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Comment obtient-on expérimentalement une courbe de dissociation hémoglobine-oxygène ?


J'ai toujours voulu faire des études d'écophysiologie comparative sur l'affinité hémoglobine-oxygène des populations dans différents environnements, mais je ne trouve pas de protocole pour mesurer expérimentalement la relation. Est-ce que quelqu'un sait où je peux trouver un protocole, ou connaît-il lui-même un protocole ?

Je suppose qu'une réponse inclurait quelle serait l'instrumentation nécessaire, dans quelle condition le sang doit être (frais ?), si l'hème est isolé (et si oui, comment) et à quoi ressemblerait un schéma d'échantillonnage approprié .


Il existe des instruments disponibles dans le commerce pour mesurer les courbes de saturation hémoglobine-oxygène. Du sang total ou du sang lysé peut être utilisé ; Je m'attendrais à ce que l'instrumentation vienne avec des instructions spécifiques pour la préparation des échantillons, car cela peut dépendre de l'équipement exact.

Ces appareils utilisent un spectrophotomètre pour mesurer la saturation, en profitant de la même différence de couleur entre le sang artériel et veineux qui est visible à l'œil humain.

Pour collecter une courbe, vous commencez avec l'échantillon saturé en air ambiant ou en oxygène, et l'instrument introduit progressivement de l'azote pour remplacer l'oxygène, tout en surveillant les concentrations d'oxygène à l'aide d'une électrode de Clarke.

Voici un exemple de papier qui utilise l'un de ces appareils. Leurs méthodes précises peuvent être appropriées ou non à votre approche de recherche.

Les références


Head, C. A., Brugnara, C., Martinez-Ruiz, R., Kacmarek, R. M., Bridges, K. R., Kuter, D.,… & Zapol, W. M. (1997). De faibles concentrations d'oxyde nitrique augmentent l'affinité pour l'oxygène des érythrocytes falciformes in vitro et in vivo. Journal d'investigation clinique, 100 (5), 1193.


Chapitre 4 Transport de l'oxygène

Quelques commentaires généraux sur les échanges gazeux et la diffusion seront faits, suivis d'une description de la façon dont l'oxygène est transporté dans le sang. La liaison de l'oxygène à l'hémoglobine sera discutée, y compris la courbe de saturation en oxygène (ou de dissociation) et les facteurs (effecteurs allostériques) qui provoquent son déplacement. Ensuite, une discussion des effets du monoxyde de carbone sur la liaison de l'oxygène sera présentée. Enfin, une description des transporteurs artificiels d'oxygène sera présentée. La plupart de ces sujets sont traités dans des manuels standard [6,10,54,113] et des monographies sur le transport de l'oxygène [112].


Introduction

La pandémie de coronavirus-2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) a progressé dans le monde entier avec plus de 22 millions de cas au moment de la rédaction de cet article. Aux premiers stades de la pandémie de la maladie du SRAS-CoV-2 (COVID-19), des phénotypes cliniques uniques ont été signalés chez les patients touchés. Une étude des premières expériences de patients gravement malades en Italie a décrit une forme atypique de syndrome de détresse respiratoire aiguë induite par une pneumonie virale (SDRA) avec une compliance pulmonaire normale et un faible rapport ventilation/perfusion. 1 Les premiers rapports avaient suggéré un taux de mortalité très élevé (>80%) 2 pour les patients atteints d'insuffisance respiratoire due à la maladie SARSCoV-2 (COVID-19), par rapport aux taux de mortalité pré-COVID-19 SDRA dans la gamme de 30-40%. 3 Un syndrome clinique d'hypoxémie &ldquosilent&rdquo ou &ldquohappy» a été largement observé, avec des patients présentant une dyspnée minime ou des signes de dysfonctionnement neurocognitif malgré une hypoxémie sévère détectée passant par oxymétrie de pouls. 4 Un certain nombre de patients COVID-19 hospitalisés semblent avoir une activation hémostatique significative, avec une prévalence de 25 à 31 % de thromboembolie veineuse observée dans certaines cohortes. 5 , 6 Des études cliniques plus récentes ont montré que les exigences de ventilation mécanique chez les patients COVID-19 sont similaires à celles des populations de patients recrutés dans les essais cliniques ARDS sans COVID-19. 7, 8 D'autres études d'observation ont rapporté des taux de mortalité pour COVID-19 dans la gamme de 25-32%, similaires aux taux de mortalité pour le SDRA non-COVID-19. 9, 10 Alors que la physiopathologie exacte de COVID-19 reste un sujet d'investigation active, des preuves croissantes suggèrent que l'insuffisance respiratoire chez les patients COVID-19 se comporte de manière similaire à l'insuffisance respiratoire chez les patients atteints de pneumonie virale sévère qui déclenche le SDRA. 11, 12 L'incertitude au début de cette pandémie ainsi que certaines caractéristiques uniques et persistantes de la maladie (par exemple, des risques thromboemboliques accrus), ont conduit à un grand nombre d'hypothèses proposées concernant les mécanismes physiopathologiques du SRAS-CoV-2.

Figure 1. Description de la physiopathologie de l'infection par le SRAS-CoV-2. Infection passant par les poumons (flèches vides) entraînant une hypoxémie (la gauche) vs. attaque directe des protéines virales COVID-19 sur l'hémoglobine (Hb) des globules rouges (RBC) comme proposé par Liu et Li13 (droit, flèches hachurées/cadres gris). Les voies hypothétiques barrées par des croix rouges et mises en évidence dans des cases grises ne sont pas étayées par les preuves cliniques disponibles, in vitro/in vivo études, nos résultats, ni les mécanismes d'interaction virale avec les globules rouges. Voir le texte pour les détails.

Une théorie largement proposée soutient que les protéines virales interagissent directement avec l'hémoglobine humaine (Hb) et facilitent l'élimination du fer du groupe prothétique de la protéine hème, entraînant la perte d'hémoglobine fonctionnelle et l'accumulation toxique de fer. Cette théorie est issue d'un manuscrit de Liu et Li 13 publié sur le serveur de préimpression ChemRxiv (plus de 1,89 million de vues de manuscrits en août 2020). Ce travail de Liu et Li, 13 qui n'a pas été évalué par des pairs et continue d'être cité, 14 , 15 utilise in silico approches pour modéliser les interactions entre plusieurs protéines virales et l'hémoglobine. En bref, le manuscrit suggère que les protéines virales ORF1ab, ORF10 et ORF3a sont dérivées de plasmocytes infectés et agissent de concert pour éliminer l'hème de la chaîne b de l'hémoglobine, éliminer le fer de l'hème et séquestrer la protoporphyrine IX sans fer résultante ( PPIX). Les auteurs supposent que cette « attaque » coordonnée de l'hémoglobine se produit dans le plasma après une hémolyse immunitaire, entraînant la libération de quantités toxiques de fer, une diminution des taux d'hémoglobine fonctionnelle et une perturbation du métabolisme de l'hème. Enfin, Liu et Li 13 prétendent en outre que les conséquences d'une telle dégradation de l'hémoglobine expliquent certaines des caractéristiques cliniques irrégulières signalées au début de la pandémie (Figure 1). Bien que ce travail ait reçu une attention considérable de la part des scientifiques, des médecins, de la presse et du grand public, l'étude avance une théorie de l'interaction virale avec l'hémoglobine qui est incompatible avec les mécanismes bien caractérisés de la dégradation physiologique de l'hème, 16 et, de manière critique, fait avancer un mécanisme physiopathologique incompatible avec la présentation clinique des patients COVID-19. Ici, nous comparons les données de laboratoire clinique de patients COVID-19 confirmés admis à l'unité de soins intensifs (USI) du Centre médical de l'Université de Pittsburgh (UPMC) à des patients atteints de SDRA mais sans COVID-19. Ces données empiriques remettent en cause la théorie selon laquelle les protéines du SRAS CoV-2 éliminent directement le fer de l'hémoglobine humaine en tant que mécanisme physiopathologique du COVID-19.


Fonction Hb et contrôle régulateur allostérique

Les Hbs des vertébrés à mâchoires sont des hétérotétramères, composés de deux sous-unités de type et de deux sous-unités de type . Chacun des polypeptides sous-unitaires contient un groupe hème lié de manière covalente (voir Glossaire) qui peut se lier de manière réversible à un seul O2 molécule lorsque l'atome de fer est à l'état ferreux (Fe 2+ ), ainsi l'Hb tétramérique se lie jusqu'à quatre O2 molécules. Le tétramère Hb,2??2, se compose de dimères semi-rigides appariés qui subissent une rotation symétrique pendant la transition liée à l'oxygénation dans la structure quaternaire entre l'état « R » de haute affinité (oxygéné) et l'état « T » de faible affinité (désoxygéné) (Fig. .1A). Le changement lié à l'oxygénation de l'équilibre conformationnel T↔R est au cœur de l'allostère homotrope (coopérative O2-liaison qui découle de l'interaction sous-unité–sous-unité) et allosterie hétérotrope (régulation de la réactivité de l'hème par des ligands qui se lient à des sites éloignés de la poche de l'hème) (Perutz, 1970 Baldwin et Chothia, 1979).

Régulation allostérique

Régulation de l'activité protéique en liant une molécule de cofacteur à un site autre que le site actif de la protéine, la liaison de cofacteurs allostériques induit généralement un changement dans la conformation de la protéine.

Effet Bohr

La modulation de Hb–O2 affinité par les changements de pH et de CO2 teneur. Dans la gamme physiologique, l'O2 l'affinité de l'Hb des vertébrés est inversement proportionnelle à l'acidité et au CO2 concentration du sang.

équilibre de Donnan

L'équilibre ionique atteint dans une solution d'électrolyte lorsque les ions diffusibles et non diffusibles sont séparés par une membrane semi-perméable.

Un anneau de porphyrine qui coordonne un atome de fer au centre, il sert de groupe prothétique pour l'Hb et d'autres hémoprotéines.

Allostère homotrope

Modulation de l'activité protéique par liaison d'un ligand qui sert de substrat à la protéine (O2 dans le cas de l'Hb), mais qui sert également de molécule régulatrice. Par exemple, hème–O2 la liaison à une sous-unité Hb modifie la réactivité de l'hème d'autres sous-unités dans le même assemblage tétramère.

Allostère hétérotrope

La modulation de l'activité des protéines en liant un cofacteur qui n'est pas un substrat pour les ions hydrogène, les ions chlorure et les phosphates organiques des protéines sont des exemples de régulateurs hétérotropes de la fonction Hb.

La régulation allostérique de l'hémoglobine (Hb)–O2 affinité. (A) La réaction d'oxygénation de l'Hb tétramérique (α2??2) implique une transition allostérique dans la structure quaternaire de l'état T de faible affinité à l'état R de haute affinité. La transition T→R induite par l'oxygénation entraîne une rupture des ponts salins et des liaisons hydrogène à l'intérieur et entre les sous-unités (carrés vides), la dissociation des phosphates organiques allostériquement liés (OPH), des ions Cl − et des protons, et la libération de chaleur (oxygénation de l'hème est une réaction exothermique). La liaison des protons liés à l'oxygénation se produit au niveau de plusieurs résidus dans les chaînes α et , la liaison Cl − se produit principalement au niveau des groupes -amino N-terminaux des chaînes α et en plus d'autres résidus dans les deux chaînes, et la liaison du phosphate se produit entre les chaînes dans la cavité centrale du tétramère Hb. (B) O2 courbes d'équilibre pour l'Hb purifiée en l'absence d'effecteurs allostériques (Stripped) et en présence d'ions chlorure (+Cl − ) et de phosphates organiques (+OPH). La liaison préférentielle des effecteurs allostériques à la désoxyHb stabilise l'état T, déplaçant ainsi l'équilibre allostérique en faveur de la structure quaternaire de faible affinité. L'O2 les courbes d'équilibre sont donc décalées vers la droite (Hb–O2 l'affinité est réduite) en présence de tels effecteurs. Hb–O2 l'affinité est indexée par le P50 valeur (lignes grises en pointillés) – la PO2 auquel Hb est semi-saturé. La forme sigmoïde de l'O2 les courbes d'équilibre reflètent la coopérative O2 contraignant, impliquant un PO2-décalage dépendant des conformations de faible à haute affinité.

La régulation allostérique de l'hémoglobine (Hb)–O2 affinité. (A) La réaction d'oxygénation de l'Hb tétramérique (α2??2) implique une transition allostérique dans la structure quaternaire de l'état T de faible affinité à l'état R de haute affinité. La transition T→R induite par l'oxygénation entraîne une rupture des ponts salins et des liaisons hydrogène à l'intérieur et entre les sous-unités (carrés vides), la dissociation des phosphates organiques allostériquement liés (OPH), des ions Cl − et des protons, et la libération de chaleur (oxygénation de l'hème est une réaction exothermique). La liaison des protons liés à l'oxygénation se produit sur plusieurs résidus dans les chaînes α et , la liaison Cl − se produit principalement sur les groupes -amino N-terminaux des chaînes α et en plus d'autres résidus dans les deux chaînes, et la liaison du phosphate se produit entre les chaînes dans la cavité centrale du tétramère Hb. (B) O2 courbes d'équilibre pour l'Hb purifiée en l'absence d'effecteurs allostériques (Stripped) et en présence d'ions chlorure (+Cl − ) et de phosphates organiques (+OPH). La liaison préférentielle des effecteurs allostériques à la désoxyHb stabilise l'état T, déplaçant ainsi l'équilibre allostérique en faveur de la structure quaternaire de faible affinité. L'O2 les courbes d'équilibre sont donc décalées vers la droite (Hb–O2 l'affinité est réduite) en présence de tels effecteurs. Hb–O2 l'affinité est indexée par le P50 valeur (lignes grises en pointillés) – la PO2 auquel Hb est semi-saturé. La forme sigmoïde de l'O2 les courbes d'équilibre reflètent la coopérative O2 contraignant, impliquant un PO2-décalage dépendant des conformations de faible à haute affinité.

Allostère homotrope

SO2 est la saturation fractionnaire, PO2 est la pression partielle de O2 à Torr, P50 est le PO2 à laquelle Hb est saturé à 50 %, et m est le coefficient de coopérativité. L'équation de Hill est prolongée par l'équation plus complexe d'Adair (Adair, 1925), qui exprime SO2 en tant que fonction de PO2 et des constantes d'association pour lier chacun des quatre O2 molécules par tétramère d'Hb.

Allostère hétérotrope

Mécanismes hétérotropes de régulation de l'Hb–O2 l'affinité implique la liaison liée à l'oxygénation de ligands non hémiques tels que H + , Cl − , CO2, lactate et phosphates organiques. Les sites de liaison de ces effecteurs allostériques sont principalement situés aux extrémités N et C des sous-unités de la globine et dans la cavité centrale chargée positivement du tétramère Hb (Arnone, 1972 Arnone et Perutz, 1974 O'Donnell et al., 1979 Nigen et al., 1980). Différents phosphates organiques servent d'effecteurs allostériques dans les globules rouges définitifs de différents groupes de vertébrés terrestres : 2,3-diphosphoglycérate (2,3-DPG) chez les mammifères, inositol pentaphosphate (IPP) chez les oiseaux, adénosine triphosphate (ATP) et guanosine triphosphate (GTP) chez les reptiles non aviaires, et ATP et DPG chez les amphibiens (Rapoport et Guest, 1941 Benesch et Benesch, 1967 Bartlett, 1980 Hazard et Hutchison, 1982 Weber, 1995 Weber et Fago, 2004). Ces molécules de polyphosphate se lient électrostatiquement à une constellation de résidus cationiques tapissant la fente entre les chaînes de désoxyHb, stabilisant ainsi l'état T par la formation de ponts salins à l'intérieur et entre les sous-unités des chaînes et (Arnone, 1972 Arnone et Perutz, 1974). La liaison du phosphate a pour effet de réduire l'Hb–O2 affinité en déplaçant l'équilibre conformationnel en faveur de l'état T de faible affinité cette transition allostérique dans la structure quaternaire favorise O2 déchargement dans les cellules des tissus respiratoires. Les phosphates organiques étant des anions non diffusibles, les modifications de leur concentration intracellulaire exercent également un effet indirect sur l'O.2 affinité en perturbant l'équilibre de Donnan (voir Glossaire) des protons à travers la membrane des globules rouges, car les changements de pH cellulaire modulent Hb–O2 liaison via l'effet Bohr (voir Glossaire).

Alors que la coopérativité représente la forme de l'O2 courbe d'équilibre, le O2 l'affinité de l'Hb détermine la position de la courbe le long de la X-axe. Comme le montre la figure 1B, la courbe est décalée vers la droite [correspondant à une réduction de Hb–O2 affinité (augmentée P50)] ou vers la gauche [correspondant à une augmentation de l'Hb–O2 affinité (diminution P50)] en réponse aux changements de température, de pH et de concentrations érythrocytaires des ions Cl − et des phosphates organiques.


Hypoxie

J.F. Nunn MD, PhD, FRCS, FFARCS, FFARACS (Hon), FFARCSI (Hon.) , en physiologie respiratoire appliquée (troisième édition) , 1987

Po cellulaire 2

Le Po cellulaire 2 est le point de départ d'un examen quantitatif de l'hypoxie. La phosphorylation oxydative pour former l'ATP se produit dans les mitochondries et se poursuivra jusqu'à Po 2 d'environ 0,13 kPa, soit 1 mmHg (page 241). Pô 2 les gradients au sein de la cellule sont considérés à la page 201 , et il y a des raisons de croire que les neurones ne fonctionneront plus lorsque le Po 2 à leur surface est réduite en dessous d'environ 2,7 kPa (20 mmHg). Pô 2 varie d'une cellule à l'autre et est également différente dans différentes parties de la même cellule. Il existe donc des difficultés insurmontables pour définir ou mesurer « le Po tissulaire 2’.


Sommaire

L'hémoglobine est une protéine présente dans les globules rouges qui est composée de deux sous-unités alpha et de deux sous-unités bêta qui entourent un groupe hème contenant du fer. L'oxygène se lie facilement à ce groupe hème. La capacité de l'oxygène à se lier augmente à mesure que davantage de molécules d'oxygène sont liées à l'hème. Les états pathologiques et les conditions altérées du corps peuvent affecter la capacité de liaison de l'oxygène et augmenter ou diminuer sa capacité à se dissocier de l'hémoglobine.

Le dioxyde de carbone peut être transporté dans le sang par trois méthodes. Il est dissous directement dans le sang, lié aux protéines plasmatiques ou à l'hémoglobine, ou transformé en bicarbonate. La majorité du dioxyde de carbone est transportée dans le cadre du système bicarbonate. Le dioxyde de carbone diffuse dans les globules rouges. À l'intérieur, l'anhydrase carbonique convertit le dioxyde de carbone en acide carbonique (H2CO3), qui est ensuite hydrolysé en bicarbonate (HCO − 3) et H+. L'ion H + se lie à l'hémoglobine dans les globules rouges, et le bicarbonate est transporté hors des globules rouges en échange d'un ion chlorure. C'est ce qu'on appelle le changement de chlorure. Le bicarbonate quitte les globules rouges et pénètre dans le plasma sanguin. Dans les poumons, le bicarbonate est transporté dans les globules rouges en échange de chlorure. Le H + se dissocie de l'hémoglobine et se combine avec le bicarbonate pour former de l'acide carbonique à l'aide de l'anhydrase carbonique, qui catalyse davantage la réaction pour reconvertir l'acide carbonique en dioxyde de carbone et en eau. Le dioxyde de carbone est ensuite expulsé des poumons.


Conditions pathologiques qui affectent l'ODC

Anémie

Comme discuté précédemment, la teneur en oxygène du sang est directement proportionnelle à la concentration d'hémoglobine et, par conséquent, l'anémie (et la polyglobulie) a des effets largement prévisibles sur l'ODC. En termes simples, une réduction de la concentration d'hémoglobine à la moitié de la valeur normale s'accompagne d'une réduction similaire de la teneur en oxygène artériel sans (ou très peu) de changement dans le % de saturation ou PaO2 ( Figure 2 ). Malgré la réduction du transport d'oxygène par le sang, la consommation d'oxygène des tissus est susceptible de montrer peu de changement et est maintenue par plusieurs facteurs compensatoires, notamment un débit cardiaque plus élevé et une plus grande extraction d'oxygène par les tissus. Par conséquent, la réserve sanguine d'oxygène est diminuée et la teneur en oxygène veineux, la saturation et la pression partielle sont toutes inférieures à la normale.

ODC chez un sujet théorique présentant une anémie et une concentration d'hémoglobine (Hb) de 7,5 g ⋅𠂝L 𢄡 par rapport à une concentration normale d'hémoglobine de 15 g ⋅𠂝L 𢄡 . Lorsque la teneur en oxygène est tracée en fonction de PO2 la courbe de l'anémie est réduite de 50 %, reflétant la réduction de moitié de la capacité de transport d'oxygène (l'oxygène dissous est ignoré) lorsque SaO2 est tracée les courbes anémique et normale sont superposées.

Hémoglobinopathies

Un grand nombre d'hémoglobines anormales déterminées génétiquement ont été décrites, l'une des plus familières étant l'HbS que l'on trouve chez les patients atteints de drépanocytose. Chez les individus présentant une hémoglobinopathie, les molécules anormales constituent une proportion variable de l'hémoglobine totale et par conséquent, les effets sont également variables. Par rapport à l'HbA adulte normale, les molécules d'hémoglobine anormales sont associées à des déplacements de l'ODC qui peuvent être soit vers la droite (hémoglobines à faible affinité pour l'oxygène) soit vers la gauche (hémoglobines à haute affinité pour l'oxygène). La position de l'ODC peut être quantifiée par le P50, qui est mesuré in vitro comme la pression partielle d'oxygène à une saturation de 50 %. Les P50 du sang adulte normal est d'environ 26 mmHg les hémoglobines de faible affinité sont caractérisées par une P50 et les hémoglobines de haute affinité par un taux inférieur à la normale P50. De telles hémoglobines anormales peuvent avoir des conséquences majeures sur l'apport tissulaire d'oxygène, mais leurs effets sont atténués par divers mécanismes compensatoires, dont l'un est la concentration en hémoglobine. Les molécules à haute adaffinité, par définition, libèrent de l'oxygène moins facilement que la normale et, parce que l'hypoxie tissulaire stimule la production d'hémoglobine, les personnes atteintes souffrent souvent de polyglobulie. En revanche, ceux qui ont des hémoglobines de faible affinité sont généralement anémiques.

Empoisonnement au monoxyde de carbone

Le CO entre en compétition de manière réversible avec l'oxygène pour les sites de liaison sur la molécule d'hémoglobine, mais l'hémoglobine a une affinité beaucoup plus grande (environ 200 fois) pour le premier et une grande partie des sites de liaison sera occupée par le CO, même à faible pression partielle de CO. De plus, la présence de carboxyhémoglobine entraîne un déplacement de l'ODC vers la gauche, compromettant davantage l'apport d'oxygène aux tissus.

Les indices usuels d'oxygénation sont potentiellement trompeurs dans les intoxications au CO en particulier, PaO2 est susceptible de rester normale et la saturation peut également sembler normale lorsqu'elle est mesurée comme SpO2 puisque la plupart des oxymètres de pouls (qui n'utilisent que deux longueurs d'onde de lumière) mesurent la carboxyhémoglobine avec l'oxyhémoglobine. ૝istinction est �possible en utilisant un oxymètre de pouls CO spécifique, qui utilise plusieurs longueurs d'onde, mais de tels dispositifs ne sont actuellement pas largement disponibles [5]. En cas de suspicion d'intoxication au CO, la carboxyhémoglobine doit être mesurée sur un échantillon de sang par spectrophotométrie multi-longueurs d'onde, telle qu'elle est incorporée dans les analyseurs de gaz du sang modernes. La liaison du CO à l'hémoglobine est réversible et peut être réduite en augmentant le débit inspiré (et par conséquent artériel) PO2. Les patients intoxiqués au CO sont donc traités avec la concentration d'oxygène inspiré la plus élevée possible, parfois de l'oxygène hyperbare est utilisé avec la justification que plus le PaO2, plus de molécules de CO seront déplacées de l'hémo­globine et que l'augmentation de la très petite quantité d'oxygène dissous à très haute PaO2, peut aider à maintenir la vie [6].


Dégradation

Une fois que les globules rouges ont terminé leur durée de vie, ils sont absorbés par les cellules du système réticulo-endothélial principalement dans le foie et la rate. Ces cellules détruisent les globules rouges et l'hémoglobine subit une dégradation.

L'hème et la globine sont séparés. Les chaînes de globine sont soit recyclées, soit décomposées en acides aminés individuels par l'action d'enzymes protéases.

Les groupes hèmes sont dégradés pour former la bilirubine par les enzymes microsomales des macrophages. La dégradation de l'hème implique les étapes suivantes

  • L'enzyme hème oxygénase convertit l'hème en biliverdine
  • L'enzyme biliverdine réductase réduit la biliverdine pour former de la bilirubine

La bilirubine ainsi formée est libérée dans le sang. Comme la bilirubine est insoluble dans l'eau, elle est immédiatement liée à l'albumine pour former un complexe bilirubine-albumine. Ce complexe transporte la bilirubine vers les hépatocytes où elle est convertie en diglucuronide de bilirubine soluble dans l'eau. Le diglucuronide de bilirubine est ensuite libéré dans la bile.

La bilirubine est convertie en d'autres métabolites lors de son passage dans le système digestif.


Les amorces tout-en-un validées par qPCR font le travail

Éliminez les ajustements et les optimisations sans fin avec la qPCR de précision de GeneCopoeia. Ajoutez simplement les amorces tout-en-un et commencez.

Les amorces tout-en-un qPCR spécifiques à l'homme, à la souris ou au rat sont conçues par un algorithme propriétaire et validées & dagger pour des performances de précision. La validation de l'amorce comprend une courbe de fusion pour assurer l'amplification de l'ADN cible correct (figure 2).

Lorsqu'elles sont utilisées en combinaison avec le mélange All-in-One SYBR ® Green qPCR, les amorces All-in-One offrent des performances élevées fiables et reproductibles dans les tests PCR quantitatifs.

Courbes d'amplification
Courbes de fusion Résultat de la validation de l'électrophorèse sur gel d'agarose

Figure 3. Quarante-cinq paires d'amorces qPCR All-in-One&trade spécifiques au gène ont été validées expérimentalement pour produire un seul pic de courbe de dissociation et pour générer une seule amplification de la taille correcte pour les gènes ciblés. Un pool d'ADNc, contenant des produits de transcription inverse de l'ARN total de 10 tissus humains différents (poumon, foie, testicule, ovaire, rate, cerveau, placenta, pancréas, cœur et mammaire), a été utilisé comme modèle de validation qPCR. La qPCR a été réalisée à l'aide d'une amorce 0,2 & microM avec un mélange qPCR tout-en-un 2X. Les réactions ont été incubées pendant 10 min. à 95°C, suivi de 40 cycles de 95°C pendant 10 sec. 60°C, 20 sec. et 72°C, 15 sec. à l'aide de l'instrument Bio-Rad iQ5. A la fin du dernier cycle, la température a été augmentée de 72 à 95°C pour produire une courbe de fusion. Courbes d'amplification, courbes de fusion et électrophorèse sur gel d'agarose (résultat de validation positif dans la voie impaire et aucun contrôle de matrice (NTC) dans la voie paire) indiqués pour les 10 échantillons.

* L'amplification non spécifique et l'absence d'amorces-dimères sont assurées lorsque les amorces PCR validées tout-en-un et le mélange PCR sont utilisés ensemble.
&dagger Primers validés automatiquement pour l'homme, la souris et le rat. Renseignez-vous pour la validation d'autres espèces.


Résultats

La stratégie du système à trois équations

Comment des estimations fiables pour le L, KR et KT Les paramètres mécaniques MWC des courbes de saturation en hémoglobine peuvent-ils être obtenus ? Comme indiqué ci-dessus, des estimations fiables de la Lc 4 et LKR 4 paramètres composés peuvent être obtenus en ajustant les données de saturation en hermoglobine (en fonction de [S]) à une équation MWC modifiée [33]. Les Lc 4 et LKR 4 paramètres, avec leurs valeurs estimées, représentent deux équations à trois inconnues. Prendre conscience des valeurs des trois L, KR et KT paramètres de chaque courbe de saturation en hémoglobine dans les ensembles de données nécessite donc une troisième équation. En utilisant la condition initiale de demi-saturation (où ), nous avons ajouté une troisième expression délimitant la dépendance du milieu de transition MWC ([P50] MWC ) sur le L, KR et KT paramètres du modèle. On obtient ainsi un système à trois équations (TES) à trois inconnues qui est traitable pour une solution analytique (voir Méthodes). Les vastes ensembles de données évolutives et physiologiques pour l'hémoglobine compilés dans la méta-analyse de la fonction de l'hémoglobine [33] offrent la possibilité de tester les performances de la stratégie TES. Estimations des valeurs du composé Lc 4 et LKR 4 et p50 paramètres pour 27 courbes de saturation en oxygène de l'hémoglobine de mammifère, toutes obtenues dans des conditions physiologiques similaires (l'ensemble de données évolutif), et pour les courbes de saturation en oxygène de l'hémoglobine humaine obtenues dans diverses conditions expérimentales (je.e., pH différent, CO2 pression et les concentrations de 2,3-bisphosphoglycérate (2,3-BPG) l'ensemble de données physiologiques) ont été précédemment rapportés [33].

La stratégie TES fournit des estimations fiables pour les paramètres MWC des courbes d'ensemble de données évolutives de l'hémoglobine

La stratégie ci-dessus a été initialement appliquée à l'ensemble de données sur l'évolution de l'hémoglobine. Chaque courbe de saturation en oxygène de l'hémoglobine des mammifères est caractérisée par les trois équations ci-dessus, avec leur y1, oui2 Andy3 valeurs indiquées dans la réf. [33]. La résolution d'un tel système à trois équations pour chaque hémoglobine de mammifère dans l'ensemble de données devrait donner jusqu'à quatre racines pour chaque paramètre, comme prévu pour un système d'équations à la puissance quatrième. En effet, sur les 27 systèmes d'équations résolus pour l'ensemble de données évolutif, 17 présentaient deux racines réelles distinctes et deux racines non réelles. Dix systèmes supplémentaires ne présentaient qu'une racine réelle et deux racines imaginaires, reflétant apparemment la convergence des deux racines réelles. Les valeurs des deux racines réelles du L, KR et KT les paramètres des 27 courbes de saturation des ensembles de données sont indiqués dans le tableau 1. Comme on peut le voir, les deux ensembles de solutions réelles se distinguent clairement l'un de l'autre. Alors qu'un ensemble a révélé L, KR et KT valeurs qui semblent physiologiquement saines (tableau 1, colonnes de droite en rouge), les autres non (tableau 1, colonnes de gauche). Par exemple, l'hémoglobine L les valeurs de l'ensemble de solutions physiologiquement saines allaient de 10 4 à 10 9 , comme cela est généralement rapporté dans la littérature [3,11], tandis que celles de l'ensemble non physiologique se sont toutes regroupées autour de L =

1 (tableau 1). Il en est de même pour l'affinité relative c paramètre (= KR/KT). Alors que dans l'ensemble physiologiquement sain, la gamme obtenue de c (10 −2 –10 −3 ) était compatible avec les valeurs rapportées pour l'hémoglobine [3,11], l'ensemble de solutions non physiologiques présentait des valeurs de rapport d'affinité beaucoup plus élevées pour presque toutes les courbes, de l'ordre de 0,1 à 0,3 (tableau 1 ). En outre, les 17 systèmes de mammifères comprenant l'ensemble de solutions physiologiquement saines contenaient trois exemplaires indépendants pour l'hémoglobine humaine, obtenus à partir de différents laboratoires (voir les références dans le tableau 1), fournissant ainsi un contrôle interne pour valider notre stratégie. Comme on peut le voir dans le tableau 1, relativement similaire L et c des valeurs ont été obtenues pour chaque répétition dans les triplicats humains qui sont en bon accord avec celles rapportées dans la littérature (


Voir la vidéo: LHémoglobine: Quest-ce que cest? et quel son rôle dans le transport doxygène? (Janvier 2022).