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10 : Purification des protéines - Biologie

10 : Purification des protéines - Biologie


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Lecture et problèmes: LNC p. 15, 16

I. Electrophorèse sur gel - utilisation d'un courant électrique pour déplacer des molécules en phase solvant à travers une matrice de gel. Les gels peuvent être constitués de plastiques hydrophiles (par exemple le polyacrylamide) ou de glucides (par exemple l'agarose - un polysaccharide à longue chaîne purifié à partir d'algues marines).

B. Electrophorèse à focalisation isoélectrique (IEF) - les polyampholytes établissent un gradient de pH et les protéines sont séparées en fonction du pI.


Un exemple de polyampholyte qui peut être utilisé dans l'IEF (les parenthèses indiquent les nombres variables et l'ordre des groupes).

II. Méthodes générales de chromatographie sur colonne.

A. Filtration sur gel - sépare par taille. Les grosses molécules sont exclues des pores des billes et s'écoulent rapidement (la "fraction exclue"), les petites molécules pénètrent dans les billes, retardant leur écoulement, et elles se déplacent lentement (la "fraction incluse").

B. Échange d'ions - utilisé pour les protéines comme pour les acides aminés, se sépare par charge/pI. Les colonnes peuvent être chargées négativement ou positivement et peuvent être éluées avec des changements de pH ou de concentration en sel ou une combinaison.

C. Phase inverse - se sépare par hydrophobie. Les groupes hydrophobes sur les billes lient les régions hydrophobes des protéines. Les colonnes sont éluées en augmentant la concentration en sel ou en augmentant la concentration de solvant organique (par ex. acétonitrile, méthanol, propanol, tétrahydrofurane) dans la solution.

Certaines informations à emporter :

Procédures analytiques: effectué lorsque vous voulez déterminer "ce qu'il y a dans un échantillon". Les propriétés souhaitables d'une telle procédure comprennent :

  • Haute résolution (vous pouvez donc séparer des molécules avec des propriétés légèrement différentes)
  • Haute sensibilité (vous n'avez donc pas besoin d'utiliser beaucoup d'échantillons pour obtenir les informations souhaitées)
  • Possibilité de traiter plusieurs échantillons en parallèle (vous pouvez donc obtenir plus d'informations à partir d'une seule expérience)

Les méthodes d'électrophorèse sont couramment utilisées pour l'analyse en raison de leur haute résolution, de leur sensibilité élevée et de la nature parallèle des méthodes sur gel, mais les méthodes modernes sur colonne peuvent également avoir une résolution suffisante et peuvent souvent être plus facilement adaptées à l'analyse automatisée des échantillons.

Procédures préparatoires : effectué lorsque vous souhaitez obtenir un échantillon d'un composé particulier purifié à partir d'un mélange. Les propriétés souhaitables comprennent :

  • Capacité élevée (c'est-à-dire capacité à traiter de grandes quantités de matériau, de sorte que vous puissiez obtenir suffisamment de matériau pour une utilisation ultérieure)
  • Facilité d'utilisation du matériau une fois séparé (par exemple, le matériau des colonnes est généralement sous forme liquide qui peut être utilisé directement, alors que les échantillons séparés sur un gel doivent être extraits de la matrice de gel).

Cependant, la capacité doit être équilibrée avec la résolution. Dans certains cas, vous aurez peut-être besoin d'une haute résolution pour obtenir un échantillon suffisamment pur et vous serez peut-être prêt à vous contenter d'une capacité inférieure si vous ne pouvez travailler qu'avec une petite quantité de matériau purifié. Les méthodes sur colonne sont couramment utilisées pour les procédures préparatives, mais lorsque la résolution est critique, une capacité élevée n'est pas nécessaire et/ou une purification parallèle est souhaitée, des méthodes d'électrophorèse préparative peuvent être utilisées.

Contributeurs

  • Charles S. Gasser (Département de biologie moléculaire et cellulaire, UC Davis)


Production et purification de protéines

REMARQUE : Dans la version de cette revue initialement publiée, un auteur (B. Martin Hallberg) a été exclu de la liste des auteurs. Ces informations ont été ajoutées aux versions HTML et PDF de la Revue.

En choisissant une méthode pour produire une protéine recombinante, un chercheur est confronté à un éventail ahurissant de choix quant à l'endroit où commencer. Pour faciliter la prise de décision, nous décrivons une stratégie consensuelle « quoi essayer en premier » basée sur notre analyse collective de l'expression et de la purification de plus de 10 000 protéines différentes. Cette revue présente des méthodes qui pourraient être appliquées au début de tout projet, une liste hiérarchisée de stratégies alternatives et une liste de pièges qui font trébucher de nombreux nouveaux chercheurs.


Un système efficace d'expression et de purification de protéines recombinantes dans Saccharomyces cerevisiae

L'expression et la purification de protéines recombinantes à l'aide de vecteurs bactériens est un système mature et préféré pour obtenir des protéines repliées et stables. Cependant, les modifications fonctionnelles des protéines post-traductionnelles, telles que la glycosylation ou la phosphorylation, ne peuvent être obtenues qu'en utilisant des systèmes d'expression eucaryotes. De plus, l'insolubilité est un autre défi lors de l'utilisation de protéines exprimées dans Escherichia coli, telles que certaines protéines intrinsèquement désordonnées, qui sont plus sujettes à l'agrégation que les protéines repliées. Les systèmes d'expression de protéines eucaryotes, y compris les cellules humaines, les cellules de baculovirus/insectes et la levure, sont devenus indispensables pour la production de protéines eucaryotes fonctionnelles. Cet article décrit un protocole détaillé pour effectuer l'expression des protéines cytosoliques, la purification des protéines et la caractérisation des protéines à l'aide de la levure en herbe Saccharomyces cerevisiae. Le système d'expression et de purification des protéines introduit dans la levure est avantageux en raison du faible coût, du rendement élevé, de la solubilité élevée des protéines et de l'expertise minimale requise. © 2018 par John Wiley & Sons, Inc.


Introduction

La purification des protéines est un sujet important dans le programme de premier cycle en biochimie. Dans un cadre de conférence, une discussion sur les techniques d'échange d'ions, d'exclusion de taille et de purification basée sur l'affinité est courante. En laboratoire, la mise en œuvre d'une ou plusieurs de ces techniques est également courante. Cependant, malgré cette couverture, les étudiants de premier cycle n'ont généralement pas la possibilité d'explorer les paramètres chromatographiques clés, pour un type de support (ou de résine) particulier, qui peuvent affecter la séparation des protéines. Offrir aux étudiants ce genre d'expérience, non disponible à partir d'une itération d'un protocole fourni, améliorerait leur compréhension conceptuelle et leur capacité pratique à exécuter une purification de protéine. Bien que le temps réel du laboratoire ne le permette jamais, une expérience de laboratoire virtuel peut facilement faciliter l'exploration rapide des paramètres chromatographiques. Nous présentons ici un exercice virtuel simple de purification de protéines qui utilise un programme en ligne gratuit et établi 1 . Les principaux objectifs de l'exercice étaient de (1) renforcer les concepts de purification de protéines précédemment appris (en particulier l'échange d'ions) et (2) présenter aux étudiants le pH en tant que paramètre qui affecte la chromatographie d'échange d'anions. Un objectif secondaire était de faire découvrir aux étudiants l'intérêt d'étudier à la fois les milieux d'échange d'anions « forts » (Q) et « faibles » (DEAE) dans le cadre d'une purification de protéines. Nous avons cherché à atteindre ces objectifs grâce à six simulations de purification de protéines qui généreraient des chromatogrammes FPLC réalistes auxquels les étudiants pourraient réfléchir, discuter et interpréter.


Purification des protéines par HPLC

La chromatographie est une technique analytique générale utilisée pour séparer un mélange en ses composants individuels. La chromatographie liquide à haute performance, communément appelée HPLC, a une variété d'applications dans le laboratoire de recherche en biologie chimique.

En biologie chimique, les analytes individuels, tels que les peptides, sont souvent purifiés par chromatographie pour être utilisés comme outil fonctionnel. Chromatographie liquide haute performance (HPLC) est une méthode utilisée pour analyser et séparer des échantillons liquides. Dans les laboratoires de biologie chimique, la HPLC est considérée comme indispensable pour la purification des peptides (synthétisés manuellement ou automatisés avec un synthétiseur) et autres molécules organiques de petite à moyenne taille. Cela vous permet également d'utiliser une taille de particule beaucoup plus petite pour le matériau de remplissage de la colonne, ce qui donne une surface beaucoup plus grande pour les interactions entre la phase stationnaire et les molécules qui la traversent. Cela permet une bien meilleure séparation des composants du mélange.

Il existe de nombreux types de colonnes HPLC développées pour des applications spécifiques telles que la HPLC en phase normale (NP-HPLC) et la HPLC en phase inversée (RP-HPLC). Le bon choix de colonne est essentiel pour obtenir de bons résultats HPLC. Le choix de la colonne est régi par les caractéristiques des composants du mélange que nous souhaitons séparer.

Qu'est-ce que la chromatographie en phase normale (NP-HPLC)

Également connue sous le nom de HPLC en phase normale (NP-HPLC) ou chromatographie d'adsorption, cette méthode sépare les analytes en fonction de leur affinité pour une surface polaire stationnaire telle que la silice, elle est donc basée sur la capacité de l'analyte à s'engager dans des interactions polaires (telles que l'hydrogène -liaison ou interactions de type dipôle-dipôle) avec la surface du sorbant. La NP-HPLC utilise une phase mobile non polaire et non aqueuse et fonctionne efficacement pour séparer les analytes facilement solubles dans les solvants non polaires. L'analyte s'associe et est retenu par la phase stationnaire polaire. Les forces d'adsorption augmentent avec l'augmentation de la polarité de l'analyte. La force d'interaction dépend non seulement des groupes fonctionnels présents dans la structure de la molécule d'analyte, mais également de facteurs stériques. L'effet de l'encombrement stérique sur la force d'interaction permet à cette méthode de résoudre (séparés) les isomères structuraux.

Purification HPLC de protéines et de peptides recombinants

Tout ce qui entre dans la HPLC doit d'abord être filtré, à travers un filtre de 0,45 mm ou 0,2 mm et une verrerie spéciale pour éliminer les particules qui peuvent se coincer dans la colonne et interférer avec l'absorption et la séparation.

La préparation des échantillons

Le peptide brut, préparé par synthèse manuelle ou automatisée, sera fourni sous forme de substance lyophilisée (séchée par congélation sous vide poussé).

Préparation du tampon

Filtrez vos tampons en utilisant la verrerie désignée et en suivant les instructions spécifiques fournies par votre TA. Cela peut être fait avant l'utilisation et les tampons stockés à température ambiante jusqu'à ce que vous soyez prêt à utiliser la HPLC.

Opération HPLC

Votre TA fournira des instructions spécifiques concernant l'utilisation de la HPLC. En règle générale, une analyse commence par la fixation de vos tampons et le lavage de la colonne. Ensuite, laissez la colonne se rééquilibrer aux conditions qui démarreront votre analyse.

Une fois qu'une méthode de séparation spécifique est spécifiée, vous pouvez revoir les paramètres tels que le gradient de débit de la pompe, le temps d'exécution et l'acquisition. Sur certains instruments, vous devrez spécifier la lampe utilisée pour la détection.


Offres spéciales et promotions de produits

Revoir

. comprend des contributions très utiles.- Angewandte Chemie

Ce livre est recommandé pour les chimistes des protéines, qu'ils soient débutants ou professionnels. Il y a quelque chose dans ce livre pour tout le monde. C'est un excellent livre de travail ainsi qu'une excellente référence.-INFORM-American Oil Chemists Society

Recueil pratique de Doonan. se défend contre les méthodes enzymologie [et] les protocoles actuels en science des protéines. sera précieux à garder dans le laboratoire pour la plupart des étudiants diplômés en biochimie, et même pour les praticiens plus expérimentés de la biotechnologie. -Biopharm

Dans l'ensemble, un manuel de banc utilitaire bien présenté et un achat intéressant pour les novices et les praticiens établis-Society for General Microbiology Quarterly


10 : Purification des protéines - Biologie


L'installation de purification des protéines est une station d'apprentissage et une ressource d'information et d'assistance à la disposition des chercheurs et des étudiants ainsi que des sociétés biotechnologiques et pharmaceutiques intéressées par la purification des protéines. Nous fournissons principalement des conseils et un soutien actif aux chercheurs, aux étudiants et aux personnes de l'industrie de la biotechnologie dans la résolution de projets de purification de protéines.
L'installation propose des systèmes de chromatographie liquide complets et entièrement automatisés (AKTA Explorer et AKTA Avant) conçus pour le développement de méthodes et les applications de recherche qui simplifient la transition du laboratoire à la production à grande échelle. Nous avons des colonnes et des résines pour la purification en fonction de la taille, de la charge, de l'hydrophobie et de l'affinité du substrat. De plus, l'Installation est équipée de nombreux autres instruments essentiels à la production et à la caractérisation des protéines : électrophorèse sur gel et appareils de buvardage. Différents systèmes de disruption cellulaire et d'ultrafiltration. Diffusion de la lumière multi-angle (MALS) et indice de réfraction (RI) en ligne avec un système analytique AKTA Pure 25 pour permettre la mesure de la masse molaire absolue, de la taille et de la forme de protéines ou d'autres types de macromolécules pendant la chromatographie d'exclusion stérique (SEC-MALS ) ou chromatographie échangeuse d'ions (IEX-MALS)
Principales compétences et domaines d'intérêt scientifique :

Conception de stratégie de purification en fonction de chaque protéine
Développer, optimiser et mettre à l'échelle des protocoles de purification de protéines à partir d'échantillons de différentes sources (sources naturelles ou recombinantes).
Surmontez le principal goulot d'étranglement dans la détermination de la structure par cristallographie aux rayons X ou RMN qui est la préparation d'échantillons cristallins et homogènes appropriés.
Des centaines de projets différents avec différents groupes académiques et industriels
Isolement et identification des facteurs inconnus
De nombreux cours dans le domaine à l'Université hébraïque, des réunions internationales et pour les entreprises pharmaceutiques

Pour la caractérisation des protéines, en plus de la SDS-PAGE, des gels natifs, nous proposons une chromatographie d'exclusion de taille analytique (SEC) ou une chromatographie d'échange d'ions (IEX) seule ou couplée en ligne à la diffusion de la lumière multi-angles (MALS) et à l'indice de réfraction (RI ) : SEC-MALS et IEX-MALS (nouvelle méthode de caractérisation de protéines ou de macromolécules)
Activement impliqué dans une équipe d'experts de l'Association des ressources pour la recherche biophysique en Europe (ARBRE-MOBIEU) et du Partenariat de production et de purification en Europe (P4EU) en établissant Lignes directrices pour la norme de qualité minimale des protéines. Des règles qui visaient à jeter les bases de la standardisation et de la reproductibilité des données (https://p4eu.org/P4EU-Inhalt/uploads/2018/04/Extended-guideline-7.pdf) (https://p4eu.org/ protéine-qualité-standard-pqs)

Outils pour augmenter la solubilité et/ou la stabilité des protéines ainsi que pour éviter ou réduire l'agrégation
Outils pour replier les protéines et replier sur la colonne
Quelques publications dans le domaine de la production de protéines à tendance agrégée
Nombreuses formations sur le terrain en Rencontres Internationales (PEGS, PepTalk, EMBO) pour le personnel Pharma et Académique


Tube à essai
Élimination des acides nucléiques
Tampon pour la purification de Tag
Nettoyage et régénération des résines
Colonnes
Développement de procédés à haut débit (HTPD)
Purification de grosses biomolécules

Quantification des protéines
Absorbance 280 nm
BCA
Protéines biotinylées
Biuret
Bradford
CBQCA
Comparaison des méthodes>
Coomasie
ALS
Glycoprotéine Glucide.
Substances interférentes
Lowry
Nano-orange
Non-interférant
OPA (fluorescent)
Réactif de préparation
Précipitation des protéines COURS

PAGE-FDS (Laemmli)
Basique-Natif
Acide-Natif
Tricine
Affinité phosphate SDS-PAGE
QPNC-PAGE

Inhibiteurs de l'apoptose
Division cellulaire / Cycle cellulaire / Inhibiteurs d'adhésion cellulaire
Inhibiteurs du signal lipidique
Neurobiologie/ Inhibiteurs de la neurodégénérescence
Oxyde nitrique/inhibiteurs de stress oxydatif
Phosphorilation / Déphosphorilation
Inhibiteurs de la protéase
Autres

Ä KTA Explorer 100 de GE-Healthcare : Deux systèmes réfrigérés et un système en ligne avec détecteur miniDAWN&trade TREOSR et OPTILAB T-rEX-Refractive Index

ÄKTA avant 25 de GE-Healthcare

WYATT miniDAWN&trade TREOSR : Détecteur à diffusion de lumière MALS à triple angle pour la mesure du poids moléculaire absolu, de la taille et de la conformation des macromolécules en solution

Détecteur d'indice de réfraction WYATT OPTILAB T-rEX

ÄKTA Pure M25 de GE-Healthcare en ligne avec détecteur de diffusion de lumière MALS à triple angle et détecteur d'indice de réfraction

Micro-fluidiseur microfluidique (modèle M-110 EHIS) pour rupture de cellule (pdf)
(Unité Interdépartementale d'Instrumentation du LSI)

AVESTIN EmulsiFlex&trade - Homogénéisateur haute pression C3 pour rupture de cellule (pdf)
(Unité Interdépartementale d'Instrumentation du LSI)

Protocoles sélectionnés de l'unité de purification des protéines et autres

Stockage des protéines purifiées

Publications liées à l'unité de purification des protéines

Schwaiger, M., Lebendiker, M., Yerushalmi, H., Coles, M., Groger, A., Schwartz, C., Schuldiner, S. et Kessler, H. (1998).
Recherche par RMN du transporteur multidrogue Emr-E, une protéine membranaire intégrale.
EUR. J. de biochimie 254 : 610-619
. (pdf)

Muth T.R. et Schuldiner S. (2000)
Un glutamate intégré à la membrane est nécessaire pour la liaison du ligand au transporteur multimédicament EmrE.
EMBO J. 19: 234-240
(pdf)

Tate C., Kunji E., Lebendiker M., et Schuldiner S. (2001).
La structure de projection d'EmrE, un transporteur multimédicament lié au proton d'Escherichia coli, à une résolution de 7Å.
Le Journal de l'EMBO 20 : 77-81
(pdf)

Orzech E., Okhrimenko H., Reich V., Cohen S., Weiss A., Melamed-Book N., Lebendiker M., Altschuler Y. et Aroeti B. (2001).
L'adaptateur AP-1 de la couche de clathrine s'associe aux microtubules via des protéines associées aux microtubules.
J. de Biol. Chimie 276 (33) : 31340-31348 (pdf)

Ben-Zimra M, Koler M et Orly J. (2002)
Transcription du cytochrome P450 de clivage de la chaîne latérale du cholestérol dans le placenta : l'activation de la protéine-2 assume le rôle de stéroïdogène
Facteur-1 en se liant à un élément promoteur qui se chevauche.
Mol. Endocrinol.16: 1864-1880 (pdf)

Poisson A, Lebendiker M, Nechushtai R & Livnah O (2003).
Purification, cristallisation et analyse préliminaire aux rayons X de la ferredoxine isolée de la cyanobactérie thermophile Mastigocladus laminosus.
Acta pleure. D-59 : 734-736
(pdf)

Zhang M, Fishman Y, Sher D et Zlotkin E (2003).
L'hydralisine, une nouvelle protéine paralytique et cytolytique sélective de groupe d'animaux d'origine noncnidokystique à Hydra.
Biochimie 42 : 8939-8944
(pdf)

Rosen G, Nisimov I, Helcer M et Sela M (2003)
Actinobacillus actinomycetemcomitans sérotype b Le lipopolysaccharide médie la coagrégation avec Fusobacterium nucleatum.
Infection et immunité 71 (6) : 3652&ndash3656
(pdf)

Listovsky T, Oren Y, Yudkovsky Y, Mahbubani H, Weiss A, Lebendiker M et Brandeis M (2004)
Cdh1/Fzr médie sa propre dégradation
Le Journal EMBO 00 : 1&ndash8
(pdf)

Soskine M, Adam Y et Schuldiner S (2004)
Preuve directe de la libération de protons induite par le substrat dans EmrE solubilisé par détergent, un transporteur de médicaments multiples
J. de Biol. Chimie 279 (11) : 9951-9955 (pdf)

Neubig R, et Roman D, (2004)
Sites d'intérêt sur le World Wide Web
Mol. Interv.4 : 298
(pdf)

Klein S, Geiger T, Linchevski I, Lebendiker M, Itkin A, Assayag K et Levitzki A (2005)
Expression et purification de la PKB kinase active d'Escherichia coli.
Expression et purification des protéines 41 : 162&ndash169
(pdf)

Sher D., Fishman Y., Zhang M., Lebendiker M., Gaathon A., Manchenio J. et Zlotkin E. (2005)
Hydralisines : une nouvelle catégorie de diverses toxines bêta-poreformantes chez les cnidaires. Caractérisation et analyse préliminaire structure-fonction.
J. de Biol. Chimie 280 : 22847 - 22855
(pdf)

Fish A., Danieli T., Ohad I., Nechushtai R. et Livnah O. (2005)
Base structurale de la thermostabilité de la ferrédoxine de la cyanobactérie Mastigocladus laminosus.
J. Mol. Biol. 350 : 599&ndash608 (pdf)

Copty A., Sakran F., Popov O., Ziblat R., Danieli T., Golosovsky M. et Davidov D. (2005)
Sondage de l'effet du rayonnement micro-ondes sur la luminescence de la protéine fluorescente verte en solution
Métaux synthétiques 155 : 422&ndash425
(pdf)

Elia N., Frechter S., Gedi Y., Minke B. et Selinger Z. (2005)
L'excès de Gße sur Gq&alphae in vivo empêche l'activité sombre et spontanée des photorécepteurs de la drosophile.
Le Journal de biologie cellulaire 171(3) : 517-526
(pdf)

Soskine M., Mark S., Tayer N., Mizrachi R. et Schuldiner S. (2006)
Sur la topologie parallèle et antiparallèle d'un transporteur multidrogue homodimérique
J. de Biol. Chimie 281 : 36205&ndash36212
(pdf)

Taylor A., ​​Haze-Filderman A, Blumenfeld A., Shay B., Dafni L., Rosenfeld E., Leiser Y., Fermon E., Gruenbaum-Cohen Y.
et Deutsch D. (2006)
Rendement élevé d'amélogénine humaine recombinante biologiquement active en utilisant le système d'expression baculovirus.
Expression et purification des protéines 45 : 43&ndash53
(pdf)

Diskin R., Lebendiker M., Engelberg L. et Livnah O. (2007)
Les structures des mutants actifs p38 & alpha révèlent des changements de conformation dans la boucle L16 qui induisent l'autophosphorylation et l'activation.
J. Mol. Biol. 365, 66&ndash76 (pdf)

Funkenstein B. et Rebhan Y. (2007)
Expression, purification, renaturation et activation de la myostatine de poisson exprimée dans Escherichia coli : facilitation du repliement et de l'activité
inhibition par le prodomaine de la myostatine.
Expression et purification des protéines 54 : 54&ndash65
(pdf)

Hayouka Z., Rosenbluh J., Levin A., Loya S., Lebendiker M., Veprintsev D., Kotler M., Hizi A., Loyter A. & Friedler A. (2007)
Inhiber l'intégrase du VIH-1 en modifiant son équilibre d'oligomérisation
PNAS 104 (20) : 8316-8321
(pdf)

Weiss Y., Bromberg Z., Raj N., Raphael J., Goloubinoff P., Ben-Neriah Y. et Deutschman D. (2007)
L'expression améliorée de la protéine de choc thermique 70 altère la dégradation protéasomale de la kinase I[kappa]B dans les voies respiratoires aiguës expérimentales
syndrome de détresse.
Médecine de soins intensifs. 35(9):2128-2138
(pdf)

Coster G, Hayouka Z, Argaman L, Strauss C, Friedler A, Brandeis M et Goldberg M (2007)
Le médiateur de réponse aux dommages à l'ADN MDC1 interagit directement avec le complexe/cyclosome favorisant l'anaphase
J. de Biol. Chimie 282 (44): 32053&ndash32064
(pdf)

Shalev-Malul G., Viner-Mozzini Y., Sukenik A., Gaathon A., Lebendiker M. et Kaplan A. (2008)
Une protéine de type AbrB pourrait être impliquée dans la régulation de la production de cylindrospermopsine par Aphanizomenon ovalisporum.
Microbiologie environnementale 10(4), 988&ndash999
(pdf)

Rotem S, Katz C, Benyamini H, Lebendiker M, Veprintsev D, Rudiger S, Danieli T et Friedler A. (2008)
La structure et les interactions du domaine riche en proline d'ASPP2 (2008)
J. de Biol. Chimie 283 (27), 18990&ndash18999
(pdf)

Mayshar Y, Rom E, Chumakov I, Kronman A, Yayon A et Benvenisty N (2008)
Le FGF4 et sa nouvelle isoforme d'épissage ont des effets opposés sur le maintien de l'auto-renouvellement des cellules souches embryonnaires humaines
Stem Cells Express, publié en ligne le 10 janvier 2008 doi:10.1634/stemcells.2007-1037
(pdf)

Katz C., Benyamini H., Rotem S., Lebendiker M., Danieli T., Iosub A., Refaely H., Dines M., Bronner V., Bravman T., Shalev D.,
Rüdiger S., et Friedler A. (2008)
Base moléculaire de l'interaction entre les protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 et la protéine pro-apoptotique ASPP2
PNAS
105 (34): 12277&ndash12282 (pdf)

Amsili S, Zer H, Hinderlich S, Krause S, Becker-Cohen M, MacArthur D, North K et Mitrani-Rosenbaum S (2008)
L'UDP-N-acétylglucosamine 2-épimérase/N-acétylmannosamine kinase (GNE) se lie à l'alpha-actinine 1 : nouvelles voies dans
Muscle squelettique?
PLoS ONE 3(6) : e2477 1-9 . (pdf)

Steiner-Mordoch S, Soskine M, Solomon D, Rotem D, Gold A, Yechieli M, Adam Y et Schuldiner S (2008)
Topologie parallèle des homodimères EmrE génétiquement fusionnés
Le journal EMBO 27, 17&ndash26 (pdf)

Reingewertz T. Benyamini H. Lebendiker M. Shalev D. et Friedler A. (2009)
Le domaine C-terminal de la protéine Vif du VIH-1 est nativement déplié dans son état non lié.
PEDS (Ingénierie, conception et sélection des protéines) 1&ndash7, doi : 10.1093/protéine/gzp004
(pdf)

Lieman-Hurwitz J, Haimovich M, Shalev-Malul G, Ishii A, HiharaY, Gaathon A, Lebendiker M et Kaplan A. (2009)
Une protéine cyanobactérienne de type AbrB affecte l'affinité photosynthétique apparente pour le CO2 en modulant les faibles émissions de CO2
l'expression du gène.
Microbiologie environnementale 11(4), 927&ndash936 (pdf)

Lederman L. (2009)
Isolement et purification des protéines & ndash Tech News
BioTechniques 46:87-89
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Sela M., Babitski E., Steinberg D., Kohavi D. et Rosen G. (2009)
Dégradation des membranes de régénération tissulaire guidée par le collagène par les enzymes protéolytiques de Porphyromonas gingivalis et de ses
inhibition par des agents antibactériens
Clin. Oral Impl. Rés. 20, 496&ndash502 (pdf)

Yannay-Cohen N., Carmi-Levy I., Kay G., Yang C., Min HanJ. , Kemeny M., Kim S., Nechushtan H. et Razin E. (2009)
LysRS sert de molécule de signalisation clé dans la réponse immunitaire en régulant l'expression des gènes
Cellule moléculaire 34, 603&ndash611 (pdf)

Tabib A., Krispin A., Trahtemberg U., Verbovetsk I., Lebendiker M., Danieli T. et Mevorach D. (2009)
Le domaine thrombospondine-1-N-terminal (domaine N-terminal de liaison à l'héparine) induit un état phagocytaire, et la thrombospondine-1-C-terminale

domaine induit un phénotype tolérisant dans les cellules dendritiques.
PLoS ONE 4(8) e6840 1-7 (pdf)

Shay B, Gruenbaum-Cohen Y, Tucker AS, Taylor AL, Rosenfeld E, Haze A, Dafni L, Leiser Y, Fermon E, Danieli T,
Blumenfeld A, Deutsch D. (2009)
Expression à haut rendement de la protéine tuftéline humaine pleine longueur recombinante biologiquement active dans des cellules d'insectes infectées par un baculovirus.
Protéine Expr Purif. 2009 novembre 68(1):90-98 (pdf)

Kasherman Y, Sturup S et Gibson D (2009)
Le glutathion est-il la cible cellulaire majeure du cisplatine ? Une étude des interactions du cisplatine avec des extraits de cellules cancéreuses
J. Méd. Chem., 52, 4319&ndash4328 (pdf)

Elbaz Y, Danieli T, Kanner B et Schuldiner S (2010)
Expression de transporteurs de neurotransmetteurs pour des études structurales et biochimiques.
Protéine Expr Purif . 73:152-160. (pdf)

Lebendiker M. et Danieli T. (2011)
Purification des protéines fusionnées à la protéine liant le maltose.
Chromatographie des protéines : méthodes et protocoles. Éditeur(s) : Dermot Walls, Sinéad T. T. Loughran Series :
Méthodes en biologie moléculaire Vol.681 : 281-293 (pdf)

Tzarum N., Diskin R., Engelberg D. et Livnah O. (2011)
Des mutants actifs du site d'activation alternatif p38&alpha médié par le TCR montrent des changements dans la lèvre de phosphorylation et le DEF
Création de sites
J. Mol. Biol. 405, 1154&ndash1169 (pdf)

Reingewertz T., Shalev D., Sukenik S., Blatt O., Rotem S., Lebendiker M., Larisch S. & Friedler A. (2011)
Mécanisme de l'interaction entre l'extrémité C-terminale intrinsèquement désordonnée de la protéine proapoptotique ARTS
et le domaine Bir3 de XIAP
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La région désordonnée d'Arabidopsis VIP1 lie la protéine Agrobacterium VirE2 en dehors de son site de liaison à l'ADN
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Une région intrinsèquement désordonnée dans la protéine ASPP2 pro-apoptotique se lie à l'oncoprotéine CagA d'Helicobacter pylori
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Zauberman A., Vagima Y., Tidhar A., ​​Aftalion M., Gur D., Rotem S., Chitlaru T., Levy Y. et Mamroud E. (2017)
L'immunité nutritionnelle du fer de l'hôte induite par une souche vaccinale vivante de Yersinia pestis est associée à une protection immédiate contre la peste
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Histoire structurelle des protéines humaines SRGAP2
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Columbus-Shenkar Y., Sachkova M., Fridrich A., Modepalli V., Sunagar K. et Moran Y.
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Langut Y., Talhami A., Mamidib S., Shir A., ​​Zigler M., Joubran S., Sagalov A., Flashner-Abramson E., Edinger N., Klein S. et Levitzki A. (2017)
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Langut Y., Edinger N., Flashner-Abramson E., Melamed-Book N., Lebendiker M., Klein S. et Levitzki A. (2017)
Le vecteur de protéine chimérique dsRNA-homing PSMA tue les cellules cancéreuses de la prostate et évoque l'immunité anti-tumorale
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Rapports scientifiques (2018) 8:6907 DOI:10.1038/s41598-018-25246-6 (pdf)

Amartely H., Some D., Tzadok A. et Lebendiker M. (2019)
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J. Vis. Exp. (146), e59408, doi:10.3791/59408 (2019).
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Sporny M., Guez-Haddad J., Lebendiker M. &sbquo Ulisse V., Volf A., Mim C., Isupov M. et Opatowsky Y. (2019)
Preuve structurelle d'un arrangement en anneau octamère de SARM1
Revue Biologie Moléculaire 431, 3591&ndash3605
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Shamir M., Amartely H. et Lebendiker M. et Friedler A (2019)
Caractérisation d'oligomères de protéines par diffusion de la lumière multi-angles (MALS)
Encyclopédie de chimie analytique DOI : 10.1002/9780470027318.a9545 (pdf)

Onn L., et al. et Toiber D. (2020)
SIRT6 est un capteur de rupture d'ADN double brin
eLife 20209:e51636. DOI : https://doi.org/10.7554/eLife.51636 (pdf)

Dekel N., Einsenberg-Domovich Y., Karlas A., von Kries J., Lebendiker M., Danieli T et Livnah O. (2020)
Expression, Purification and Crystallization of Clk1 Kinase &ndash a possible target for anti-influenza therapy
Protein Expression and Purification 176, 105742 (2020) https://doi.org/10.1016/j.pep.2020.105742
(pdf)

Initial Bioinformatic Investigation - Dr Nurit Kleinberger Doron - Hebrew University of Jerusalem
A detailed collection of information on initial bioinformatic investigation, and the use of bioinformatic tools to strategically design expression/purification
projets

ExPASy - ProtParam : A tool which allows the computation of various physical and chemical parameters for a given protein. The computed
parameters include the molecular weight, theoretical pI, amino acid composition, atomic composition, extinction coefficient, estimated half-life,
instability index, aliphatic index and grand average of hydropathicity (GRAVY)

PROTEIN CALCULATOR v3.3 - Scripps : A tool which allows the computation of various physical and chemical parameters for a given
protéine. The computed parameters include the molecular weight, theoretical pI, amino acid composition, atomic composition, extinction
coefficient, charge, protease cleavage.

Recombinant Protein Solubility Prediction - University of Oklahoma :
The statistical model predicts protein solubility assuming the protein is being overexpressed in Escherichia coli. Reference: Predicting the solubility
of recombinant proteins in Escherichia coli. Wilkinson et al. Biotechnology (N Y). 1991 May9(5):443-8.

ESPRESSO (EStimation of PRotein Expression and SOlubility):
A sequence-based predictor for estimating protein expression and solubility

ExPASy - Peptide Cutter :
Predicts potential protease and cleavage sites and sites cleaved by chemicals in a given protein sequence.

FoldIndex - Weizmann Institute of Science :
FoldIndex©: a simple tool to predict whether a given protein sequence is intrinsically unfolded. Prilusky et al. BIOINFORMATICS APPLICATIONS
NOTE Vol. 21 no. 16 2005, pages 3435&ndash3438 doi:10.1093/bioinformatics/bti537

CYSPRED - Predictor of the bonding state of cysteines in proteins
The role of evolutionary information in predicting the disulfide bonding state of cysteines in proteins- Fariselli et al. Proteins 36: 340-346 (1999)

DISULFIND - Cysteines Disulfide Bonding State and Connectivity Predictor - Univ. Of Firenze
A server for the prediction of the bonding state and connectivity pattern of the cysteines in a given amino acid sequence

DiANNA 1.1 - Cysteine state and Disulfide Bond partner prediction - Boston College
Determines the cysteine species: free cysteine, half-cystine or ligand-bound and if a cysteine is predicted to be ligand-bound, then the most likely of
the four most common ligands (iron, zinc, cadmium, carbon)

GlobPlot - Intrinsic Protein Disorder, Domain & Globularity Prediction - EMBL GlobPlot: exploring protein sequences for globularity and
désordre. Linding et. Al. Nucleic Acids Research, 2003, Vol. 31, No. 13 3701&ndash3708

Stormoff: Weight to Molar Quantity (for proteins)
This program helps you to convert the weight (weight concentration) in the molar quantity (molar concentration)
and vice versa.

SIGMA (MERCK) Mass Molarity Calculator:
The mass molarity calculator tool calculates the mass of compound required to achieve a specific molar concentration and volume

SIGMA (MERCK) Mass Molarity CalculatorNormality & Molarity Calculator:
The molarity calculator tool provides lab-ready directions describing how to prepare an acid or base solution of specified Molarity (M) or Normality (N)
from a concentrated acid or base solution.

SIGMA (MERCK) Buffer Calculator
The Sigma-Aldrich Buffer Calculator is a useful tool for calculating buffer solutions, including concentration calculations by Molarity or by Percentage,
with relevant links to Sigma-Aldrich products.

SIGMA (MERCK) Buffer Reference Center
Useful pH Ranges of Selected Biological Buffers (25 °C, 0.1M)
Trizma Buffer Table &ndash pH vs. Temperature
Phosphate Buffer Table &ndash 0.2M solution
Citric Acid &ndash Na2HPO4 Buffer Solutions, pH approx. 2.6&ndash7.6
Citric Acid &ndash Sodium Citrate Buffer Solutions, pH 3.0&ndash6.2

Sodium Acetate &ndash Acetic Acid Buffer Solutions, pH 3.7&ndash5.6
Na2HPO4 &ndash NaH2PO4 Buffer Solutions, pH 5.8&ndash8.0 at 25 °C
Sodium Carbonate &ndash Sodium Bicarbonate Buffer Solutions, pH 9.2&ndash10.8

SIGMA (MERCK) Unit Converters
Température
Le volume
Mass/Weight
Longueur
Pression
Flow rate
Absorbance/Transmittance

Unit Converters
Température
Le volume
Mass/Weight
Longueur
Pression
Autres.

Ammonium Sulfate Calculator - EnCor Biotechnology Inc .
The program calculates how much solid Ammonium Sulfate you need to add to a specific volume of a solution to get a specific percentage
saturation at a specific temperature.

CRAPome: a contaminant repository for affinity purification&ndashmass spectrometry data (pdf)
A web-accessible resource that stores and annotates negative controls generated by the proteomics research community and enables their use for
scoring AP-MS data.

Recommended Publications

Crystallography and Recombinant Proteins

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Revoir

From reviews of the first edition.
". very useful. "
-Angewandte Chemie: International Edition

". valuable to keep around the laboratory. "
-Biopharm

". recommended for protein chemists. There is something in this book for
everyone. an excellent working book as well as an excellent reference."
-JAOCS: Journal of the American Oil Chemists' Society

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-Biomedical Chromatography

"Eight years on this is a welcome new edition which retains the same overall format of a strategies chapter followed by some 43 chapters, each dealing with individual techniques. Updating ranges from new introductions, to additional references and modified protocols. The final six chapters are new and include a useful comparison of detection methods and guides to proteomics and mass spectrometry. The larger format and hard binding make this edition appear less of a bench book, but the Editor has wisely retained the readily approachable format and enhanced its overall value as a practical manual, collating a wide range of protocols useful for both less and more experienced practitioners."-SGM Quarterly


Protein Expression

The expression of recombinant proteins, especially using bacterial vectors and hosts, is a mature technology. With the appropriate cDNA and PCR methods, expression plasmids can be rapidly produced. Following sequence determination of the constructs, plasmids are transformed into expression hosts, single colonies picked, and fermentation performed. Avec E. coli, a 2-liter fermentation using complex media will generate

50 to 80 g (wet weight of cells). Assuming modest protein expression (2% to 5% of the total cellular protein), between 100 and 300 mg of recombinant protein is available in the cells. The problem is, of course, how to isolate it in an active form. Soluble proteins can be recovered with good yields (㹐%), and insoluble proteins, which must undergo a denaturation and folding cycle, can be recovered with more modest yields (5% to 20%). Hence, using small-scale fermentations and laboratory-scale processing equipment, proteins (or subdomains thereof) can usually be produced in sufficient quantities (10 to 100 mg) to initiate most studies including detailed structural determinations. Some strategies for achieving high-level expression of genes in E. coli have been reviewed by Markrides (1996) and Baneyx (1999) and are also discussed in Unit 5.24.

Some of the above characteristics also hold true for the production of proteins using yeast and baculovirus eukaryotic expression systems, although more effort and expertise is required to construct the vectors and, with the baculovirus system, produce cells for processing. A yeast expression system may be a wise choice for proteins that form insoluble inclusions in bacteria, and for the production of membrane-associated proteins (Cereghino and Clegg, 1999 UNITS 5.6𠄵.8). The baculovirus system has proven very useful for producing phosphorylated proteins and glycoproteins (Kost, 1999 UNITS 5.4𠄵.5) and for the co-expression of interacting proteins. The construction of stable mammalian protein expression vectors requires considerably more time and effort but may be the only approach for producing complex multidomain proteins (UNITS 5.9𠄵.10). Cells growing to cell densities of 1𠄵 휐 9 cells/ml can be expected to typically secrete 㸐 mg/liter of product. Alternatively, transient gene expression systems using various viral vectors (e.g., vaccinia virus UNITS 5.12𠄵.15), can be used to produce lesser amounts of protein, which is useful for feasibility studies. It is of interest to note that the large-scale transient expression systems in mammalian cells are being actively developed by biotechnology companies (Wurm and Bernard, 1999).

The choice of a host system for the production of recombinant proteins is discussed in unit 5.16 and is also concisely summarized by Brondyke (2009). Also, there is a special issue on the production of recombinant proteins in the journal Biotechnology Advances (Sanchez and Demin, 2012). In this issue there are excellent overviews of protein expression and production using E. coli (Chen, 2012) yeast (Celik and Calik, 2012) insect cell and the baculovirus system (Drugmand et al 2012) mammalian cells (Zhu, 2012) cell free systems (Carlson et al., 2012) and plant cells (Xu et al., 2012).

As mentioned by Chen (2012), for many investigators the initial choice is often Escherichia coli which remains the preferred system for laboratory investigations and initial development in commercial activities and is a benchmark for comparison among the other various expression platforms. This is due to such factors as ease of genetic manipulation, availability of optimized expression plasmids, and ease of growth. This unit presents an overview of recombinant protein purification with special emphasis on proteins expressed in E. coli. Practical aspects and strategies are stressed throughout, and wherever possible, the discussion is cross-referenced to the example protocols described in the rest of Chapter 6.

The first section deals with information pertinent to protein purification that can be derived from translation of the cDNA sequence. This is followed by a brief discussion of some of the common problems associated with bacterial protein expression (see also UNIT 5.1). Planning a protein purification strategy requires that the solubility of the expression product be determined it is also useful to establish the location of the protein in the cell𠅎.g., cytoplasm or periplasm. This unit includes flow charts that summarize approaches for establishing solubility and localization of bacterially produced proteins (see also UNIT 5.2).

Purification strategies for both soluble and insoluble proteins are reviewed and summarized in flow charts (see also Chapter 1). Many of the individual purification steps, especially those involving chromatography, are covered in detail in Chapters 8 and 9, and elsewhere (Scopes, 1994 Janson, 2011). The methodologies and approaches described here are essentially suitable for laboratory-scale operations. Large-scale methodologies have been previously reviewed (Asenjo and Patrick 1990 Thatcher, 1996 Sofer and Hagel, 1997).

A section on glycoproteins produced in bacteria in the nonglycosylated state is included to emphasize that, although they may not be useful for in vivo studies, such proteins are well suited for structural studies. The final sections deal with protein handling, scale and aims of purification, and specialized equipment needed for recombinant protein purification and characterization.


10: Protein purification - Biology

Thrombin Cleavage of GST-Fusion protein

In many cases the cleavage can be performed using the free intact fusion, or in same cases with the fusion protein bound to a matrix.
The amount of thrombin, temperature and length of incubation must be calibrated for each system. Samples must be removed at various time points and analyzed by PAGE-SDS to estimate the yield, purity and extent of thrombin digestion. Excess thrombin may result in unwanted proteolysis at secondary sites.
Avoid the presence of serine-protease inhibitors (like PMSF or AEBSF) during reaction.
Theoretically, cleavage must be complete following ON treatment with <10 cleavege unit per mg protein . For some applications thrombin (MW 37kDa) must be subsequently removed from the sample by chromatography or affinity with pAminoBenzamidine - Agarose.

Thrombin: from Pharmacia. Dissolve 500 cleavage units in 0.5ml cold PBS. Swirl gently to dissolve. To preserve activity keeps the enzyme in aliquots at -80°C.
Thrombin (MW 37kDa)

4500units/mg. One unit cleaves theoretical 100ug protein in 16hr at 22°C in buffer.
Another possibility is to use high purity enzyme from Sigma # T-6884: 3-10 U of thrombin can be used to cleave 1 mg of fusion protein at room temperature overnight.

1 X PBS buffer: 140mM NaCl 2.7mM KCL 10mM Na2HPO4 1.8mM KH2Bon de commande4 pH 7.3

Thrombin Cleavage of Free Eluted Fusion protein

First you have to calibrate amount of thrombin, temperature and length of incubation, taking in mind that one unit cleaves theoretical 100ug protein in 16hr at 22°C in buffer.
You can incubate enough eluate to see on PAGE-SDS gels (

3ug) with 0.01, 0.03 & 0.06 Units of thrombin 2hr, 4hr, 6hr & ON at 22°C (or RT). Stop the reaction with PAGE-SDS sample buffer + 1mM PMSF and keep immediately at -20°C until use. Analyze PAGE-SDS gels versus a control of non-cleavaged protein.
Longer incubation, more enzyme or higher temperature will increase cleavage while lower incubation, less enzyme or lower temperature will decrease cleavage.

As a general protocol you can use:

1. To the eluate from either batch or column purification, add 10ul of thrombin solution (10 cleavage units) per mg fusion protein.
2. Mix gently and incubate at RT for 2-16hrs
3. Once digestion is complete you can stop protease cleavage with 1mM PMSF or AEBSF (more stable) and check results by PAGE-SDS gels or immediately separate the cleavage products by chromatography
4. When a satisfactory condition is found, scale-up the reaction proportionally.

Avoid the presence of serine protease inhibitors (like PMSF or AEBSF) during cleavage

According to NOVAGEN (pdf) to enhance cleavage of some recombinant proteins, it is possible to carry out thrombin digestion in the presence of protein denaturants, such as 0.01% SDS, 1M urea, and 10% glycerol, which may expose the cleavage site to the enzyme more effectively and/or keep proteins in solution.

Thrombin Cleavage of Fusion protein Bound to column matrix

First you have to calibrate the amount of thrombin, temperature and length of incubation, taking in mind that one unit cleaves theoretical 100ug protein in 16hr at 22 ° C in buffer or one unit cleaves theoretical 20ul of bed volume saturated resin in 16hr at 22 ° C in buffer.

You can incubate 20ul of bed volume saturated resin with 0.1, 0.5, 1 & 2 Units of thrombin (in 20ul total PBS) 2hr, 4hr, 6hr & ON at 22 ° C (or RT). Stop reaction by spinning for 4min 3000rpm, separate supernatant from beads, and add PAGE-SDS sample buffer + 1mM PMSF to the supernatant, and keep immediately at -20 ° C until use. Analyze PAGE-SDS gels versus a control of non-cleavaged protein (eluted non cleaved protein).
Longer incubation, more enzyme or higher temperature will increase cleavage while lower incubation, less enzyme or lower temperature will decrease cleavage.

As a general protocol you can use:

1. For 1ml of bed volume saturated resin, mix 50Units of thrombin solution in 1ml PBS. Gently swirl to mix. Shake or rotate at 22 ° C (or RT) 2-16hrs
2. Spin the suspension 4min 3000rpm to pellet the beads. Keep supernatant aside. You can stop protease cleavage with 1mM PMSF or AEBSF (more stable).
3. Extract beads twice or more with 1ml PBS or buffer. Keep each supernatant aside.
4. As a control you can elute the remaining uncleaved protein (still attached to the resin through the GST) by extraction several times with elution buffer.
5. Check results by PAGE-SDS gels or immediately separate the cleavage products by chromatography.
6. When a satisfactory condition is found, scale-up the reaction proportionally.

Thrombin Removal with pAmino benzamidine-Agarose

50 units of Thrombin can be removed by shaking or rotating at 22 ° C (or RT) 30 min with 100ul with pAminoBenzamidine-Agarose (SIGMA #A 7155).


Voir la vidéo: Life Science - Protein synthesis Translation (Décembre 2022).