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8.4 : Détection, identification et quantification d'acides nucléiques et de protéines spécifiques - Biologie


Alors que l'électrophorèse sur gel peut être utilisée pour résoudre des molécules dans un mélange, en soi, la technique ne permet pas la détection et l'identification de séquences d'acide nucléique ou de protéines spécifiques. Par exemple, le gel 2-D montré ci-dessus sépare clairement un grand nombre de protéines dans un échantillon en taches individuelles. Cependant, si nous voulions savoir si une protéine spécifique était présente, nous ne pouvions pas le dire en regardant simplement le gel. De même, dans un gel d'agarose, alors que les bandes d'ADN pouvaient se voir attribuer une taille, on ne pouvait pas distinguer entre deux ADN de séquences différentes s'ils étaient tous les deux de la même longueur en paires de bases. Une façon de détecter la présence d'un acide nucléique ou d'une protéine particulière dépend du transfert des molécules séparées des gels sur une membrane en nitrocellulose ou en nylon pour créer une « tache » et en sondant la ou les molécules d'intérêt à l'aide de réactifs qui se lient spécifiquement à ces molécules. La section suivante discutera de la façon dont cela peut être fait pour les acides nucléiques ainsi que pour les protéines.

Blots du sud et du nord

Le Southern blot porte le nom de son inventeur, le professeur d'Oxford, Edwin Southern, qui a mis au point un protocole pour transférer des fragments d'ADN d'un gel sur une feuille de nitrocellulose et détecter une séquence d'ADN spécifique parmi les bandes sur le blot. Comme le montre la figure 8.21, la méthode fonctionne comme suit. Un mélange de molécules d'ADN (souvent de l'ADN qui a été coupé en fragments plus petits à l'aide d'endonucléases de restriction) est chargé sur un gel d'agarose, comme d'habitude. Une fois l'analyse sur gel terminée, les bandes d'ADN sont transférées du gel sur une membrane. Ceci peut être réalisé par transfert capillaire, où le gel est placé en contact avec un morceau de membrane et le tampon est tiré à travers le gel en l'évacuant dans une pile de papier absorbant placé au-dessus de la membrane. Lorsque le tampon se déplace, il transporte avec lui les fragments d'ADN. L'ADN se lie à la membrane en laissant une « empreinte » de fragments d'ADN qui reflète exactement leurs positions dans le gel. La membrane de transfert peut être traitée avec de la lumière UV, de la chaleur ou des produits chimiques pour attacher fermement l'ADN à la membrane.

Ensuite, une sonde ou un agent de visualisation spécifique de la molécule d'intérêt est ajouté à la membrane. Dans la figure 8.21, cela s'appelle une sonde marquée. Les sondes dans un Southern blot sont des morceaux d'ADN conçus pour être complémentaires de la séquence cible souhaitée. Si la séquence d'intérêt est présente sur le blot, la sonde, qui lui est complémentaire, peut s'apparier (s'hybrider) avec elle. Le transfert est ensuite lavé pour éliminer toute sonde non liée. Les sondes sont marquées avec de la radioactivité ou avec d'autres réactifs chimiques qui leur permettent d'être facilement détectées lorsqu'elles sont liées au transfert, il est donc possible de déterminer visuellement si la sonde s'est liée à l'une des bandes d'ADN sur le transfert. Étant donné que le Southern blot repose sur un appariement de bases spécifique entre la sonde et la séquence cible, il est facile d'adapter la technique pour détecter également des molécules d'ARN spécifiques. La modification de cette méthode pour détecter les ARN a été nommée en plaisantant un transfert « nordique ».


Figure 8.21 - Schéma de transfert Northern ou Southern. Le transfert de Southern ajoute une dénaturation des brins entre les étapes 4 et 5. Wikipedia

Western Blot

Les protéines ne peuvent pas, pour des raisons évidentes, être détectées par appariement de bases avec une sonde d'ADN, mais les transferts de protéines, réalisés en transférant des protéines, séparées sur un gel, sur une membrane, peuvent être sondés à l'aide d'anticorps spécifiques contre une protéine d'intérêt particulière. La détection des protéines utilise généralement deux anticorps, dont le premier n'est pas marqué. L'étiquette se trouve sur le deuxième anticorps, qui est conçu pour reconnaître uniquement le premier anticorps de manière superposée. Le premier anticorps se lie spécifiquement à la protéine d'intérêt sur le transfert et le second anticorps reconnaît et se lie au premier anticorps. Le second anticorps porte généralement une enzyme ou un réactif qui peut provoquer une réaction pour produire une couleur lors d'un traitement ultérieur. Au final, si la molécule d'intérêt se trouve dans le mélange d'origine, elle va « s'allumer » et se révéler sur le blot. Cette variation sur le thème du buvard a été baptisée western blot (figure 8.22).


Figure 8.22 - Résultat d'une analyse western blot. Wikipédia

Dans chacun des transferts décrits ci-dessus, la liaison de la sonde à la molécule cible permet de déterminer si la séquence ou la protéine cible était dans l'échantillon. Bien que les transferts soient conçus pour être utilisés pour la détection, plutôt que pour une quantification précise, il est possible d'obtenir des estimations de l'abondance de la molécule cible à partir de mesures de densitométrie de l'intensité du signal.

Microarrays

Les gels 2D sont un moyen d'étudier simultanément un large spectre de molécules de protéines. Une approche pour faire quelque chose de similaire avec de l'ADN ou de l'ARN implique ce qu'on appelle des puces à ADN. Les puces à ADN sont particulièrement utiles pour surveiller les expressions de milliers de gènes, simultanément. Là où un Northern blot permettrait l'identification d'un seul ARNm à partir d'un mélange d'ARNm, une expérience de microarray peut permettre l'identification simultanée de milliers d'ARNm pouvant être fabriqués par une cellule à un moment donné. Il est également possible d'effectuer une quantification de manière beaucoup plus fiable qu'avec un blot.

Les puces à ADN utilisent une lame de verre, ou puce, à laquelle sont attachées de courtes séquences d'ADN simple brin, disposées dans une grille ou une matrice (Figure 8.23) Chaque position dans la grille correspond à un gène unique. C'est-à-dire que la séquence d'ADN à cet endroit fait partie de la séquence d'un gène spécifique. Chaque point sur la grille a plusieurs copies identiques de la même séquence. La séquence du gène immobilisé à chaque position de la grille est enregistrée.


Figure 8.23 ​​- Conception de puces à ADN. Image de Taralyn Tan

À la lame sont ajoutés un mélange de molécules d'échantillon, dont certaines reconnaîtront et se lieront spécifiquement aux séquences de la lame. La liaison entre les molécules de l'échantillon et les séquences attachées à la lame se produit par appariement de bases, dans le cas des puces à ADN. La lame est ensuite lavée pour éliminer les molécules d'échantillon qui ne sont pas spécifiquement liées aux séquences de la grille.

Les molécules d'échantillon sont marquées avec un colorant fluorescent, permettant d'identifier les points où elles se lient. La grille est analysée spot par spot pour la liaison des molécules de l'échantillon aux séquences immobilisées. Plus les molécules d'échantillon sont liées en un point, plus l'intensité de la fluorescence du colorant qui sera observée sera élevée. Les informations de cette analyse peuvent donner des informations sur la présence/l'absence/l'abondance de molécules dans l'échantillon qui se lient aux séquences de la grille.


Figure 8.24 - Analyse microarray à grande échelle du transcriptome de souris. Wikipédia


Détection d'une molécule unique de séquences d'acides nucléiques spécifiques dans l'ADN génomique non amplifié

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Résumé

Nous décrivons une approche générale pour la microcapture d'affinité de protéines de liaison aux acides nucléiques spécifiques au site. Les principales difficultés pour développer cette méthode en un protocole largement applicable découlent de la nécessité d'un enrichissement massif et de la liaison accidentelle et étendue de protéines non spécifiques à l'appât. Sur la base d'une analyse détaillée, nous proposons (i) un fractionnement en une étape d'extraits bruts sur la phosphocellulose P11, suivi de (ii) une série discrète de sélections positives/négatives sur l'ADN de ligand de type sauvage et muté dans un format microparticulaire magnétique, avec des aimants au cobalt, des ligands concatémérisés et biotinylés, des conditions salines sélectives et des ADN compétiteurs améliorés. Nous présentons également des règles pour déterminer le nombre et l'ordre précis des sélections. L'approche et le protocole ont permis d'isoler quatre facteurs de transcription et répresseurs de faible abondance à partir de 2 × 10 9 cellules leucémiques cultivées. Les protéines capturées étaient 10 à 20 000 fois enrichies à partir de l'extrait nucléaire, sous une forme et des quantités qui permettaient une identification facile des protéines basée sur MALDI-TOF et TOF/TOF MS. C'est 1 à 2 ordres de grandeur de mieux que de nombreux efforts précédents et en une fraction du temps (∼1 facteur/semaine). La méthode peut être appliquée à toute protéine qui se lie à l'ADN, y compris celles ayant une affinité modeste à faible, et relie les études biochimiques fonctionnelles sur la réplication, la régulation transcriptionnelle et la réparation de l'ADN avec la puissance analytique de la protéomique basée sur la spectrométrie de masse.

À qui la correspondance doit être adressée au Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, 1275 York Avenue, New York, NY 10021. Téléphone : (212) 639-8923. Courriel : [e-mail protected]


Méthodes de quantification de l'acide nucléique

Il existe plusieurs techniques de laboratoire courantes utilisées pour estimer la concentration d'un échantillon d'acide nucléique. Une idée fausse commune, cependant, est que toutes ces méthodes ont une précision similaire ou même mesurent la même chose : combien d'ADN ou d'ARN se trouve dans l'échantillon. En fait, chaque méthode mesure quelque chose de différent. Selon la méthode que vous choisissez, la contamination ou d'autres problèmes peuvent conduire à une estimation incohérente de la concentration.

Spectrophotométrie

La loi de Beer-Lambert relie l'absorption de la lumière aux propriétés du matériau à travers lequel la lumière se déplace. Cette loi stipule qu'il existe une dépendance logarithmique entre la transmission de la lumière à travers une substance et le produit du coefficient d'absorption de la substance par la longueur du trajet (figure 1). Pour l'ADN et l'ARN, les cycles hétérocycliques de nucléotides (adénine, guanine, cytosine et thymine/uracile) permettent aux molécules d'acide nucléique d'absorber au maximum la lumière ultraviolette (UV) à 260 nm (&lambdamax = 260 nm).

A = absorbance à une longueur d'onde particulière
&epsilon = coefficient d'extinction
b = longueur de trajet du spectrophotomètre
c = concentration de l'échantillon

Figure 1. Loi de Beer-Lambert pour le calcul de la concentration d'un analyte par absorbance UV.

La loi de Beer-Lambert peut être utilisée avec les coefficients d'extinction appropriés pour déterminer la concentration en acides nucléiques.

Concentration (ng/ul) = [Absorbance (AU) x Coefficient d'extinction] / Longueur du trajet (cm)

Coefficients d'extinction :
ADNdb : 50ng-cm/µl
ADNsb : 33ng-cm/µl
ARN : 40ng-cm/µl

Pour la plupart des instruments commerciaux, les lectures fiables de la quantification spectrophotométrique (A260) se situent entre 0,1 et 1,5. Sur un spectrophotomètre avec un trajet optique de 1 cm, la plage dynamique théorique de l'ADN équivaudrait à 5&ndash75ng/µl. L'instrument NanoDrop®-2000 revendique une longueur de trajet aussi faible que 0,05 mm (0,005 cm) permettant une plage dynamique théorique de 2&ndash15,000 ng/µl. Bien que cette plage permette la détection de concentrations élevées d'ADNdb, la plage basse de 2ng/µl (5) n'est pas très sensible si l'on considère la faible concentration d'acides nucléiques trouvée dans de nombreux types d'échantillons courants (par exemple, plasma, liquide céphalorachidien, urine, aspiration à l'aiguille, microdissection par capture laser, cellules individuelles et tissus FFPE, etc.) La précision est également une préoccupation majeure pour la spectrophotométrie UV. Alors que les acides nucléiques absorbent au maximum à 260 nm, d'autres contaminants courants absorbent fortement à des longueurs d'onde proches de 260 nm. Les solvants tels que la guanidine et le phénol, ainsi que les sels, ont une absorbance maximale autour de 230 nm, tandis que les protéines contribuent à 230 nm et 280 nm. Ces pics voisins, s'ils sont présents dans un échantillon, gonfleront la lecture à 260 nm. De plus, l'ADNdb, l'ADNsb, l'ARN, les nucléotides libres et les amorces ne peuvent pas être distingués les uns des autres dans un échantillon (5 Figure 2).

Figure 2. La contamination par l'ARN dans un échantillon d'ADN conduit à une surestimation de la concentration d'ADN par spectrophotométrie UV. L'ADN extrait de la culture cellulaire K562 a été enrichi d'ARN. Panneau A. Deux échantillons indépendants ont été passés sur un gel d'agarose avec (+) ou sans (-) RNase pour visualiser la présence de chaque espèce d'acide nucléique. Panneau B. Des échantillons d'ADN non traités à la RNase (-) ont été quantifiés par spectrophotométrie UV à l'aide d'un instrument NanoDrop® et de QuantiFluor® dsDNA Dye, une méthode plus spécifique à base de colorant fluorescent.

Fluorescence

La fluorométrie, également connue sous le nom de spectrofluorométrie (ci-après appelée simplement fluorescence) est un autre type de spectroscopie électromagnétique qui analyse la lumière émise par des molécules fluorogènes appelées fluorophores. Les fluorophores répondent distinctement à la lumière par rapport aux autres molécules. Lorsqu'un photon de lumière d'excitation est absorbé par un électron d'un fluorophore, le niveau d'énergie de l'électron augmente jusqu'à un état excité. Pendant la courte période d'excitation, une partie de l'énergie est dissipée et l'énergie restante est émise sous forme de photon pour détendre l'électron à l'état fondamental. Étant donné que le photon émis transporte généralement moins d'énergie et a donc une longueur d'onde plus longue que le photon d'excitation, la fluorescence émise peut être distinguée de la lumière d'excitation avec un fluoromètre (Figure 3).

Figure 3. Principe d'utilisation des colorants fluorescents dans la quantification des acides nucléiques. Panneau du haut. Physique simplifiée d'un fluorophore. Panneau du bas. Spectres d'excitation et d'émission du colorant QuantiFluor® dsDNA.

Les méthodes de quantification à base de colorant fluorescent tirent parti de ce mécanisme en utilisant des molécules de colorant qui ont été conçues pour lier préférentiellement une espèce donnée d'acide nucléique. Lorsqu'un colorant ADNdb, par exemple, est excité par une longueur d'onde de lumière donnée, seul le colorant à l'état lié à l'ADNdb sera fluorescent. Lorsque le colorant se lie à l'acide nucléique cible, le rendement quantique de fluorescence augmente en fonction du changement de géométrie moléculaire du fluorophore. Cet aspect de la technique de quantification de fluorescence, en conjonction avec la liaison préférentielle colorant:cible, entraîne un faible signal de fond, une précision et une spécificité élevées, ce qui le rend idéal pour la quantification d'échantillons d'acides nucléiques de faible niveau (Figure 4).

Figure 4. La quantification basée sur la fluorescence démontre une large plage dynamique quantitative et une détection préférentielle de la cible par rapport aux autres espèces d'acides nucléiques. Panneau du haut. La courbe standard représentative du système QuantiFluor® ONE dsDNA permet une quantification supérieure à 0,2&ndash400ng. Panneau du bas. Dans un dosage d'ADNdb, le signal fluorescent est dû principalement à l'ADNdb, même en présence de quantités équimolaires d'ADNsb et d'ARN sur toute la plage dynamique du dosage (0,2&ndash400ng/µl).

Pour que ce type de dosage soit quantitatif, une série de dilutions d'échantillon de concentration connue est utilisée pour créer une courbe standard. Un fluoromètre est utilisé pour lire et enregistrer les unités de fluorescence relative (RFU) pour chaque point de la courbe. Ces données formeront une courbe de régression qui peut être utilisée avec des analyses d'ajustement linéaire (y=mx+b) ou de puissance (y=axb) pour interpoler la concentration de tout échantillon inconnu.

Par rapport aux méthodes de spectrophotométrie UV, la fluorescence démontre une spécificité améliorée car elle est moins affectée par les autres composants présents dans les échantillons. En conséquence, les méthodes fluorescentes conduisent à une détermination plus précise de la concentration d'acide nucléique (figure 5).

Figure 5. Concentration d'ADN purifié à partir de matières fécales félines et équines mesurées à l'aide de techniques de spectrophotométrie UV (NanoDrop®) et de fluorescence (QuantiFluor® Dye) avant le séquençage métagénomique 16s.

PCR en temps réel (qPCR)

La PCR en temps réel (également connue sous le nom de qPCR) est une technique qui repose sur un cycle thermique consistant en des cycles répétés de chauffage et de refroidissement pour la fusion de l'ADN et la réplication enzymatique des amplicons ciblés par l'ADN polymérase. Après n cycles de cyclage thermique, un total de 2n produits PCR sont formés. Les instruments de détection mesurent l'accumulation de produit d'ADN après chaque cycle d'amplification PCR à l'aide de reporters fluorescents. Les rapporteurs peuvent être soit des colorants comme le vert SYBR®, soit des sondes telles que TaqMan®. L'ARN peut être mesuré avec le même processus après une étape préliminaire de transcription inverse (RT) le convertissant en ADNc.

Les données primaires d'une expérience de PCR en temps réel sont une courbe d'amplification, qui montre le signal fluorescent en unités fluorescentes relatives (RFU) par rapport au nombre de cycles et trace l'accumulation de produit amplifié. La ligne de base est mesurée au début du processus d'amplification avant que l'instrument puisse détecter la formation de produit. Au fur et à mesure que le produit s'accumule, il atteint un point où l'instrument est capable de détecter le changement de signal au-dessus du niveau de fond - c'est la partie exponentielle de la courbe.

Le seuil de détection est le niveau de fluorescence où l'accumulation de produit peut être distinguée du bruit de fond. Ce seuil est automatiquement défini au-dessus de la ligne de base, dans la région exponentielle de la courbe d'amplification. Le nombre de cycle où le produit d'amplification franchit ce seuil de détection est le cycle de quantification (Cq) (figure 6).

Figure 6. Exemple d'un graphique d'amplification PCR en temps réel montrant la relation entre la ligne de base, le seuil de détection et le cycle de quantification (Cq).

Une concentration d'échantillon inconnue peut être estimée à partir de son nombre de Cq correspondant lorsqu'elle est comparée à une courbe standard de valeurs de Cq à partir d'échantillons de concentration connue (figure 7).

Figure 7. Exemple de courbe standard pour une expérience de PCR en temps réel. Les valeurs Cq des étalons titrés sont tracées en fonction de leur concentration correspondante. Les valeurs Cq de tout échantillon inconnu peuvent être interpolées à partir de cette courbe par régression linéaire.

La stratégie de quantification PCR en temps réel offre plusieurs avantages par rapport aux autres méthodes :

  1. La PCR en temps réel offre la détection la plus sensible, aussi faible que des quantités de picogrammes d'acide nucléique.
  2. La PCR en temps réel peut quantifier avec précision un sous-ensemble d'acides nucléiques d'intérêt, même en présence de contaminants courants, d'autres acides nucléiques, d'amorces et de nucléotides libres. En effet, les amorces PCR peuvent être conçues pour des cibles spécifiques de séquences (telles que certains domaines, espèces ou gènes) (figures 8 et 9).

Parce que la PCR en temps réel exploite la réplication enzymatique de l'ADN polymérase, elle ne mesure que les molécules amplifiables. L'implication est que les échantillons et les fragments hautement dégradés qui ne s'amplifient pas dans un essai en aval ne contribuent pas non plus à une estimation de la concentration.

Figure 8. Les échantillons d'ADN quantifiés par trois méthodes courantes présentent une disparité de concentrations liée à la méthode de quantification. L'ADN a été purifié à partir de boucles de tissu FFPE du poumon, du côlon et du sein à l'aide de l'instrument Maxwell® et de la chimie de purification Maxwell DNA FFPE. Quatre boucles FFPE ont été échantillonnées à partir de deux blocs de tissus distincts pour les trois types de tissus. L'ADN a été quantifié à l'aide du Fluoromètre NanoDrop® 2000, Quantus&trade avec QuantiFluor® ONE dsDNA Dye, et par amplification PCR en temps réel avec des amorces DNaseP et des sondes Taqman®.

Figure 9. Quantification de l'ADN des bibliothèques Illumina NGS avec à la fois la fluorescence et la PCR en temps réel. Les bibliothèques Illumina ont été créées à partir d'échantillons ccfDNA purifiés à l'aide du kit de préparation de bibliothèque d'ADN NEBNext® Ultra&trade II et la concentration finale de la bibliothèque déterminée par deux méthodes. La fluorescence et la PCR en temps réel ne détectent que l'ADN dans ces échantillons, mais la PCR en temps réel ne cible spécifiquement que les fragments de bibliothèque ligaturés par adaptateur, tandis que la fluorescence ne peut pas différencier les molécules de bibliothèque entièrement ligaturées et les fragments ou séquences adaptateurs non ligaturés. Seules les molécules de bibliothèque entièrement ligaturées contribueront à la génération et au séquençage des clusters.

SHERLOCK - Déverrouillage enzymatique spécifique à haute sensibilité du rapporteur

Cas13 (C2c2) a été identifié pour la première fois en 2016 par le laboratoire de Zhang comme une RNase guidée par l'ARN ( Abudayyeh et al 2016 ). Cas13 peut être guidé par un seul ARN CRISPR (crRNA) pour cliver l'ARNss ou l'ARNm. Il présente également un « effet collatéral » de clivage non spécifique de l'ARNss.

Comment fonctionne SHERLOCK ?

Cas13 peut être programmé avec un ARNcr pour cibler un ARNss d'intérêt, par exemple, une séquence spécifique d'un virus ou d'un agent pathogène. Une fois que Cas13 reconnaît et se lie à la séquence programmée, il peut scinder les molécules d'ARNss avoisinantes. Dans SHERLOCK, un reporter ARNsb fluorescent désactivé est ajouté à la réaction. Le clivage de l'ARN fluorescent quenchable par le Cas13 « activé » produit un signal quantifiable qui indique la présence de votre acide nucléique ciblé. Pour augmenter la sensibilité du test, l'ADN ou l'ARN ciblé d'un échantillon est d'abord amplifié à l'aide de RPA (amplification par recombinase polymérase) ou de transcriptase inverse (RT)-RPA, respectivement. La RPA est couplée à la transcription T7 pour convertir l'ADN amplifié en ARN pour une détection ultérieure par Cas13. Cette étape d'amplification en combinaison avec le rapporteur ssRNA permet à SHERLOCK de détecter l'ADN ou l'ARN avec une sensibilité atomique et une spécificité de mésappariement d'une seule paire de bases.

SHERLOCKv2

SHERLOCK avait quelques limitations lors de son introduction en 2017, de sorte que le laboratoire a apporté d'autres modifications pour améliorer son système de détection. Ils ont nommé ce système SHERLOCKv2 pour SHERLOCK version 2. Voici quelques-unes des améliorations :

  • SHERLOCKv2 utilise beaucoup moins d'amorces dans l'étape de pré-amplification, ce qui permet une plus grande quantification sans compromettre la sensibilité.
  • Pour détecter plusieurs cibles dans une réaction, les enzymes Cas, telles que les variations de Cas13 et Cas12a, sont combinées avec différents rapporteurs fluorescents pour chaque enzyme.
  • De plus, Csm6, une nucléase effectrice CRISPR de type III, peut être utilisée en conjonction avec Cas13 pour amplifier le signal d'une cible unique. Le Csm6 peut cliver l'ARNss complémentaire d'un ARNcr d'intérêt (Niewoehner et Jinek, 2016) et est commodément activé par les sous-produits de clivage de l'ARNss Cas13. Ainsi, la liaison de Cas13 à la région d'intérêt programmée conduirait à la fois au clivage d'un rapporteur spécifique de Cas13 et à l'activation de Csm6. Le laboratoire de Zhang a montré qu'en ajoutant du Csm6 et un rapporteur spécifique au Csm6 (dans le même canal fluorescent que le rapporteur Cas13), ils pouvaient considérablement amplifier le signal de détection pour une seule cible.
  • SHERLOCKv2 a été adapté afin qu'un rapporteur clivé puisse être détecté sur des bandes à flux latéral commerciales, similaires aux tests de grossesse. Avec les bandelettes à flux latéral, la présence de votre ADN ou ARN d'intérêt dans un échantillon donné est simplement déterminée par le nombre de bandes présentes sur la bandelette. Ce type de lecture permet la détection d'acides nucléiques presque n'importe où, car les bandes à flux latéral sont faciles à transporter et fonctionnent rapidement, fournissant des résultats fiables en aussi peu qu'une heure.

Applications du système de détection SHERLOCK

Le laboratoire de Zhang a démontré que SHERLOCK pouvait faire la distinction de manière fiable entre Zika et un virus étroitement apparenté, la dengue, à partir de plusieurs sources d'échantillons. SHERLOCK pourrait également détecter des mutations cancéreuses à basse fréquence à partir de fragments d'ADN acellulaires ainsi que des polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) liés à la santé de la salive humaine.

SHERLOCKv2 fournit une méthode pour détecter les acides nucléiques avec une sensibilité et une spécificité élevées sans compromettre la vitesse, la facilité d'utilisation et la portabilité. Cette méthode peut être utilisée pour un éventail d'applications, y compris le diagnostic clinique (par exemple, la détection d'agents pathogènes ou de virus), la thérapeutique et le génotypage sensible. La beauté des systèmes SHERLOCK est qu'ils peuvent être utilisés facilement et efficacement en laboratoire et sur le terrain (Myhrvold et al., 2018).

Maintenant, le laboratoire Zhang a partagé un protocole d'utilisation de SHERLOCK pour détecter l'ARN du SRAS-CoV-2. Le test est démarré en utilisant de l'ARN purifié à partir d'échantillons de patients et peut être lu à l'aide d'une jauge en moins d'une heure. Bien que le laboratoire souligne que le protocole n'est pas approuvé pour une utilisation clinique à ce stade, ils espèrent que le protocole servira de plate-forme pour faire avancer les diagnostics.


Figure 3

Figure 3. (a) AuNP compte en fonction de la concentration d'une séquence aléatoire et de l'ADN cible de 40 nucléotides en présence d'une séquence aléatoire de 20 nM. Encart : le graphique du logarithme du nombre d'AuNP en fonction de la concentration d'ADN cible. L'ADN séquencé au hasard est 5'-GGGTTGGGTGGGACTCACCAGCTCCAACTACCACAAGTTTGG-3'. (b) AuNP compte avec 100 pM (barres noires) ou 0 pM (barres grises) d'ADN cible de 40 nucléotides en présence de quantités croissantes d'ADNc. La ligne pointillée représente les valeurs moyennes des résultats de l'ADNct uniquement.

Pour tester le potentiel de la méthode proposée pour des applications plus pratiques, nous avons en outre appliqué cette méthode pour détecter l'ADN cible dans le lysat cellulaire Hela, car le lysat cellulaire est de manière réaliste une matrice complexe contenant une variété de protéines, d'ADN génomique, d'ARN total et d'autres contaminants. . Plus précisément, un échantillon de lysat de cellules Hela dilué a été dopé avec de l'ADN cible à deux niveaux de concentration. Il a été constaté que le pourcentage de récupération de la pointe (m = 3) était de 109,3 % pour la cible de 20 pM et de 110,5 % pour la cible de 100 pM avec un écart type relatif (RSD) de 9,2 % et 4,7 %, respectivement. Ces résultats préliminaires ont montré que la méthode proposée a la faisabilité d'une application avec des échantillons biologiques.

En résumé, nous avons démontré avec succès une stratégie de non-amplification pour la détection des acides nucléiques au niveau femtomolaire basée sur le comptage automatique des AuNPs avec le microscope à fond noir. Cette méthode combine la technique de comptage de nanoparticules plasmoniques uniques hautement sensible avec la séparation magnétique pour obtenir de meilleures performances analytiques avec une procédure simple. L'approche de comptage de particules évite la fixation du spectromètre coûteux à la configuration du microscope à fond noir et est immunisée contre l'hétérogénéité de la taille et de la morphologie des nanoparticules. De plus, le procédé peut être mis en œuvre sans qu'il soit nécessaire d'impliquer une enzyme et d'autres réactifs complexes, ainsi que des procédures fastidieuses. De plus, cette conception de liaison sandwich rend en principe cette plate-forme de détection facilement extensible à d'autres cibles d'intérêt.


Résumé

La capacité de détecter des séquences d'acides nucléiques spécifiques permet une large gamme d'applications telles que l'identification d'agents pathogènes, les diagnostics cliniques et le génotypage. Les protéines CRISPR-Cas Cas12a et Cas13a sont des endonucléases guidées par ARN qui se lient et clivent respectivement des séquences spécifiques d'ADN et d'ARN. Après reconnaissance d'une séquence cible, les deux enzymes activent le clivage indiscriminé des acides nucléiques, qui a été exploité pour le diagnostic moléculaire spécifique à la séquence des acides nucléiques. Ici, nous présentons une approche de détection sans étiquette qui utilise une lecture basée sur la turbidité de la solution causée par la séparation de phase liquide-liquide (LLPS). Notre approche repose sur le fait que la LLPS des polymères de charges opposées nécessite que les polymères soient plus longs qu'une longueur critique. Cette dépendance à la longueur est prédite par le modèle de Voorn-Overbeek, que nous décrivons en détail et validons expérimentalement dans des mélanges de polynucléotides et de polycations. Nous montrons que la turbidité résultant de LLPS peut être utilisée pour détecter la présence de séquences d'acides nucléiques spécifiques en utilisant les nucléases CRISPR programmables Cas12a et Cas13a. Étant donné que les LLPS des polynucléotides et des polycations rendent les solutions troubles, la détection de séquences d'acides nucléiques spécifiques peut être observée à l'œil nu. Nous démontrons en outre qu'il existe une concentration optimale de polynucléotides pour la détection. Enfin, nous fournissons une prédiction théorique qui suggère des améliorations possibles d'un test de détection basé sur LLPS. Le déploiement de LLPS complète les applications de diagnostic moléculaire basées sur CRISPR et facilite la détection de séquences nucléotidiques facile et peu coûteuse.


8.4 : Détection, identification et quantification d'acides nucléiques et de protéines spécifiques - Biologie

un laboratoire clé d'État de biologie chimique médicinale, Université de Nankai, Tianjin 300071, République populaire de Chine
E-mail: [email protected], [email protected]

b Tianjin Key Laboratory of Biosensing and Molecular Recognition, Research Center for Analytical Sciences, College of Chemistry, Nankai University, Tianjin 300071, R.P. Chine

c Collège des sciences de la vie, Université de Nankai, Tianjin 300071, République populaire de Chine

Résumé

Ces dernières années, l'ADN a été largement reconnu comme une sorte de matériau qui peut être utilisé pour construire des blocs de construction pour la biodétection, in vivo l'imagerie, le développement de médicaments et le traitement des maladies en raison de ses avantages de bonne biocompatibilité et de propriétés programmables. Cependant, les processus de détection traditionnels basés sur l'ADN sont principalement obtenus par diffusion aléatoire de sondes d'ADN libres, qui étaient limitées par une dynamique limitée et une efficacité relativement faible. De plus, dans l'application des biosystèmes, les sondes d'ADN simple brin sont confrontées à des défis tels qu'être difficiles à internaliser dans les cellules et être facilement décomposées dans le microenvironnement cellulaire. Pour surmonter les limitations ci-dessus, les sondes à base de nanostructures d'ADN ont attiré une attention intense. Ce type de sonde a montré une série d'avantages par rapport aux sondes conventionnelles, notamment une biostabilité accrue, une efficacité d'internalisation cellulaire améliorée, une vitesse de réaction accélérée et une sortie de signal amplifiée, et donc améliorée in vitro et in vivo applications. Par conséquent, examiner et résumer les rôles importants des nanostructures d'ADN dans l'amélioration de la conception des biocapteurs est très nécessaire pour le développement de la nanotechnologie de l'ADN et de ses applications en biologie et en pharmacologie. Dans cette perspective, les sondes à base de nanostructures d'ADN sont passées en revue et résumées sous plusieurs aspects : la classification des sondes selon les dimensions des nanostructures d'ADN (une, deux et trois dimensions nanostructures), les modes de connexion communs entre les sondes d'acide nucléique et les nanostructures d'ADN, et les avantages les plus importants des nanostructures auto-assemblées d'ADN dans les applications de biodétection, d'analyse d'imagerie, d'assemblage cellulaire, de capture cellulaire et de théranostique. Enfin, les défis et les perspectives pour le développement futur de sondes d'acides nucléiques à base de nanostructures d'ADN sont également discutés.


Anastasiya Kostyusheva : Conceptualisation, visualisation, rédaction - brouillon original, rédaction - révision & édition. Sergueï Brezgin : Rédaction - révision & édition. Youri Babin : Ressources. Irina Vasilyeva : Ressources. Dieter Glebe : Rédaction - révision & édition, acquisition de financement. Dmitri Kostyushev : Conceptualisation, visualisation, rédaction - brouillon original, rédaction - révision & édition, acquisition de financement. Vladimir Chulanov : Supervision, Rédaction - révision & édition, Acquisition de financement.

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents connus ou de relations personnelles qui auraient pu sembler influencer les travaux rapportés dans cet article.


Sommaire

Alors que la quantification n'est qu'une petite étape dans le flux de travail de préparation d'échantillons d'acides nucléiques à multiples facettes, elle peut avoir de grandes implications sur les performances et la validité des conclusions tirées des tests en aval. Les directives de bonnes pratiques telles que MIQE (1), MIAME (5) et MIGS (6), entre autres, reconnaissent l'importance des étapes de contrôle de la qualité telles que la quantification. Ces directives tiennent compte du fait que la bonne technique doit être utilisée et rapportée dans les publications. Cela garantit que les expériences sont reproductibles et que les conclusions sont solides. Actuellement, les méthodes à base de colorant fluorescent sont le plus souvent recommandées pour déterminer la concentration de l'échantillon avant les exercices de normalisation et le chargement dans les analyses avancées en aval. Cette technique représente un juste milieu entre les rigueurs exigées des méthodes de quantification et la praticité de son intégration dans un flux de travail. Chacune des méthodes discutées ici a ses mérites et ses utilisations appropriées (tableau 1). It is ultimately up to each researcher to evaluate what is being measured for a given quantitation technique and choose the method most appropriate for the task at hand.


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