et jaunes). Les orientations directe et inverse ont été testées lorsque nous avons utilisé de l'ADN de donneur simple brin (Fig.2b).

Comparaison des assemblages classiques de Gibson et Gibson Deletion. Au cours de la réaction de Gibson, deux morceaux d'ADN linéaire avec des séquences homologues à leur extrémité peuvent se recombiner en un ADN assemblé (panneau de gauche). Une exonucléase 5'- > 3' (T5) ronge les extrémités d'ADN exposant les séquences homologues (lignes orange et jaune) puis capables de s'hybrider (une-b). Une ADN polymérase Phusion étend l'ADN des extrémités 3' (c) et une Taq ligase ligaturera les entailles (). La suppression de Gibson (panneau de droite) est une application alternative de la méthode d'assemblage classique de Gibson qui tire parti du fait que les séquences homologues sont présentes à plusieurs bases des extrémités de l'ADN (e rouge et jaune = ADN homologue bleu et marron = ADN non homologue). Cela permet la suppression des séquences non homologues et l'assemblage des deux pièces linéaires (F-h). L'ADN de lambeau créé (g, ligne brune) est très probablement éliminé par l'activité exonucléase 3'- > 5' de la polymérase Phusion dans le mélange Gibson et l'entaille remplie et ligaturée

Test de suppression de Gibson. une Le plasmide pUC19 a été coupé avec Kpnmoi ou Acc65I et ces sites de restriction présents à l'extrémité 5' du gène de la β-galactosidase ont été substitués par un AflSite de restriction II en utilisant la délétion Gibson. Les cases rouges et jaunes représentent les séquences homologues de 20 nucléotides chacune. Une image de colonies de bactéries bleues (probablement réussies de suppression de Gibson) et blanches (échec de suppression de Gibson) transformées avec des produits de suppression de Gibson est montrée. b Dans les schémas de gauche, l'ADN ajouté à chaque réaction de suppression de Gibson est affiché. Le tableau indique le nombre de colonies blanches ou bleues après transformation et étalement de chaque réaction de délétion Gibson. Le nombre de clones corrects après la coupe diagnostique et le séquençage de Sanger est indiqué dans les dernières colonnes. Les résultats de deux expériences indépendantes sont présentés

Pour déterminer si la délétion Gibson s'est produite correctement, nous avons d'abord effectué une observation qualitative des colonies étalées sur des milieux supplémentés en X-gal, un substrat de l'enzyme β-galactosidase. Parce que nous avons substitué un site de restriction de 6 nucléotides (KpnJE/Acc65I) avec un site de restriction différent de 6 nucléotides (AflII), l'enzyme β-galactosidase est restée active malgré le petit changement de séquence nucléotidique. Par conséquent, les colonies exprimant un plasmide avec une délétion Gibson correcte doivent apparaître en bleu, car l'enzyme β-galactosidase traite le substrat X-gal (Fig. 2a). Nous avons ensuite effectué une coupe diagnostique de l'ADN avec Kpnmoi et AflII. Pour simplifier l'observation directe des bandes d'ADN correctes sur un gel, nous avons effectué AflII ou Kpnje digère avec XmnI (Fichier supplémentaire 2 : Figure S1). Un sous-ensemble de produits réussis a également été séquencé par Sanger pour vérifier l'assemblage correct.

La suppression de Gibson a été effectuée en coupant le vecteur avec KpnI (Fig. 2b, traitement 1, 3, 5, 7) ou Acc65I (Fig. 2b, traitement 2, 4, 6, 8) en présence de phosphatase alcaline intestinale de veau (CIP). Des oligos annelés complémentaires (Fig. 2b, traitements 3 et 4) ou des oligos d'ADN simple brin (Fig. 2b, traitements 5–8) ont été utilisés comme ADN donneur. Comme témoins, les vecteurs coupés ont été utilisés pour la suppression de Gibson en l'absence d'ADN donneur (Fig. 2b, traitement 3, 5, 7), ou les mêmes vecteurs coupés ont été directement transformés en cellules compétentes sans réaction de Gibson. Ce dernier traitement est un meilleur contrôle car il permet la mesure du plasmide non coupé présent dans la réaction de Gibson.

Les résultats montrent que Gibson Deletion est une méthode de clonage très efficace, car les colonies étaient majoritairement bleues (plus de 94% pour toutes les conditions Fig. 2) et le bruit de fond du plasmide non coupé (transformation directe du plasmide coupé) était très faible. De plus, la plupart des colonies analysées montrent une substitution correcte de KpnJe site avec un AflSite II (Fig. 2b tableau et Fiche complémentaire 2 : Figure S1). De plus, nous n'avons observé aucune préférence de 5' sur 3' de porte-à-faux pour la Gibson Deletion (Fig. 2b, traitements 3, 5, 7 versus 4, 6, 8). Fait intéressant, les oligos simple brin, sans préférence pour le brin direct ou inverse, sont aussi efficaces que les oligos recuits double brin lorsqu'ils sont utilisés comme ADN donneur (Fig. 2b, traitement 3,4 contre 5-8).

La conversion d'un site de restriction en un autre est parfois nécessaire pour rendre un site de restriction unique ou pour créer un nouveau site de restriction unique adapté aux étapes de clonage suivantes. Ces tâches apparemment faciles nécessitent souvent une procédure laborieuse utilisant des procédures de clonage standard. Nous avons donc testé notre approche Gibson Deletion pour ces applications en utilisant le plasmide pUC19 qui contient deux PvuII sites et trois NspJe sites. La suppression de Gibson a été réalisée en utilisant des oligos simple brin qui maintiendraient un PvuII et muter le second en un AflSite II (Fig. 3a, panneau supérieur). Le vecteur a été coupé pendant la nuit avec PvuII en présence de phosphatase intestinale de veau (CIP) et le produit de digestion a été simplement purifié sur une colonne de purification et de concentration PCR. La suppression de Gibson a été réalisée en une seule réaction en mélangeant le vecteur coupé purifié et les deux oligonucléotides d'ADN simple brin avec le mélange réactionnel de Gibson (Fig. 3b et fichier supplémentaire 3 : Figure S2).

Utilisation de Gibson Deletion pour modifier, supprimer ou maintenir un site de restriction. une Représentation schématique des deux groupes de changements introduits dans pUC19 à l'aide de Gibson Deletion : top = making PvuII site unique changer un site en un AflII site et maintenir l'autre PvuII site bas = faire NspI site unique supprimer un site, maintenir un deuxième site et changer un troisième NspJe place dans un AflII site. b Les résultats du clonage représentés dans une

Une procédure similaire a été mise en œuvre en utilisant une colonne purifiée NspI vecteur pUC19 et oligos simple brin qui maintiendraient un NspJe site, élimine une seconde NspJe site, et mute le troisième NspJe place dans un AflSite II (Fig. 3a panneaux inférieurs). Pour vérifier l'assemblage correct, nous avons isolé l'ADN et l'avons coupé avec PvuII et Xmnmoi ou AflII et XmnI pour le pUC19 avec changé PvuII sites (groupe 1), et avec Nspmoi et Ndemoi ou AflII et XmnI pour le pUC19 avec changé NspI sites (groupe 2). Sur les 19 colonies analysées, 4 ont montré un assemblage correct pour le groupe 1 des 13 colonies analysées, 9 ont montré des schémas de digestion corrects pour le groupe 2. Nous avons également vérifié les assemblages par séquençage de Sanger qui ont montré pour la plupart des assemblages corrects (Fig. 3b et fichier supplémentaire 3 : Graphique S2).

Dans l'ensemble, nous avons montré que l'assemblage Gibson peut également être appliqué à l'ADN contenant des séquences homologues ne flanquant pas directement l'extrémité de l'ADN. Cette approche, nommée "Gibson Deletion", produit efficacement de l'ADN assemblé appauvri des régions non homologues entre les séquences homologues et l'extrémité de l'ADN. Gibson Deletion peut donc être utilisé pour modifier, maintenir ou éliminer facilement et efficacement les sites de restriction.

Suppression d'une quantité croissante d'ADN à l'aide de la suppression de Gibson

Nous avons montré que la suppression Gibson permet la suppression/substitution d'un site de restriction. Nous avons ensuite cherché à tester la quantité d'ADN pouvant être supprimée avec Gibson Deletion. À cette fin, neuf oligos d'ADN donneur simple brin ont été conçus, chacun ayant des séquences homologues avec le vecteur receveur à un nombre croissant de nucléotides loin de l'extrémité de l'ADN (figure 4a). Ces oligos ont été conçus pour supprimer 0 (exacte complémentarité avec les séquences flanquant le KpnJe site juste remplacé par un AflII), 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 et 100 nucléotides de chaque extrémité d'un KpnJ'ai coupé (Fig. 4a). Chaque oligo remplace également le KpnJe site avec un AflSite II (Fig. 4a). Comme contrôle, le vecteur coupé en l'absence d'ADN donneur a été utilisé pour la réaction de Gibson. Pour effectuer un premier test qualitatif du succès de l'assemblage, nous avons compté le nombre de colonies qui se sont développées sur des plaques de milieux complétées avec les antibiotiques de sélection appropriés (Carbénicilline). Un nombre élevé de colonies sur la plaque indique une probabilité plus élevée de réussite de la réaction de Gibson, car cela signifie que l'insert et le vecteur se sont assemblés (Fig. 4b et c). Cette hypothèse est corroborée par le nombre limité de colonies présentes sur la plaque témoin après transformation du seul vecteur coupé (fond de plasmide non coupé). Pour une analyse plus complète de l'assemblage correct, 8 colonies ont été prélevées dans chaque plaque, et l'ADN a été isolé et coupé avec les deux Kpnmoi et AflII pour déterminer si le AflLe site II a été correctement substitué au site KpnJe site sur la réaction de Gibson réussie (Fig. 4d, e et fichier supplémentaire 4 : Figure S3). Parmi les assemblages réussis, deux à cinq d'entre eux ont été séquencés par Sanger pour confirmer davantage l'assemblage correct.

Augmentation des suppressions à l'aide de la réaction de Gibson. une Le plasmide pUC19 a été coupé avec KpnI et ce site de restriction ont été remplacés par un AflSite II utilisant la suppression Gibson. Des oligos simple brin ont été utilisés comme AflADN donneur du site II pour la réaction de Gibson. Les oligonucléotides utilisés ont été conçus pour supprimer 0, 10 (5 de chaque côté), 20 (10 de chaque côté), 30 (15 de chaque côté), 40 (20 de chaque côté), 50 (25 de chaque côté), 60 (30 de chaque côté), 80 (40 de chaque côté), 100 (50 de chaque côté) et 200 (100 de chaque côté) nucléotides flanquant le KpnJE/AflII sites. Les lignes et cadres rouges et jaunes représentent des séquences homologues de 20 nt sur les oligonucléotides simple brin (lignes jaunes et rouges) et sur le vecteur (cadres jaunes et rouges). b-c Après réaction de Gibson, chaque échantillon a été transformé et 1/10 ou 9/10 des bactéries transformées ont été étalées sur des plaques LB supplémentées en carbénicilline. Le tableau indique le nombre de colonies en croissance pour chaque réaction également représenté dans le graphique à barres dans c. d-e Nombre de clones corrects après coupe diagnostique avec Kpnmoi et AflII () ou après la séquence de Sanger d'un sous-ensemble d'échantillons (e)

Les résultats de la coupe de diagnostic (Fichier supplémentaire 4 : Figure S3) montrent que, comme un plus grand nombre de nucléotides sont supprimés des deux extrémités de l'ADN du vecteur, la réaction de suppression de Gibson, comme prévu, diminue en efficacité, même si une bonne quantité (66 colonies) de colonies pourrait encore se développer sur des plaques avec sélection après suppression de 200 nucléotides (100 de chaque côté de la nouvelle Aflsite de restriction II) (Fig. 4b et c). Après coupe diagnostique et quantification de KpnJE-AflII substitution, suppression de jusqu'à 100 nucléotides (50 de chaque côté) a montré un taux de réussite de plus de 75 % (à l'exception de la suppression de 60 nucléotides qui, dans l'expérience présentée, ne montre qu'un taux de réussite de 37,5 %, très probablement en raison de la petite taille de l'échantillon ) (Fig. 4d). Lorsque la suppression de 200 nucléotides a été tentée, seuls 2 des 8 clones ont montré KpnJE-AflII substitution (25 % de taux de réussite). Cela indique que la suppression de plus de 100 nucléotides (50 de chaque côté) par Gibson Deletion a une efficacité moindre.

ADN qui a montré KpnJE-AflLa substitution II a été séquencée par Sanger pour confirmer qu'un assemblage Gibson correct s'est produit. Le séquençage de Sanger a montré qu'il n'était pas nécessairement vrai que plus l'ADN était supprimé, moins les erreurs étaient introduites par l'assemblage. Pour les 10 (5 de chaque côté), 20 (10 de chaque côté), 60 (30 de chaque côté) et 100 (50 de chaque côté) délétions de nucléotides, au moins deux des clones séquencés se sont avérés avoir la séquence correcte . Les assemblages incorrects étaient souvent incorrects en raison d'un nucléotide supplémentaire supprimé avant ou après l'insertion AflII site. Cependant, les deux clones séquencés pour la délétion plus étendue (200 nucléotides autour de la coupure de restriction) ont montré un assemblage correct (Fig. 4e).

Dans l'ensemble, ces résultats montrent que des centaines de nucléotides peuvent être facilement supprimés autour d'un site de restriction en utilisant un ADN simple brin dans une réaction de suppression de Gibson. Comme attendu, une diminution de l'efficacité est observée dans les réactions visant à supprimer plus de 100 nucléotides.

Suppression d'une quantité croissante d'ADN et insertion simultanée d'ADN complexe

Pour tester l'efficacité de la suppression de Gibson en utilisant un ADN plus complexe comme ADN donneur au lieu d'oligonucléotides courts, nous avons effectué l'assemblage de Gibson à l'aide d'une cassette pour l'expression RFP (protéine fluorescente rouge). La PCR de la cassette RFP a été réalisée en utilisant une matrice plasmidique et des amorces contenant des bras d'homologie complémentaires à l'ADN flanquant le KpnI site sur le plasmide pUC19. Plusieurs amorces ont été conçues pour supprimer des quantités croissantes d'ADN flanquant le KpnJe site sur la réaction de suppression de Gibson (Fig. 5a et fichier supplémentaire 1). Les colonies bactériennes exprimant de grandes quantités de protéine RFP (comme pour l'expression de plasmides à nombre de copies élevé comme pUC19) peuvent être facilement criblées en tant que colonies rouges sur des plaques pour cette raison, la cassette RFP a été choisie comme moyen simple de cribler des colonies exprimant des plasmides assemblés avec une réaction de Gibson correcte (Fig. 5b). Insertion de la cassette RFP et suppression simultanée de jusqu'à 60 nucléotides flanquant le KpnI site de restriction (30 nucléotides de chaque côté du Kpnsite I) en utilisant la suppression Gibson a produit plus de 90 % de colonies rouges (Fig. 5c). Cependant, pour une délétion de 200 nucléotides (100 de chaque côté), peu de colonies transformées se sont développées sur des plaques de sélection et seulement 8,3 % des colonies étaient rouges (Fig. 5c).

Suppression d'une quantité croissante d'ADN et insertion simultanée d'ADN complexe. une Schéma de l'approche d'assemblage suivie pour les expériences présentées. Un plasmide pUC19 a été coupé avec KpnI, et une cassette RFP a été introduite dans le vecteur coupé à l'aide d'un assemblage Gibson. Les différents inserts ont été produits par PCR, chacun utilisant des amorces différentes avec des dommages homologues différents pour supprimer des quantités croissantes de nucléotides autour de la KpnJe site sur la réaction de suppression de Gibson. Les cassettes RFP ont été conçues pour avoir 20 nucléotides d'homologie avec le plasmide (représentés par les lignes et les cases rouges et jaunes). Les amorces RFP ont été conçues pour supprimer 0, 10 (5 de chaque côté), 20 (10 de chaque côté), 30 (15 de chaque côté), 40 (20 de chaque côté), 50 (25 de chaque côté), 60 (30 de chaque côté) et 200 (100 de chaque côté) nucléotides autour du Kpnje site. b Les réactions de Gibson ont été transformées et étalées sur des plaques de carbénicilline (1/10 ou 9/10 du mélange de transformation). Les colonies exprimant l'ADN qui ont subi un assemblage probablement réussi apparaissent en rouge en raison de l'expression de la RFP insérée. Un assemblage incorrect entraînerait une colonie blanche. c Le nombre de colonies rouges par rapport aux colonies blanches a été compté et enregistré. Nombre de clones corrects après séquençage de Sanger. Les réactions de suppression de Gibson ont été réalisées avec une incubation à 50 °C pendant 30 min ou avec une pré-incubation à 37 °C pendant 30 min avant une incubation à 50 °C pendant 30 min supplémentaires.

Le séquençage des plasmides récupérés dans les colonies rouges a montré que lors de la suppression de Gibson, la plupart de l'ADN a subi un assemblage correct (Fig. 5d). Suppression de 200 nucléotides autour du KpnLes sites I n'ont donné aucune intégration correcte de la cassette RFP. Bien que nous ayons pu obtenir des colonies rouges à partir de cet assemblage plus difficile, le séquençage Sanger des séquences flanquantes de la RFP a révélé des délétions correctes uniquement d'un côté (extrémité 5' ou 3') de la RFP et une délétion partielle ou nulle de l'autre côté de la cassette RFP. Certains clones ont également montré de nouvelles insertions entre la cassette RFP et les séquences supprimées (Fichier supplémentaire 5 : Figure S4). Sur la base de ces résultats, nous avons également testé si une incubation à 37 °C de la réaction de Gibson avant l'incubation à 50 °C (voir méthodes) augmentait l'efficacité de la suppression de Gibson. La température optimale de l'exonucléase T5, nécessaire pour exposer les séquences homologues avant leur annelage, est de 37 °C et nous avons donc émis l'hypothèse qu'une pré-incubation à 37 °C augmenterait la mastication, augmentant éventuellement le succès des assemblages de suppression Gibson en particulier pour la réaction avec des séquences plus longues à supprimer. Les réactions de suppression de Gibson ont donc été incubées pendant 30 min à 37 °C avant d'être incubées à 50 °C pendant les 30 min suivantes. La pré-incubation à 37 °C n'a pas amélioré la réaction de suppression de Gibson et elle a même diminué le nombre d'assemblages corrects tel que déterminé par le séquençage de l'ADN des plasmides obtenus après la réaction de suppression de Gibson effectuée en parallèle avec ou sans la pré-incubation à 37 °C ( 5d).

Dans l'ensemble, nos résultats montrent que la suppression de Gibson peut être appliquée pour la suppression simultanée d'ADN et l'assemblage d'ADN complexe avec une efficacité d'assemblage décroissante avec l'augmentation des quantités d'ADN supprimé.


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Pourquoi l'exonucléase T5 n'a-t-elle pas d'activité endonucléase dans l'assemblage Gibson ? - La biologie

Les ravageurs et phytopathogènes émergents ont réduit le rendement et la qualité des cultures, ce qui a menacé la sécurité alimentaire mondiale. Les méthodes de sélection traditionnelles, les approches de sélection basées sur des marqueurs moléculaires et l'utilisation de cultures génétiquement modifiées ont joué un rôle crucial dans le renforcement de la sécurité alimentaire dans le monde. Cependant, leurs utilisations dans l'amélioration des cultures ont été très limitées en raison de multiples mises en garde. Les outils d'édition du génome tels que les nucléases effectrices de type activateur transcriptionnel et l'endonucléase Cas9 (CRISPR/Cas9) associée à des répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées (CRISPR) ont efficacement surmonté les limitations des méthodes de sélection conventionnelles et sont largement acceptés pour l'amélioration des cultures. Parmi les outils d'édition du génome, le système CRISPR/Cas9 s'est imposé comme l'outil le plus puissant d'édition du génome en raison de son efficacité, de sa convivialité, de sa flexibilité, de son faible coût et de son adaptabilité. Les preuves accumulées indiquent que l'édition du génome a un grand potentiel pour améliorer la résistance aux maladies des plantes cultivées. Dans cette revue, nous avons offert une brève introduction aux mécanismes de différents systèmes d'édition du génome, puis discuté des développements récents de l'édition du génome basée sur le système CRISPR/Cas9 vers l'amélioration de la résistance aux maladies du riz par différentes stratégies. Cette revue a également discuté des applications possibles des approches d'édition du génome récemment développées comme CRISPR/Cas12a (anciennement connu sous le nom de Cpf1) et des éditeurs de base pour l'amélioration de la résistance du riz aux maladies.

Riz (Oryza sativa L.) sert de source importante de glucides pour plus des deux tiers de la population mondiale. La population en plein essor couplée au changement climatique et à l'émergence de nouveaux phytopathogènes ont un effet drastique sur la productivité mondiale du riz. Au cours des dernières décennies, les approches de sélection traditionnelles, y compris la sélection par mutation et la sélection moléculaire, ont considérablement contribué au développement de stratégies efficaces de résistance aux maladies du riz, nécessaires pour renforcer la sécurité alimentaire mondiale. Cependant, ces méthodes sont longues et laborieuses. Techniques de transfert de gènes par AgrobactérieLa transformation à base de plantes et d'autres approches ont considérablement amélioré le rendement, la qualité et la résistance aux maladies des plantes. Cependant, les réglementations en matière de biosécurité et les problèmes sociaux et éthiques liés aux cultures transgéniques ont toujours été un obstacle majeur à l'acceptation par le public de ces cultures génétiquement modifiées (GM) ( Lusser et al, 2012 ). Par la suite, de meilleures stratégies pour des variétés de riz à haut rendement et résistantes au stress sont le besoin du moment pour augmenter la productivité du riz et assurer la sécurité alimentaire mondiale.

Les maladies des plantes sont les contraintes majeures qui ont menacé le développement agricole et la sécurité alimentaire mondiale. Les cultures sont sensibles à un large éventail d'agents pathogènes, notamment des bactéries, des virus et des champignons, qui causent des pertes économiques importantes ( FAO, 2017 ). Les agents pathogènes affectent la croissance et le développement des cultures, ce qui entraîne d'énormes pertes de rendement, créant ainsi des obstacles à une agriculture durable. De multiples stratégies de gestion des maladies et outils d'évaluation des risques, y compris l'utilisation de protocoles de prévision des maladies, l'utilisation combinatoire de produits chimiques, de fongicides et d'agents de lutte biologique, les rotations de cultures et la sélection de la résistance de l'hôte sont pratiquées depuis très longtemps ( Ul Haq et Ijaz, 2020 ) . Cependant, la plupart de ces stratégies sont inadéquates pour obtenir des succès dans de nombreux pathosystèmes en raison de la diversité de la gamme d'hôtes des phytopathogènes, de la toxicité environnementale, des divergences dans l'évaluation de la réaction de résistance aux maladies et des systèmes de prévision des maladies inefficaces. Par conséquent, la compréhension du mécanisme moléculaire régissant l'interaction entre l'hôte et l'agent pathogène est essentielle au développement d'une stratégie efficace de résistance aux maladies.

Les plantes utilisent de multiples réponses de résistance pour empêcher la colonisation par des micro-organismes pathogènes. D'une part, la résistance des plantes aux phytopathogènes est typiquement régulée par la résistance (R) gènes codant pour les protéines répétées riches en leucine se liant aux nucléotides (NB-LRR), qui neutralisent l'activité moléculaire des protéines effectrices des agents pathogènes dans la cellule végétale ( Cui et al, 2015 ). En revanche, mutation ciblée ou knock-out de susceptibilité (S) gène(s) qui agit comme un facteur de compatibilité hôte-pathogène induit également une immunité récessive contre les phytopathogènes adaptés ( van Schie et Takken, 2014 ). Comme la majorité des maladies des plantes surviennent en raison d'une interaction compatible entre l'hôte et l'agent pathogène, ce qui modifie le S-les gènes qui favorisent la compatibilité pourraient être très importants dans le développement de stratégies de sélection moléculaire à large spectre et durables pour la résistance aux maladies ( van Schie et Takken, 2014 ).

Récemment, l'émergence de plusieurs nouvelles techniques de sélection, notamment des plates-formes de sélection rapide, le génotypage à haut débit et l'édition précise du génome couplée au génie génétique ont généré avec succès plusieurs variétés de cultures à haut rendement sans maladie (Li et al, 2020). Parmi elles, les approches d'édition du génome sont apparues comme des outils révolutionnaires pour l'amélioration des cultures (Voytas et Gao, 2014). Les outils d'édition du génome sont représentés par des nucléases spécifiques de séquence (SSN) qui introduisent une rupture d'ADN double brin dans une région génomique spécifique, induisant ainsi les voies de réparation de l'ADN de l'hôte soit par recombinaison homologue (HR) soit par jonction d'extrémités non homologues (NHEJ) ( Sander et Joung, 2014). Alors que NHEJ est une méthode sujette aux erreurs qui crée des mutations aléatoires conduisant à un décalage du cadre et à un knock-out du gène cible, la voie HR est beaucoup plus précise, ce qui entraîne un remplacement de gène ou un knock-in de gène lorsque des modèles d'ADN de donneur sont disponibles (Baltes et al, 2015). Néanmoins, ces processus naturels de réparation de l'ADN entraînent une mutation conduisant à l'altération d'un trait spécifique. De multiples outils d'édition du génome, notamment les nucléases à doigt de zinc (ZFN), les nucléases effectrices de type activateur de la transcription (TALEN) et, plus récemment, l'endonucléase Cas9 (CRISPR/Cas9) associée à des répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées en cluster (CRISPR) ont facilité l'introduction d'importantes traits dans de nombreuses espèces végétales ( Zaidi et al, 2018 ). Parmi ces plates-formes, le système CRISPR/Cas9 est mieux accepté par la communauté scientifique pour sa simplicité, sa spécificité élevée pour le clivage de la cible, l'implication d'une chimie des protéines sans complexe et son applicabilité universelle ( Zaidi et al, 2018 ). De plus, la résistance aux maladies médiée par CRISPR/Cas a déjà été signalée contre plusieurs phytopathogènes, notamment des bactéries ( Peng et al, 2017 ), des champignons ( Wang et al, 2016 ) et des virus ( Chandrasekaran et al, 2016 Zaidi et al, 2016 ) dans différentes cultures dont le riz ( Sun et al, 2017 Li SY et al, 2018 Tomlinson et al, 2019 He et al, 2020 ) soit par modification spécifique de la cible des gènes de l'hôte, soit par altération précise des génomes pathogènes. Dans cette revue, nous avons résumé les différentes stratégies associées à l'édition du génome et leurs applications ultérieures dans l'amélioration des cultures en mettant l'accent sur les avancées du système CRISPR/Cas9 et son rôle dans la résistance aux maladies du riz.

L'édition du génome est une nouvelle approche dans laquelle les SSN sont utilisés pour apporter des modifications précises dans l'ADN génomique. La création d'une cassure double brin (DSB) active le mécanisme de réparation de l'ADN de la cellule, soit par la méthode NHEJ, soit par la méthode HR. NHEJ intègre des mutations d'insertion et de suppression (InDel) alors que la méthode HR entraîne une insertion ou un remplacement de gène beaucoup plus précis. Les méganucléases telles que la I-SceL'enzyme endonucléase de levure a constitué le premier système d'édition du génome connu ( Paques et Duchateau, 2007 ). Cependant, ce sont les moins efficaces parmi la boîte à outils d'édition en raison de la communication peu claire entre les résidus de la protéine méga nucléase et la séquence d'ADN cible spécifique correspondante ( Hsu et al, 2014 ). Les ZFN sont les SSN qui se lient à l'ADN par le biais d'un réseau modifié de motifs à doigts de zinc (Carroll, 2011). Un doigt de zinc spécifique comporte environ 30 acides aminés dans une configuration conservée β β α. Le domaine de clivage non spécifique FokI est de nature dimère et, en tant que telle, une paire de ZFN est conçue pour apporter le FokI monomères proches de la cible d'ADN spécifique pour la création d'un DSB ( Bogdanove et Voytas, 2011 ) (Fig. 1-A). Les ZFN ont été utilisées avec succès comme outil d'édition du génome dans un large éventail de cultures et de plantes modèles, notamment Arabidopsis, tabac et maïs ( Cai et al, 2009 Shukla et al, 2009 Osakabe et al, 2010 ). Pourtant, leur utilisation en tant qu'outil d'édition est très limitée en raison de plusieurs contraintes, notamment la liaison hors cible des motifs en doigt de zinc et les interactions multiformes entre les résidus d'acides aminés et la séquence cible (Carrol, 2011 Voytas, 2013).

Contrairement aux ZFN, les TALEN sont conçus en combinant un FokI domaine nucléase avec un domaine de liaison à l'ADN d'un effecteur de type activateur de transcription (TALE) (Fig. 1-A). Les TALE sont des protéines sécrétoires de Xanthomonasbactéries caractérisées par la présence d'un domaine d'activation acide C-terminal et d'une séquence signal de localisation nucléaire, d'un domaine central de liaison à l'ADN (DBD) et d'une séquence signal de translocation N-terminale ( Bogdanove et al, 2010 ). Les TALE sont principalement responsables de l'activation transcriptionnelle des gènes de susceptibilité aux maladies chez les plantes hôtes. Les TALEN sont bien établis dans de nombreuses espèces végétales, notamment le riz, le blé, le tabac et l'orge ( Wang et al, 2014 Li T et al, 2016 Blanvillain-Baufume et al, 2017 ). Bien que les TALEN soient qualitativement plus efficaces que les ZFN en termes de spécificité de cible élevée et de faible activité hors cible, les DBD TALE sont représentés par une structure de répétition étendue qui limite leur utilisation complète dans l'édition de génomes multiples. En revanche, le système CRISPR/Cas9 de type II est la méthode d'édition du génome la plus innovante qui a remplacé les ZFN et les TALEN en raison de son efficacité et de sa robustesse. CRISPR/Cas9 utilise une endonucléase ADN Cas9 avec une petite molécule d'ARN appelée ARN guide unique (sgRNA) qui régule le DSB spécifique au site médié par Cas9 sur des cibles spécifiques (Fig. 1-A). L'attachement de la structure Cas9-sgRNA à l'ADN cible et le clivage qui s'ensuit dépend de la présence d'une séquence de motif adjacent au protospacer (PAM) (5′ -NGG-3′ ) à l'extrémité 3′ de la cible placer. Par conséquent, le fait de ne nécessiter que des séquences d'espacement différentes fait de CRISPR/Cas9 un outil d'édition très simple et très efficace qui a été largement exploité ces dernières années pour l'amélioration des plantes modèles et des principales cultures (Ma et al, 2015 Xu et al, 2016 Zhang Y et al, 2020).

Alors que l'amélioration des caractères a été très fructueuse à l'aide de CRISPR/Cas9, la condition préalable d'une séquence NGG PAM a limité son utilisation aux sites cibles potentiels. Dernièrement, plusieurs variantes de Cas9 et protéines homologues, telles que Cas9-VRER, Cas9-VQR, Cas9-EQR, Cpf1-RVR, Cpf1-RR et SaCas9, ont amélioré la faisabilité de l'ingénierie d'une large gamme de Cas9 avec des spécificités PAM améliorées pour le génome édition dans des cellules eucaryotes ( Kleinstiver et al, 2015 Gao et al, 2017 ). Hu et al (2018) ont utilisé un processus d'évolution continue assisté par phage pour développer une variante SpCas9, appelée xCas9, qui a une plus large gamme de compatibilité PAM, y compris NG, GAA et GAT, et en même temps une plus grande spécificité d'ADN et un génome inférieur activité hors cible par rapport à SpCas9. Plus récemment, de nouveaux éditeurs de bases de cytosine et d'adénine avecStaphylococcus aureus Cas9 (SaCas9-NG), variantes SpCas9-NG, ont considérablement élargi les sites pouvant être ciblés dans le génome du riz ( Hua et al, 2019 ). De plus, les variantes SpCas9-NG ont considérablement élargi la portée de l'édition du génome de la pomme de terre et de la tomate en ciblant les PAM NGA et NGT non canoniques (Veillet et al, 2020). Dans l'ensemble, une utilisation efficace de ces variantes Cas9 serait essentielle pour accélérer l'amélioration du riz grâce à une résistance accrue à de multiples phytopathogènes.

L'avènement d'une autre endonucléase associée à CRISPR de classe II, CRISPR/Cas12a ou Cpf1, a élargi l'horizon de l'édition du génome avec plus de précision et de compétence (Endo et al, 2016) (Fig. 1-A).Par rapport au système CRISPR/Cas9, le CRISPR/Cas12a reconnaît les PAM riches en T (5′ -TTTN-3′ et 5′ -TTN-3′ ) à l'extrémité 5′ du site cible, ce qui à haute efficacité de clivage ( Zetsche et al, 2015 ). Contrairement à CRISPR/Cas9 qui nécessite un sgRNA de 100 nt, le complexe CRISPR/Cas12a ne nécessite pas de tracrRNA et peut donc faciliter l'édition de gènes avec seulement un crRNA de 40-45 nt composé de la répétition et de l'espaceur. Et les domaines RuvC et nucléase de Cas12a clivent la cible et le brin secondaire de l'ADN à 23 et 17 pb en aval de la séquence PAM, respectivement, ce qui entraîne des extrémités décalées avec des surplombs de 5 pb (Zetsche et al, 2015). En soi, le développement de mutations plus importantes à l'aide de CRISPR/Cas12a augmente l'efficacité de l'insertion du gène donneur à médiation HR à l'emplacement génomique spécifique. De plus, Cas12a agit simultanément comme une RNase pour convertir le pré-crRNA en crRNA et une nucléase pour cliver l'ADNdb, démontrant une double activité enzymatique (Zetsche et al, 2015). Par conséquent, CRISPR/Cas12a a le potentiel de générer plusieurs ARNc dirigés par un seul promoteur, ce qui le rend plus simple que le système CRISPR/Cas9. De plus, le clivage hors cible par Cas12a est relativement inférieur à Cas9. Ces fonctionnalités rendent CRISPR/Cas12a plus avancé que Cas9, ce qui en fait un outil d'édition du génome potentiellement important à l'avenir ( Zaidi et al, 2017 ). Le Cas12a de Francisella novicida(FnCas12a) et son orthologue de Bactérie Lachnospiraceae (LbCas12a) et Acédomocoque sp. BV3L6 (AsCas12a) a été utilisé pour introduire des mutations ciblées dans de nombreuses cultures ( Endo et al, 2016 ). Des rapports émergents ont déjà démontré l'adaptation réussie du système CRISPR/Cas12a dans l'amélioration du riz ( Yin et al, 2017 Li S Y et al, 2018 ). Yin et al (2017) ont utilisé le CRISPR-LbCpf1 pour cibler le gène du développement précoce EPFL9 (Facteur de structuration épidermique like-9), un régulateur positif du développement stomatique du riz. Les plantes mutantes homozygotes présentent une réduction de 8 fois de la densité stomatique sur la surface de la feuille abaxiale. De même, Li S Y et al (2018) ont rapporté que le modèle de réparation du donneur avec uniquement le bras homologue gauche est assez bon pour un remplacement allélique ciblé précis dans le type sauvage OsALS (Acétolactate synthase) gène résultant en des plants de riz résistants aux herbicides. Plus récemment, une évaluation comparative de trois Cas9 (nickase Cas9 D10A, nucléase HiFi Cas9 et nucléase WT Cas9) et de deux nucléases Cas12a (LbCas12a et AsCas12a) a été réalisée pour déterminer leur efficacité de mutation sur un site cible unique du riz. phytoène désaturase(PDS) (Banakar et al, 2020). L'étude a montré que LbCas12a entraîne une suppression entre 2 et 20 pb sans perte du site PAM, conduisant à une efficacité d'édition plus élevée par rapport aux variantes Cas9, ce qui suggère le potentiel de Cas12a pour générer des mutations ciblées spécifiques et héréditaires dans le riz et peut donc être utilisé en tant qu'outil précis d'édition du génome pour les futurs programmes d'amélioration du riz, y compris dans le développement de variétés de riz résistantes aux maladies.

Bien que le remplacement du gène basé sur la RH soit une approche réalisable avec CRISPR/Cas9 et CRISPR/Cas12a, l'efficacité de la livraison de l'ADN matrice et de l'insertion de la cible est significativement faible. Pour surmonter ce problème, la technologie de l'éditeur de base est apparue comme une approche nouvelle et avancée pour des substitutions de nucléotides précises de manière programmable sans l'exigence d'un DSB ou d'un modèle de donneur (Fig. 1-B) ( Komor et al, 2016 ). Les éditeurs de base comprennent un domaine CRISPR/Cas9 catalytiquement inactif (dCas9 ou Cas9 nickase) et un domaine cytosine ou adénosine désaminase qui convertit une base en une autre. Ceux-ci sont capables de faire des variations ou des substitutions à base unique sans créer de DSB dans l'ADN cible, limitant ainsi la fréquence des InDels. Récemment, le système d'édition de base a été utilisé efficacement pour créer des mutations ponctuelles ciblées sur plusieurs loci endogènes dans le riz et le blé (Li C et al, 2018). Plus récemment, rBE5 (hAID* ∆ -XTEN-Cas9n-UGI-NLS) l'éditeur de base a été utilisé pour cibler Pi-d2, un gène du riz important en agriculture qui abrite une mutation ponctuelle modulant la réponse de défense au champignon de la pyriculariose du riz ( Ren et al, 2018 ). Les éditeurs de bases de cytosine et d'adénine ont également été utilisés efficacement pour une modification précise des bases (C à T ou A à G) dans les génomes eucaryotes ( Zong et al, 2017 Hua et al, 2018 Qin et al, 2019 ). Les boîtes à outils d'édition de base ont été efficacement optimisées et démontrées dans plusieurs cultures, notamment le riz, le blé, le maïs et la tomate ( Lu et Zhu, 2017 Zong et al, 2017 Li C et al, 2018 Tang et al, 2019 ). Au fil du temps, une large gamme de variantes d'éditeurs de base d'adénine (ABE) et d'éditeurs de base de cytidine (CBE) ont été développées pour une modification efficace de la base spécifique à une cible (Mishra et al, 2020). De plus, une édition précise des bases dans l'ARN a été réalisée en utilisant un Cas13 catalytiquement inactif (dCas13) en association avec l'adénosine désaminase agissant sur l'ARN (ADAR) pour diriger la conversion de l'adénosine en inosine ( Cox et al, 2017 ). Cas13 est une RNase guidée par l'ARN liée à CRISPR de type IV, tandis que les ADAR assurent l'édition précise des transcrits (Nishikura, 2010). Ensemble, ils ont été utilisés pour développer un système d'édition d'ARN nommé RNA Editing for Programmable A to I Replacement (REPAIR) qui a une applicabilité significative pour la recherche en thérapeutique et en biotechnologie (Staforst et Schneider, 2012). Cependant, il n'est pas encore utilisé dans le système végétal.

L'édition traditionnelle du génome, y compris le système CRISPR/Cas9, implique la livraison de cassettes d'ADN codant pour les machines d'édition dans le génome hôte. Souvent, l'intégration aléatoire de la cassette d'édition entraîne des modifications génétiques indésirables et des effets hors cible ( Zhang et al, 2018 ). De plus, l'introduction d'une cassette d'édition dans le génome hôte soulève des préoccupations éthiques et réglementaires (Jones, 2015). Par conséquent, les scientifiques s'alignent de plus en plus sur l'utilisation de technologies d'édition du génome sans ADN afin de minimiser la probabilité de mutations hors cible. L'édition du génome sans ADN utilise les complexes ribonucléoprotéines (RNP) CRISPR/Cas qui sont délivrés dans la cellule par transformation de protoplastes ou bombardement de particules conduisant à une modification de l'ADN cible. CRISPR-RNP est un assemblage d'ARN guide spécifique de CRISPR et de protéine Cas9 formant ensemble un complexe enzymatique actif ( Zhang et al, 2018 ). Les premières plantes sans ADN éditées sur le génome ont été obtenues en transfectant les RNP CRISPR/Cas dans le protoplaste de Arabidopsis, tabac, laitue et riz ( Woo et al, 2015 ). De même, l'édition sans ADN par bombardement de particules à l'aide des RNP CRISPR-Cas9 a été démontrée avec succès dans le maïs ( Svitashev et al, 2016 ), le blé ( Liang et al, 2017 ) et le riz ( Toda et al, 2019 ). Dans le riz, les RNP Cas9-gRNA ont été directement délivrés dans les tissus zygotiques avec une efficacité de mutation de 14 % à 64 % ( Toda et al, 2019 ). Dans le maïs, les RNP CRISPR/Cas9 ont été utilisés pour générer à la fois des mutants knock-out et knockin ( Svitashev et al, 2016 ).

De plus, les CRISPR/Cas-RNP ont une efficacité d'édition relativement élevée et de faibles mutations hors cible par rapport au système CRISPR/Cas ( Liang et al, 2017 Toda et al, 2019 ). Dans une autre étude, l'édition de base a été combinée avec le système d'édition sans ADN pour faciliter une fréquence plus élevée de conversion de C en T (1,8 %) chez le blé ( Zong et al, 2018 ). Dans l'ensemble, ce système d'édition précise sans transgène a un énorme potentiel pour l'amélioration du riz ainsi que d'autres espèces de cultures importantes. Bien que l'utilisation des RNP CRISPR/Cas en soit encore à ses balbutiements, elle peut être explorée efficacement pour accélérer la sélection des cultures de riz et les produits édités peuvent être plus largement acceptés par le public en surmontant les obstacles réglementaires en matière de biosécurité.

Au cours de la seconde moitié du 19e et du début du 20e siècle, la sélection de la résistance de l'hôte a joué un rôle central dans l'amélioration du rendement et d'autres caractéristiques agronomiques du riz, répondant ainsi aux défis de nourrir la population mondiale croissante. Cependant, les méthodes traditionnelles de sélection de résistance sont coûteuses et prennent du temps, et parfois l'allèle de résistance influence la croissance et le développement des plantes ( Miah et al, 2013 ). Des études génétiques et génomiques approfondies ont révélé des détails moléculaires importants sur l'immunité innée du riz, y compris un grand nombre de cibles pour le contrôle et l'inhibition de l'infection pathogène. Alors que les plantes ont développé une résistance (R) gènes qui peuvent neutraliser les protéines ou effecteurs de virulence dérivés d'agents pathogènes et activer l'immunité déclenchée par les effecteurs, ils ont également une sensibilité (S) gènes qui sont essentiellement impliqués dans la réussite d'une infection pathogène. Dans le contexte de l'édition du génome, la principale stratégie de résistance aux maladies consiste à éliminer ces Spar la réparation basée sur la voie NHEJ sujette aux erreurs de l'ADN cible (Fig. 2-A). Alternativement, frapper R L'allèle du gène au site cible d'intérêt via le mécanisme HR a le potentiel de développer une résistance dans les génotypes sensibles largement acceptés (Fig. 2-B et -C). De plus, les allèles de certains R et Sles gènes varient au niveau d'un seul nucléotide. Ainsi, une édition précise par le biais d'un remplacement ciblé ou d'une édition de base peut générer des variantes alléliques pour la résistance aux maladies (Fig. 2-B et -D). Là encore, les plates-formes d'édition peuvent être utilisées pour induire une résistance aux maladies en modifiant le cis-régions régulatrices des gènes cibles et des loci de caractères quantitatifs. Plus d'une centaine de mutations régulatrices ont été réalisées chez la tomate SlCLV3 promoteur utilisant un système CRISPR/Cas9 ( Rodriguez-Leal et al, 2017 ). De telles modifications peuvent entraîner une évaluation systématique des cis-des régions régulatrices avec des traits résistants, qui peuvent améliorer la sélection rizicole (Fig. 2-D). Édition simultanée de plusieurs Sdes gènes ou des éléments régulateurs via une plate-forme d'édition multiplex (Fig. 2-E) peuvent essentiellement entraîner une résistance à la maladie à large spectre. Plusieurs sgRNA pilotés par des promoteurs indépendants peuvent être multiplexés en un seul vecteur d'expression Cas9 ou Cpf1/sgRNA à l'aide du clonage Golden Gate ou de la méthode d'assemblage Gibson ( Silva et Patron, 2017 ). Wang et al (2017) ont démontré la faisabilité de l'édition de gènes multiplex à l'aide du système CRISPR/Cpf1. L'avènement de plusieurs plateformes d'édition a facilité une ou plusieurs de ces stratégies de développement de résistances contre le stress biotique dans les cultures en particulier dans le riz ( Mishra et al, 2018 Yin et Qiu, 2019 ). L'application des outils CRISPR/Cas a été principalement explorée dans le riz contre l'infection virale, suivie d'efforts pour améliorer la résistance aux maladies fongiques et bactériennes (tableau 1). Des études récentes démontrant la puissance de la technologie d'édition du génome dans l'établissement de la résistance à ces catégories d'agents pathogènes sont discutées ci-dessous.

Tableau 1. Liste des gènes ciblés par les outils d'édition du génome pour la résistance aux maladies du riz.
Point de vue pathogèneGène cibleOutil d'éditionFonctionRéférence
Résistance à l'infection bactérienneOsSWEET13TALENSRésistance améliorée au BLB Li et al, 2012
OsSWEET13TALENSRésistance améliorée au BLB Zhou et al, 2015
OsSWEET13TALENSRésistance améliorée au BLB Blanvillain-Baufume et al, 2017
Os09g29100TALENSRésistance améliorée au BLB Cai et al, 2017
Os8N3(OsSWEET11)CRISPR/Cas9Résistance améliorée au BLB Kim et al, 2019
OsSWEET11et OsSWEET14CRISPR/Cas9Résistance à large spectre au BLB Xu et al, 2019
OsSWEET11, OsSWEET13etOsSWEET14CRISPR/Cas9Résistance à large spectre au BLB Olivia et al, 2019
Résistance aux infections fongiquesOsERF922CRISPR/Cas9Résistance accrue à la maladie du blast Wang et al, 2016
OsSEC3ACRISPR/Cas9Résistance accrue à la maladie du blast Ma et al, 2018
OsPFT1CRISPR/Cas9Résistance à la brûlure de la gaine du riz Shah et al, 2019
Résistance à l'infection viraleeIF4GCRISPR/Cas9Résistance accrue à la maladie de la tungro Macovei et al, 2018

TALENs, Transcription activator-like effector nucleases CRISPR/Cas9, Cluster régulièrement intercalé de courtes répétitions palindromiques/Cas9 BLB, Brûlure bactérienne des feuilles.

Brûlure bactérienne des feuilles (BLB), causée par γ -proteobacterium Xanthomonas oryzaepv. oryzae (Xoo), est l'une des maladies vasculaires les plus destructrices du riz, en particulier dans les principales régions rizicoles d'Asie du Sud-Est et d'Afrique subsaharienne. Il est à lui seul responsable de plus de 75 % des pertes de rendement avec des millions d'hectares de riz touchés chaque année ( Varshney et al, 2019 ). L'identification de plants de riz génétiquement résistants et leur utilisation dans la sélection assistée par génomique ont été la méthode la plus efficace pour développer Xoo variétés résistantes. Cependant, l'émergence de nouvelles Xoo types a été le plus grand défi dans le contrôle de la maladie. Les Xoo la pathogénicité du riz est principalement établie par l'injection de protéines de liaison à l'ADN appelées TALE qui se lient aux éléments de liaison effectrice (EBE) dans les promoteurs de la S gènes dans le riz ( Cohn et al, 2014 ). Les TALE ciblent généralement la famille de gènes SWEET transportant le sucre dans le riz, qui est principalement responsable de la libération du sucre dans l'apoplaste en tant que nutrition du Xoo pathogènes ( Cohn et al, 2014 ). Plusieurs TALE dont AvrXa7, TalC, Tal5 et PthXo3 trouvés dans différents Xoo les souches ciblent toutes le Os11N3 (aussi connu sous le nom OsSWEET14) dans le riz et ont donc été considérés comme les principaux facteurs de susceptibilité associés à l'infection par le mildiou bactérien ( Antony et al, 2010 Li et al, 2012 Hutin et al, 2015 ). L'édition médiée par TALEN entraîne le développement des mutations souhaitées dans le Os11N3région promotrice contenant un EBE pour AvrXa7, qui chevauche un autre EBE pour PthXo3. Les plants de riz modifiés avec la mutation homozygote souhaitée pour la délétion de 4 ou 9 pb sur le site cible sont très résistants à la brûlure bactérienne (Li et al, 2012). Zhou et al (2015) ont également signalé l'identification d'un autre gène transporteur de saccharose OsSWEET13 comme facteur de susceptibilité à la maladie pour PthXo2 TALE (transscription activator-like effector) dépendant Xoo souche, et a également identifié que la souche dépendante de PthXo2 induit OsSWEET13 expression spécifiquement dans indica riz IR24 en raison de la présence d'un mystérieux site de liaison effecteur, qui n'est pas présent dans les allèles de japonica riz Nipponbare et Kitaake. Dans une autre étude, une délétion naturelle de 18 pb dans O. barthii et O. glaberrima espèces de riz sauvage devraient empêcher la liaison des TALE connus pour cibler OsSWEET14et confèrent une résistance au BLB ( Hutin et al, 2015 ). L'allèle, nommé commexa41(t), résiste à la moitié des Xoo souches. Plus récemment, Blanvillain-Baufume et al (2017) ont utilisé les constructions TALEN pour développer une bibliothèque d'allèles de la OsSWEET14 région promotrice dans le riz pour évaluer le niveau de sensibilité des lignées de riz éditées portant des mutations dans les EBE d'AvrXa7, Tal5 et TalC. Et, les lignées de riz avec perturbation des EBE AvrXa7 et Tal5 entraînent une résistance à Xoosouches qui dépendent des TALE correspondants.

Perturbation médiée par CRISPR/Cas9 des EBE TALE de deux gènes de susceptibilité, OsSWEET11 et OsSWEET14, dans la variété de riz Kitaake a été tenté de faciliter la résistance à large spectre BLB chez le riz ( Xu et al, 2019 ). L'un des mutants du riz MS14K démontre une résistance à large spectre à la majorité des Xoo souches. De plus, deux TALE de type PthXo2 sont identifiés comme des facteurs de virulence majeurs dans le Xoosouches. Comme les TALE PthXo2 ciblent principalement le gène de susceptibilité OsSWEET13/Xa25, une analyse des variantes de l'EBE dans le OsSWEET13 promoteur sur 3 000 variétés de riz a révélé la présence d'au moins 10 Xa25-comme des haplotypes. La stratégie CRISPR/Cas9 a également été utilisée pour introduire les InDels dans l'EBE du OsSWEET13 promoteur de la MS14K et une nouvelle lignée de riz avec trois OsSWEET EBE édités ont entraîné une résistance à large spectre contre tous les tests Xoo souches ( Xu et al, 2019 ). Cela suggère que l'ingénierie du génome des loci co-évolués du facteur de susceptibilité TALE est cruciale pour prévenir la susceptibilité déclenchée par les effecteurs, réalisant ainsi une résistance à large spectre BLB.

Récemment, Kim et al (2019) ont utilisé le système CRISPR/Cas9 pour éliminer le riz Os8N3 (aussi connu sous le nom OsSWEET11) qui agit comme un facteur de susceptibilité pour le Xoo souches portant l'effecteur TAL PthXo1. Modifications souhaitées dans Os8N3sont transférés de manière stable dans T0, T1, T2 et T3 générations sans l'ADN transféré (ADN-T) par ségrégation génétique. Non seulement les mutants homozygotes ont montré une résistance significativement accrue à Xoo souche, l'édition de Os8N3 n'a pas non plus affecté les traits agronomiques et la viabilité du pollen dans les lignées mutantes. Olivia et al (2019) ont séquencé 856 TALE sur plusieurs Xoo isolats d'Asie et d'Afrique ciblant distinctement les promoteurs de plusieurs gènes OsSWEET (DOUX11, DOUX13 et DOUX14) et a trouvé la complexité impliquée dans le développement de lignées de riz insensibles à TALE. Pour surmonter cette difficulté, un système d'édition du génome médié par CRISPR/Cas9 est utilisé pour introduire des mutations au niveau des promoteurs des trois gènes SWEET dans les EBE reconnus par diversXoo Contes. Les analyses de séquence révèlent plusieurs variantes de TALE pour DOUX13 et DOUX14 allèles. L'introduction d'au moins cinq mutations du promoteur SWEET dans les accessions de riz Kitaake, IR64 et Ciherang-Sub1 a entraîné une résistance vigoureuse et à large spectre au BLB. Plus récemment, Zhang Q W et al (2020) ont facilité une amélioration significative de la réponse du riz au pathogène BLB grâce à l'utilisation d'une boîte à outils de fusion exonucléase T5 (T5exo)-Cas. Par rapport à CRISPR/Cas9, T5exo-Cas9 ou -Cas12a entraîne des mutations de délétion plus importantes sur le site ciblé de l'UPTPthXo1(régulée à la hausse par l'effecteur de type activateur de transcription PthXo1) de la boîte OsXa13 promoteur de gène dans des plants de riz modifiés. L'analyse phénotypique a révélé que les plants de riz édités par T5exo-Cas9 ou -Cas12a présentaient une réduction significative de la longueur des lésions et une amélioration de la résistance au BLB par rapport à ceux édités par CRISPR/Cas9 ou CRISPR/Cas12a, ce qui pourrait être associé au facteur que T5exo -Cas9 induit des délétions plus importantes au cis-élément régulateur ( Zhang Q W et al, 2020 ).Toutes ces études indiquent clairement que l'édition du génome du riz, en particulier avec le système CRISPR/Cas, a contribué de manière significative à conférer une résistance à large spectre au BLB, et ces stratégies peuvent être utilisées efficacement dans les programmes d'amélioration des cultures assistées par génomique non transgénique.

Plus de 30% des maladies des plantes sont causées par des phytopathogènes fongiques ( Giraud et al, 2010 Sharma et al, 2012 ). Explosion du riz causée par le champignon filamenteux hémibiotrophe Magnaporthe oryzaeest la maladie la plus répandue et la plus dévastatrice du riz. Il s'agit d'une difficulté récurrente pour le riz de plateau comme pour le riz de plaine qui est très vulnérable à ce phytopathogène fongique depuis le stade plantule jusqu'au stade adulte. L'apparition fréquente de nouvelles races d'agents pathogènes de la pyriculariose a entraîné plus de 30 % des pertes de la production mondiale de riz, ce qui est suffisant pour nourrir 60 millions de personnes ( Nalley et al, 2016 ). L'utilisation de cultivars résistants à la pyriculariose a été la mesure la plus efficace pour la gestion des agents pathogènes de la pyriculariose. À ce jour, plus de 100 explosions majeures R gènes ont été identifiés et 30 d'entre eux ont été clonés moléculairement ( Xiao et al, 2019 ). Explosion majeure Rgènes, y compris Pita/Pi-ta2, Piz, Pi-b et Pi-k/h/m/sont été déployés en combinaison avec des programmes de sélection assistée par génomique et transgéniques pour le développement de génotypes résistants dans les régions productrices de riz (Li Y et al, 2016). Par exemple, le riz récemment identifié Pigm Le locus est constitué d'un groupe de gènes codant pour les récepteurs NBS-LRR (répétition riche en leucine du site de liaison des nucléotides) qui confère une résistance au champignon blastique M. oryzae sans compromettre le caractère de rendement. Le locus est caractérisé par une paire de paires antagonistes régulées épigénétiquement de récepteurs NBS-LRR, PigmR et PigmS. Tandis que PigmR facilite la résistance à large spectre, PigmS empêche PigmR homodimérisation pour supprimer la résistance et augmenter à son tour la production de graines ( Deng et al, 2017 ). De même, une seule modification de base dans la région régulatrice de bsr-d1 induit une résistance à la pyriculariose chez le riz ( Li et al, 2017 ). Cependant, le défi actuel réside dans le développement d'une collection de gènes de résistance aux blastes qui peuvent être utilisés contre les souches en constante évolution et variées de M. oryzae. Par conséquent, des outils d'édition du génome précis sont le besoin de l'heure pour la mise en œuvre d'une résistance efficace des plantes chez le riz.

Une résistance accrue à la pyriculariose a été démontrée chez le riz en ciblant le gène du facteur de transcription de réponse à l'éthylène OsERF922 via le knock-out ciblé CRISPR/Cas9 ( Wang et al, 2016 ). Des mutations InDel induites par CRISPR/ Cas9 sont signalées dans le gène ciblé avec une fréquence de mutation allant jusqu'à 42 % dans le T0 génération. Les mutations alléliques sont transmises de manière stable aux générations suivantes. Dépistage de la résistance aux explosions chez six T homozygotes mutés2révèle des lésions significativement plus faibles par rapport aux plantes de type sauvage aux stades plantule et tallage. De plus, aucune différence significative n'est observée dans les performances agronomiques des mutants, suggérant qu'une édition précise ne modifie pas d'autres traits importants des plantes. De plus, l'utilisation de plusieurs constructions CRISPR/Cas9 (Cas9/multi-target-sgRNA) pour cibler plusieurs sites au sein OsERF922 locus entraîne un nombre plus élevé de mutants. Ceux-ci suggèrent que le ciblage médié par CRISPR/Cas9 de plusieurs sites a le potentiel d'augmenter l'efficacité de la mutation, améliorant ainsi la résistance à la pyriculariose du riz. CRISPR/Cas9 SSN a été utilisé pour perturber OsSEC3A, un gène codant pour une protéine de sous-unité d'exocyste pour explorer son rôle fonctionnel dans l'immunité des plantes ( Ma et al, 2018 ). OsSEC3A a déjà été impliqué dans l'allongement des poils absorbants, la germination du pollen et la réponse de défense chez d'autres espèces végétales ( Bloch et al, 2016 ). Deux sgRNA sont conçus pour cibler les troisième et dixième exons du OsSEC3A gène. Le mutant induit par CRISPR/Cas9 présente des réponses immunitaires améliorées couplées à une expression régulée à la hausse des protéines liées à la pathogenèse, des gènes de synthèse de l'acide salicylique, des niveaux accrus d'acide salicylique et une résistance améliorée au pathogène de la pyriculariose du riz M. oryzae. Cependant, les lignées mutantes présentent également des caractéristiques de croissance et agronomiques modifiées, notamment une stature naine, des semis plus petits, des racines principales plus courtes et une hauteur de plante réduite ou altérée, la longueur de la panicule, le nombre de talles, le poids de 1000 grains et la fertilité des épillets par rapport au type sauvage. De multiples approches de la résistance à la pyriculariose du riz peuvent être fructifiées grâce à l'édition précise de gènes multifonctionnels associés à la signalisation de défense chez le riz. Récemment, CRISPR/Cas9 a également été adopté pour induire des mutations dans le motif riche en proline de Pi21 pour la résistance du riz contre M. oryzae (Li et al, 2019). Le vecteur CRISPR/ Cas9 a été conçu pour faciliter la mutation ciblée simultanée du mâle stérile thermosensible 5 (TMS5), explosion de riz S gène pi21 et BLB S gène xa13 dans la variété de riz Pinzhan ( Li et al, 2019 ). Trois des mutants générés avec des mutations homozygotes de décalage du cadre de lecture sur les trois gènes (tms5/pi21/xa13) présentent des caractéristiques de stérilité mâle génique thermosensible avec une résistance accrue aux infections de M. grisea et Xoo souche PXO99 ( Li et al, 2019 ), accélérant ainsi considérablement le processus de sélection du riz hybride.

La brûlure de la gaine du riz, causée par Rhizoctonia solaniKuhn [stade téléomorphe, Thanatephorus cucumeris(Frank) Donk], est la deuxième maladie fongique du riz après la pyriculariose, qui entraîne une perte de rendement de l'ordre de 8 à 50 % dans les pays rizicoles tropicaux du monde ( Savary et al, 2000 ). L'édition CRISPR/ Cas9 a récemment été tentée pour modifier Oryza sativa Phytochrome et Floraison 1 (OsPFT1) pour comprendre son rôle fonctionnel dans la résistance à la brûlure de la gaine du riz ( Shah et al, 2019 ). Arabidopsis PFT1 est fortement impliqué dans l'induction de la susceptibilité aux maladies en agissant comme un adaptateur universel entre l'ARN polymérase II et les facteurs de transcription liés à l'ADN 2 ème référence dans la liste de REFERENCE Thatcher et al, 2009 ). Les constructions CRISPR/Cas9 ont été mobilisées dans le indica variété de riz ASD16 via Agrobactérie- la transformation médiée qui a facilité la mutation dans le PFT1 lieu. Cependant, l'efficacité de la mutation et l'affinité de résistance aux maladies des lignées de riz éditées restent à déterminer.

Les maladies virales constituent également une contrainte mondiale majeure dans les efforts visant à augmenter la productivité du riz. Parmi les différentes infections virales, la maladie de la tungro du riz affecte gravement la production de riz sur environ 3,5 millions d'hectares dans les principaux pays asiatiques producteurs de riz ( Chancellor et al, 2006 ). La maladie est essentiellement causée par l'interaction de deux virus différents, à savoir le virus sphérique du tungro du riz (RTSV) avec un génome à ARN simple brin et le virus bacilliforme du tungro du riz (RTBV), avec un génome à ADN double brin (Hull, 1996). Le RTBV développe les principaux symptômes de la maladie et propage la maladie en facilitant la transmission du RTBV par les espèces de cicadelles vertes telles que Nephotettix virescenset N. nigropictus (Hibino et Kabauatan, 1987). Les programmes d'amélioration de la résistance de l'hôte par le criblage d'énormes collections de matériel génétique de riz ont abouti à l'identification de plusieurs variétés de riz présentant une résistance spécifique à l'un ou aux deux virus ( Khush et al, 2004 ). Recherche moléculaire concentrée dans un indica La variété de riz Utri Merah a démontré que la résistance au RTSV est contrôlée par la présence d'un polymorphisme ou délétion d'un seul nucléotide affectant les résidus d'acides aminés du YVV dans le facteur d'initiation de la traduction quatre gamma (eIF4G) ( Lee et al, 2010 ). En tant que tel, il est essentiel de développer une variété résistante au RTSV pour empêcher la propagation secondaire de cette maladie. Récemment, l'édition du génome CRISPR/Cas9 a été utilisée avec succès pour muter eIF4G dans la variété de riz sensible au RTSV, IR64, pour développer de nouvelles sources de résistance au RTSV ( Macovei et al, 2018 ). Une fréquence de mutation allant de 36 % à 86 % est réalisée et les mutations induites sont transmises à la génération suivante sans modifications détectables dans les sites hors cible les plus proches. L'analyse des séquences et le test d'infection par des agents pathogènes ont révélé que la mutation dans le cadre des résidus d'acides aminés adjacents aux résidus de YVV confère une résistance accrue au RTSV ainsi que des paramètres agronomiques améliorés tels que la hauteur de la plante et le rendement en grains. Les mutants stables peuvent être libérés dans les zones sujettes à la maladie de la tungro du riz comme source alternative de résistance au RTSV pour contrôler l'infection et améliorer la productivité du riz.

Bien que les approches d'édition du génome dépendent de la mutation ciblée de S gènes vers l'introduction de la résistance aux maladies chez les plantes, cela pourrait entraîner un coût de remise en forme. Frapper à la porte S Les gènes, qui codent pour les protéines responsables des structures de pré-pénétration, de la suppression des défenses et des mécanismes de réplication, peuvent entraîner des anomalies phénotypiques et des carences nutritionnelles pouvant affecter la croissance et le développement des plantes (van Schie et Takken, 2014). Alors que les mutants de riz OsSWEET induisent une résistance en raison de la disponibilité limitée de sucre pour le pathogène BLB, cela pourrait également entraîner une réduction de la taille de la plante et un avortement du pollen ( Chu et al, 2006 ). Cela pourrait être atténué par une édition ciblée de différentes régions promotrices de la S ont été démontrés pour les gènes SWEET dans le riz ( Blanvillain-Baufume et al, 2017 ). Alternativement, au lieu d'assommer complètement un Sgène, la résistance aux maladies peut également être développée en introduisant des variantes synthétiques de S gène identique à l'allèle qui se produit naturellement dans les génotypes résistants ( Bastet et al, 2017 ). Un tel nouvel allèle peut induire une résistance des plantes et en même temps démontrer des fonctions protéiques normales sans coût de développement. En outre, les outils d'édition de base récemment développés peuvent également être utilisés pour une introduction précise de transitions de base uniques dans certains S gènes, qui ne varient qu'au niveau du polymorphisme d'un seul nucléotide. De plus, la disponibilité de plusieurs promoteurs inductibles par des agents pathogènes et d'éléments régulateurs dans les plantes peut être ciblée à l'aide d'un système CRISPR induit par un agent pathogène pour l'arrêt transitoire de la S gène sans compromis dans leurs rôles de remise en forme. Un tel système de vecteur CRISPR qui peut exploiter le promoteur inductible du pathogène pourrait être conceptualisé pour démontrer son efficacité vis-à-vis de la résistance aux maladies dans les grandes cultures. Au contraire, l'introduction d'une séquence de conception personnalisée dans le génome sera plus appropriée lorsque des variantes alléliques spécifiques sont impliquées dans la réponse de résistance. Un système CRISPR couplé au dispositif RH peut étendre indéfiniment la possibilité d'intervenir R allèle du gène dans le site cible de choix pour développer une résistance aux maladies. Bien que les RH soient encore techniquement difficiles dans les usines en raison de leur faible efficacité et du manque de protocoles de multiplexage, les boîtes à outils CRISPR doivent être conçues et analysées pour étendre leurs applications dans la sélection de résistance pour l'amélioration du riz.

Cette recherche a été soutenue par le Programme prioritaire chinois - Sélection de sept grandes cultures (Grant No. 2017YFD01100100), le Programme d'innovation de l'Académie chinoise des sciences agricoles (Grant No. 01-ICS) et le Talented Young Scientist Program of China (Grant No. Inde-17-01). Nous remercions le Dr Muktikanta Mishra, président, Centurion University of Technology and Management pour ses encouragements et son soutien.


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Techniques utilisées dans le & expérimental

Les applications expérimentales comprennent :

  1. Découverte de médicaments/Identification des cibles
  2. Identification de biomarqueurs
  3. Microbiologie
  4. Virologie
  5. Bioinformatique/Systématique
  6. Biotechnologie
  7. Clonage recombinant
  8. Génomique
  9. La génétique
  10. Médecine légale

Les applications cliniques comprennent :

  1. Diagnostic médical
  2. Médecine personnalisée/Décisions du patient
  3. Pharmacogénomique
  • lors de l'ajout d'un autre nucléotide, l'ADN polymérase rompra la liaison entre le premier et le deuxième phosphate du désoxynucléoside triphosphate
  • le nucléotide entrant est ensuite joint à l'hydroxyle 3' libre de la chaîne d'ADN en croissance

Séquençage d'ADN fluorescent automatisé

  • utilise 4 colorants fluorescents différents, un pour chacune des 4 bases
  • Les 4 réactions sont exécutées dans une seule voie du gel puisque les 4 bases se distinguent facilement par leurs couleurs
  • aka Séquençage par Oligonucléotide Array
  • cela montre une matrice d'oligonucléotides qui a toujours une combinaison de 4 paires de bases possible
  • le fragment d'ADN inconnu est marqué par fluorescence et autorisé à s'hybrider à tous les oligonucléotides possibles sur la puce
    • le premier spot qui s'est hybridé à l'ADN inconnu a la séquence ATCG
    • le deuxième spot qui s'est hybridé a la séquence CTGG
    • le troisième spot qui s'est hybridé a la séquence TGGC

    un ordinateur les assemblera dans le bon ordre de chevauchement

    la séquence est ensuite déterminée sur la base de ces informations 5. Pyroséquençage

    • Au cours de chaque réaction de séquençage, l'ADN est allongé d'un nucléotide et du pyrophosphate est libéré
    • Le pyrophosphate est utilisé avec l'adénosine phosphosulfate (APS) par l'ATP sulfurylase pour générer de l'ATP. La luciférase utilise l'ATP + la luciférine et émet de la lumière (fluorescence)
    • Apyrase élimine les triphosphates inutilisés
    1. Séquençage de nouvelle génération
    • A augmenté les vitesses de lecture des résultats et réduit les coûts
    • Un grand nombre d'échantillons peuvent être côte à côte dans le même appareil
    • L'ADN génomique pur peut être utilisé comme modèle
    • Quelles sont les principales méthodes ?
    1. 454 Séquençage : utilise le pyroséquençage pour déterminer quel nucléotide est ajouté par l'ADN polymérase

    cela indique à l'expérimentateur que l'ADN inconnu a été complètement croisé et est maintenant entièrement séquencé.

    1. Séquençage Illumina/Solexa : utilise des terminateurs de colorant réversibles pour identifier le nucléotide ajouté par l'ADN polymérase
    1. Détection d'ADN nanopore
      • La membrane nanopore sépare deux compartiments de charge différente

    Les molécules chargées négativement (c'est-à-dire l'ADN) peuvent traverser le pore dans une formation étendue

    un détecteur mesure la quantité de courant, due au flux d'ions normal, est réduite - puisque chaque base modifie le courant de différentes quantités, le détecteur peut déterminer la séquence lorsque l'ADN passe à travers le pore


    Voir la vidéo: Les enzymes de restriction Biochimie. Biologie Moléculaire (Janvier 2022).