Informations

Images d'embryons réels : Comment les différentes zones (organisateur de discours, zones marginales…) sont-elles connues ?


Dans de nombreux manuels, des figures d'embryons sont dessinées, mais en réalité comment le biologiste sait-il quelle zone est celle d'un embryon en phase de gastrulation ? Sauf la lèvre dorsale ici, je ne peux pas localiser autre chose.


Arkadia améliore la signalisation liée aux nœuds pour induire le mésendoderme

Les membres liés aux nœuds de la famille du facteur de croissance transformant (TGF)-β régulent l'induction du mésoderme, de l'endoderme et du mésendoderme, un tissu spécifique de l'organisateur Spemann 1,2,3,4,5,6,7. Comment ces différents tissus se forment en réponse aux mêmes molécules de signalisation n'est pas complètement compris. Il a été suggéré que les effets dépendants de la concentration, médiés par des cofacteurs et des antagonistes extracellulaires, sont responsables des différences 1,8,9,10. Ici, nous montrons que la protéine nucléaire Arkadia potentialise spécifiquement l'activité induisant le mésendoderme d'un sous-ensemble de membres de la famille TGF-β. Les activités combinées d'Arkadia et Xénope nodal-related-1 sont suffisants pour induire le mésoderme et supprimer le mésoderme. Arkadia dorsalise les tissus ventraux, ce qui entraîne l'induction d'une expression génique spécifique à l'organisateur. Le blocage de la signalisation nodale inhibe ces effets de manière extracellulaire. Arkadia influence l'activité nodale lorsqu'elle est co-exprimée et peut fonctionner dans des cellules adjacentes à celles produisant le signal nodal. Nos résultats, ainsi que l'observation que les souris mutantes Arkadia n'ont pas de nœud et de mésendoderme dérivé de nœuds, identifient Arkadia comme un modulateur essentiel de la cascade de signalisation nodale qui conduit à l'induction de l'organisateur de Spemann.


Résumé

Cette année 2019, marque le centenaire de la découverte par l'embryologiste E. E. Just de ce qu'on appelle le blocage rapide de la polyspermie. L'observation de Just des changements subtils qui se produisent à la surface de l'œuf pendant la fécondation (et dans la parthénogenèse expérimentale) l'a amené à postuler que l'œuf, et en fait chaque cellule, possède une propriété qu'il a appelée irritabilité indépendante, qui représente la capacité de la cellule à répondre d'une manière physiologiquement pertinente à une variété de signaux ou de déclencheurs. Dans cet article, je soutiens que le concept d'irritabilité indépendante de Just a informé son contemporain Johannes Holtfreter alors que Holtfreter tentait d'expliquer les phénomènes d'induction et de compétence embryonnaires et que Holtfreter, à son tour, a influencé Marc Kirschner et John Gerhart dans leur formulation de la théorie de la facilité variation. L'influence de Just est particulièrement évidente dans les présentations de Gerhart et Kirschner de ce qu'ils appellent lien faible— une propriété des systèmes vivants qui permet aux processus et composants de base d'être mélangés et appariés de différentes manières pour générer de nouveaux traits. Malheureusement, le lien entre le travail de Holtfreter et celui de Just est resté caché. Cet article donne des exemples de phénomènes qui présentent un lien faible et expose le cas selon lequel le concept d'irritabilité indépendante de Just, à travers Holtfreter, Gerhart et Kirschner, a largement infiltré la biologie cellulaire et du développement moderne.

"Pourtant, les grands progrès récents dans [notre compréhension de l'importance de la surface cellulaire] nous obligeront à revenir au livre de Just [La biologie de la surface cellulaire] pour réévaluer sa pertinence contemporaine. Peut-être, juste peut-être, pourrait-il être un autre Mendel ou Miescher, faisant un travail fondamental méconnu pendant des décennies après sa mort » (Glass, 1984).


MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Ovocytes et embryons

Les ovocytes ont été défolliculés manuellement et cultivés comme décrit précédemment (Kofron et al., 1999). Les ovocytes ont été injectés avec des oligos en milieu de culture d'ovocytes (OCM) en utilisant deux injections équatoriales par ovocyte pour les oligos XTcf3, ou une injection végétale pour les oligos VegT et Axin, cultivés à 18°C ​​et fécondés en utilisant la technique de transfert d'hôte comme décrit précédemment (Zuck et al., 1998). Des expériences de sauvetage ont été réalisées comme décrit dans le texte soit en injectant de l'ARNm de manière équatoriale dans des ovocytes, 24 heures après l'oligo (Fig. 2F), soit en injectant dans des embryons au stade 4 cellules (Fig. 2E). Les œufs ont été dépouillés et fécondés à l'aide d'une suspension de sperme et les embryons ont été maintenus dans 0,2 × MMR. Pour les injections d'ARNm après la fécondation (Fig. 2E), les embryons ont été dégelés et transférés à 2% de Ficoll dans 0,5 × MMR au stade 1 cellule. Les ARNm ont été dilués avec de l'eau distillée stérile et injectés dans des blastomères.

Pour les tests de calottes animales, les embryons de mi-blastula ont été placés sur des boîtes d'agarose à 2 % dans 1 x MMR et les calottes animales ont été disséquées à l'aide de pinces pointues. Les capuchons ont ensuite été cultivés dans de l'OCM jusqu'à ce que les embryons frères et sœurs atteignent le stade intermédiaire à tardif de la gastrula. Pour les explants équatoriaux, les embryons ont été placés sur des boîtes d'agarose à 2 % au stade mi-blastula et les régions équatoriales ont été disséquées avec des aiguilles de tungstène (Xanthos et al., 2001) et cultivées en OCM jusqu'à ce que les embryons frères et sœurs atteignent le stade mi-neurula. Pour la séparation en moitiés dorsale et ventrale au stade gastrula, la face dorsale des embryons a été marquée au stade à quatre cellules en utilisant des cristaux bleu Nil. L'axe dorsoventral a été reconnu au stade à quatre cellules par les différences de pigmentation des faces dorsale et ventrale. Lorsque les embryons de type sauvage ont atteint le stade 10, tous les lots ont été placés sur des boîtes d'agarose à 2% dans 1 × MMR pH 7,6 et divisés en moitiés dorsale et ventrale, et congelés en groupes de 4 demi-embryons à 2 heures d'intervalle à travers la gastrula étapes.

Oligos et ARNm

Les oligodésoxynucléotides antisens utilisés étaient des oligonucléotides chimériques phosphorothioate-phosphodiester purifiés par HPLC (Sigma/Genosys) avec la composition de base :

XTcf3 T1 : 5′-C*G*A*G*GGATCCCAGTC*T*T*G*G-3′.

XTcf3 T2 : 5′-G*A*G*ATAACTCTGA*T*G*G-3′.

Les oligos XTcf3 sont complètement complémentaires aux quatre variantes de XTcf3. Les astérisques (*) représentent les liaisons phosphorothioate. Les oligos ont été remis en suspension dans de l'eau stérile filtrée et injectés aux doses décrites dans le texte. Toute la longueur XTcf3 dans le vecteur pGlomyc a été linéarisé avec Xbamoi et plafonné XTcf3 L'ARNm a été synthétisé à l'aide du kit T7 mMessage mMachine (Ambion). Les ARN ont été extraits au phénol, précipités à l'éthanol puis remis en suspension dans de l'eau distillée stérile pour injection.

Analyse de l'expression des gènes par RT-PCR en temps réel

L'ARN total a été préparé à partir d'ovocytes, d'embryons et d'explants en utilisant la protéinase K, puis traité avec la DNase sans RNase comme décrit précédemment (Zhang et al., 1998). Environ un sixième d'équivalent embryonnaire d'ARN a été utilisé pour la synthèse d'ADNc avec des amorces oligo(dT) suivie d'une RT-PCR en temps réel et d'une quantification à l'aide du système LightCycler™ (Roche) comme décrit par Kofron et al. (Kofron et al., 2001). Les amorces et les conditions de cyclage utilisées sont répertoriées dans le tableau 1. Les valeurs d'expression relative ont été calculées par comparaison à une courbe standard générée par une dilution en série d'ADNc témoin non injecté. Les échantillons ont été normalisés à des niveaux de ornithine décarboxylase (ODC), qui a été utilisé comme contrôle de chargement. Des échantillons d'eau seule ou des témoins dépourvus de transcriptase inverse dans la réaction de synthèse d'ADNc n'ont pas donné de produits spécifiques dans tous les cas.


GRADIENTS POUR LES AXES PRIMAIRES DU CORPS CHEZ LES VERTÉBRÉS

Il existe deux axes principaux du corps, antéropostérieur (AP) et dorsoventral (DV). Habituellement, cependant, un seul organisateur est supposé exister, l'organisateur de type Spemann. Comment puis deux les systèmes d'information positionnels orthogonaux émergent sous l'influence d'un Célibataire organisateur? Y a-t-il un deuxième organisateur, qui a été jusqu'ici négligé ? Il existe de bons arguments selon lesquels l'organisateur du modèle AP n'est pas l'organisateur de Spemann mais l'ensemble de la zone marginale (Meinhardt 2006). Au début de la gastrula, Wnt est produit dans la zone marginale à l'exception de la région organisatrice (Christian et Moon 1993). Wnt fournit des informations de position pour la séparation en cerveau antérieur et mésencéphale (Kiecker et Niehrs 2001 Nordström et al. 2002 Dorsky et al. 2003). Ce système de formation de motifs est très ancien sur le plan de l'évolution. Une comparaison des expressions géniques dans l'hydre et la gastrula des premiers vertébrés montre une correspondance surprenante, suggérant que la structuration du cerveau et du cœur des vertébrés a évolué à partir d'un système qui était autrefois responsable de la structuration du corps d'un ancêtre semblable à l'hydre (Fig. 2B ) (Meinhardt 2002). Dans cette vue, l'organisateur de l'hydre et le blastopore des vertébrés, c'est-à-dire la zone marginale, l'anneau germinatif, etc., sont des structures homologues responsables de la structuration AP.

Contrairement à l'organisateur de l'hydre, le blastopore des vertébrés a évolué en un énorme anneau, l'organisateur de Spemann formant une petite tache sur cet anneau. L'organisateur Spemann est alors supposé modéliser l'axe DV, mais il le fait indirectement en donnant naissance à la ligne médiane dorsale, à la notocorde et à la plaque de sol - une « ligne haute » et non un « point haut » pour la structuration DV. Les deux régions organisatrices, le blastopore pour l'AP et la ligne médiane pour l'axe DV, forment un système de coordonnées presque cartésien qui permet une structuration combinatoire le long des deux axes (Fig. 2C). La génération d'une seule « ligne haute » longuement étendue pour le motif DV est un processus de formation de motif subtil. La solution des vertébrés n'est pas la seule. Chez les insectes, par exemple, un organisateur dorsal exerce une refouler influence, provoquant l'apparition de la ligne médiane du côté ventral opposé (Meinhardt 2004, 2008), contrairement aux vertébrés chez lesquels l'organisateur initie et allonge la ligne médiane dorsalement. Ce modèle fournit un rationnel pour la localisation dorsale ou ventrale du système nerveux central chez les vertébrés et les insectes, respectivement.


Modèle de mise à l'échelle dépendant de Chordin/Sizzled

Nous avons récemment rapporté le mécanisme moléculaire de la mise à l'échelle dans Xénope embryons (Inomata et al. 2013). Le demi-embryon dorsal doit former un gradient de Chordin approprié en fonction de la taille de l'embryon en régulant trois facteurs, synthèse-diffusion-dégradation. Cependant, si les trois facteurs changent dynamiquement leur valeur, il sera difficile d'analyser le système d'échelle. Pour éliminer cette complexité, nous avons créé artificiellement des cellules sources, qui ont synthétisé une quantité constante de protéine Chordin sans être affectées par la taille de l'embryon ou l'activité BMP (test de reconstitution de l'axe D-V). Tout d'abord, les embryons ont été injectés avec β-caténine-MO et accord/noggin-MO (βCN-MO) pour éliminer respectivement les cellules sources (organisateur) et l'expression de facteurs dorsalisants endogènes (Fig. 4) (Heasman et al. 2000 Oelgeschlager et al. 2003a). Ensuite, à partir de ces embryons complètement ventralisés et dépourvus de gradient, nous avons injecté localement accord ARNm pour créer de manière exogène un gradient de Chordin dans l'embryon. Cela a entraîné la formation de trois régions distinctes, les régions dorsale (D), latérale (L) et ventrale (V), comme dans l'embryon témoin. Lorsque le taux de production de protéine Chordin a été amélioré en injectant quatre fois plus accord ARNm, les embryons ont démontré un changement modéré dans la formation de l'axe D-V. Par conséquent, la forme du gradient de Chordin semble être principalement régulée par la dégradation.

À partir de ces résultats, nous nous sommes concentrés sur l'association entre Chordin et Sizzled, qui contrôle la stabilité de la protéine Chordin (Fig. 2B). Pour examiner le taux de diffusion, nous avons effectué une récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) ou un test de spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) et avons constaté que Chordin et Sizzled, ainsi que la forme sécrétoire de mEGFP, se diffusaient rapidement. En revanche, le taux de dégradation de chaque protéine était nettement différent. La protéine Sizzled était stable dans l'embryon, tandis que la protéine Chordin (26,7 fmol par embryon) se dégradait très rapidement avec une demi-vie d'environ 30 min. Cette instabilité de la protéine Chordin a été complètement bloquée par la quantité excessive de Sizzled, indiquant que la majorité de la dégradation de Chordin dépendait des métalloprotéases BMP1 et Xlr. De plus, le gradient de Chordin a changé dynamiquement sa forme de raide à peu profonde en fonction de la concentration Sizzled, même lorsque le taux de production de Chordin a été fixé par le test de reconstitution de l'axe D-V. Ces résultats ont indiqué que la forme du gradient de Chordin était principalement régulée par une dégradation dont la vitesse dépendait de la quantité de protéine Sizzled.

Sur la base de l'observation expérimentale, nous avons proposé le modèle d'échelle dépendant de Chordin/Sizzled mentionné ci-dessous. Avant la gastrulation, bmp et son gène cible grésillement ont été exprimés dans l'embryon entier (Fig. 5A). Cependant, lorsque l'organisateur (cellules sources) s'est formé localement dans l'embryon au stade précoce de la gastrula, la Chordine synthétisée a diffusé dans l'espace extracellulaire et a progressivement supprimé le grésillement zone d'expression en inhibant l'activité des BMP (Fig. 5A). Au cours de ce processus, la protéine Sizzled s'est progressivement accumulée dans l'embryon en raison de son faible taux de dégradation (Fig. 5B). Considérant le demi-embryon dorsal, le grésillement la zone d'expression a été rapidement supprimée par la diffusion de Chordin (Fig. 5A en bas). L'accumulation de Sizzled est devenue inférieure à celle de l'embryon témoin (Fig. 5B en bas). Dans ce demi-embryon dorsal à faible grésillement, la dégradation de Chordin a été améliorée et a formé un gradient abrupt adapté au petit embryon (Fig. 5C).

Dans ce modèle d'échelle, nous avons proposé que la taille de l'embryon régule la stabilité de la protéine Chordin via l'accumulation de la protéine Sizzled. Pour répondre à cette possibilité, la production de Chordin a été fixée à l'aide du test de reconstitution de l'axe D-V, et la taille de l'embryon a été artificiellement modifiée par bissection. Malgré une production fixe, la réduction de la protéine Chordin a été détectée dans les embryons coupés en deux. Conformément au modèle de mise à l'échelle dépendant de Chordin/Sizzled, ce changement dans la stabilité de la protéine Chordin a été éliminé lorsque Sizzled a été épuisé par le morpholino. De plus, nous avons construit un modèle mathématique basé sur les résultats expérimentaux : (i) taux de diffusion identique de Chordin et Sizzled (ii) taux de dégradation de Sizzled inférieur à celui de Chordin (iii) Régulation dépendante de Sizzled de la dégradation de Chordin et (iv) suppression de l'espace d'expression Sizzled par diffusion Chordin. Dans ce modèle mathématique, nous avons confirmé que trois régions distinctes, dorsale, latérale et ventrale, pouvaient s'adapter à la taille de l'embryon grâce à l'accumulation de Sizzled.


Discussion

Les Xénope L'organisateur Spemann a fourni un terrain de pêche fertile pour la découverte de protéines sécrétées qui régulent le développement. On s'attendait à ce que de nouveaux facteurs de croissance puissent être isolés, mais au lieu de cela, il a été découvert que l'organisateur de Spemann médie l'induction embryonnaire par la sécrétion d'un mélange d'antagonistes des facteurs de croissance (4, 5). Dans la présente étude, nous avons utilisé le séquençage profond pour étudier le choix entre l'épiderme et le tissu neural.

Une ressource transcriptomique riche.

Le transcriptome de cellules captives animales qui avaient été dissociées pendant plusieurs heures (provoquant une neutralisation), ainsi que celui d'explants ectodermiques micro-injectés avec un certain nombre d'ARNm qui induisent le tissu neural, tels que Chordin, Cerbère, et FGF8, a été déterminé par ARN-seq. Nous avons également examiné l'effet de l'inducteur de l'endomésoderme Xnr2, l'inducteur épidermique BMP4, et le modificateur de compétence d'induction du mésoderme xWnt8 (32). Ces données, qui comprennent un minimum de 45 × 10 9 nucléotides séquencés d'ARN, sont fournies dans les ensembles de données S1-S3, qui peuvent être facilement exploités par la communauté des chercheurs. Ceci constitue une ressource ouverte importante pour les biologistes du développement intéressés par la différenciation des couches germinales.

Isolement d'un inhibiteur Wnt.

En recherchant des gènes d'induction neuronale activés par dissociation cellulaire (qui provoque l'activation de MAPK) (19) et en recherchant Cerbère, Chordin, et xWnt8 ARNm, nous avons identifié une protéine que nous avons désignée comme Bighead en raison de son phénotype de surexpression. De manière inattendue, cette molécule n'a pas été exprimée dans l'ectoderme du stade gastrula tardif 12 lorsque les banques d'ARN-seq ont été préparées. A ce stade, l'ARNm de Bighead est exprimé dans l'endoderme, en particulier dans l'organisateur dorsal Spemann. L'expression de l'organisateur se trouve dans l'endoderme profond mais ne chevauche pas l'endoderme antérieur de pointe (qui donne naissance à l'intestin antérieur et au foie), qui exprime Cerberus et Dkk1 (24, 41). À la lumière de l'exigence de Bighead pour le développement de la tête, il semble que les antagonistes Wnt doivent également émaner des régions endodermiques les plus postérieures de l'organisateur pour renforcer pleinement ses propriétés d'induction de la tête.

Il est peu probable que la dissociation des coiffes animales induise l'endoderme, car le marqueur pan-endodermique Sox17 n'est pas exprimé (Dataset S1). Il semble probable que la dissociation des coiffes animales entraîne une activation prématurée des domaines neuraux de l'expression de la grosse tête, qui, dans l'embryon non perturbé, sont observés à des stades neurules ultérieurs. L'identification de Bighead a été heureuse, car elle s'est avérée une protéine intéressante.

Depuis X. laevis est allotétraploïde, Bighead est codé par deux gènes des formes S et L (20). Les deux codent pour des protéines d'environ 270 aa avec un peptide signal et sont sécrétées. Dans les expériences de surexpression, Bighead a provoqué des phénotypes très similaires à l'antagoniste archétypal Wnt Dkk1 (41). Grosse tête L'ARNm a élargi l'expression d'un certain nombre de marqueurs de tête, bloqué l'expression de la Fr2 Gène cible Wnt, a empêché la formation d'un axe secondaire après une seule injection de xWnt8 ARNm et diminution de l'induction des premières cibles Wnt Siamois et Xnr3. En outre, l'ajout de la protéine Bighead a inhibé la signalisation Wnt canonique dans les dosages du gène rapporteur de la luciférase. Ainsi, Bighead se comporte comme un antagoniste canonique de la signalisation Wnt, dont beaucoup sont connus pour favoriser le développement de la tête (48).

Des recherches approfondies d'homologues de Bighead dans d'autres organismes ont montré qu'il n'est présent que chez les poissons et les amphibiens. Par exemple, chez le poisson zèbre, Bighead correspond à LOC571755, une protéine de fonction inconnue. La protéine a évolué rapidement, mais ses six cystéines ont été conservées dans de nombreuses espèces. La prédiction SWISS-MODEL suggère que la région C-terminale de Bighead est compatible avec la structure cristalline du prodomaine de TGF-βs tel que la myostatine/GDF8 (38, 40) peut-être une partie de Bighead dérivée d'un domaine structurel dans la prorégion d'un ancien TGF-β.

Aucun homologue n'a été trouvé chez les reptiles, les oiseaux ou les mammifères. La perte de gènes est très fréquente au cours de l'évolution. Par exemple, nous avons décrit un ancien réseau auto-organisé de Chordin/BMP/Tolloid qui régule la structuration D/V chez les vertébrés et les invertébrés (49). Cependant, malgré cette conservation profonde, certains éléments du réseau ont été perdus. La protéine morphogénétique antidorsale (ADMP) est une BMP qui a été perdue dans l'ornithorynque (Ornithorhynchus) (50). Les sFRP Crescent et Sizzled sont présents chez les oiseaux et l'ornithorynque, mais pas chez les mammifères supérieurs, qui ont perdu le jaune d'œuf. De plus, les sFRP ne sont présents chez aucun invertébré (51). Il semble que l'exigence embryonnaire du niveau de régulation fourni par Bighead ait été perdue avec l'invention de l'amnios. Malgré cela, nos études sur l'épuisement des grosses têtes par les OM démontrent une exigence remarquablement forte pour ce gène dans la formation de la tête pendant le développement de la grenouille.

Pourquoi tant d'antagonistes de Wnt ?

Bighead s'ajoute à une longue liste d'antagonistes Wnt sécrétés. Ceux-ci incluent les protéines Dkk (48), les sFRP, le facteur d'inhibition de Wnt 1 (WIF-1) (52), SOST/Sclerostin (53), Notum (une hydrolase qui élimine le palmitoléoylate de Wnt dans l'espace extracellulaire) (54), et Angptl4 (6). De plus, des protéines transmembranaires telles que Shisa (une protéine impliquée dans le trafic du récepteur Frizzled vers la surface cellulaire) (55), Tiki (une protéase qui clive l'extrémité aminée de Wnts) (56) et Znrf3/RNF43 (une ubiquitine ligase qui cible les récepteurs Frizzled et Lrp6 pour la dégradation lysosomale) (57, 58) régulent à la baisse la signalisation Wnt.

Comme le montre cette étude, Bighead se lie à Lrp6, induisant son endocytose rapide dans les lysosomes. En conséquence, Lrp6 est retiré de la surface de la cellule et dégradé en endolysosomes. Ce mécanisme moléculaire est très similaire à celui des antagonistes Wnt Dkk1 et Angptl4. Dkk1 se lie à Lrp6 et Kremen1/2, et le complexe est intériorisé. Angptl4 est une protéine sécrétée surtout connue pour son rôle d'inhibiteur de la lipoprotéine lipase (LPL), l'enzyme clé dans l'élimination des triglycérides du plasma sanguin (59). Études en Xénope ont montré que l'Angptl4 se lie aux syndécanes de surface cellulaire (qui sont des protéoglycanes transmembranaires) et que cette interaction déclenche l'endocytose de Lrp6 (6). Dans le cas de Bighead, on ne sait pas si un corécepteur est requis pour l'internalisation de Lrp6. Ce qui est clair, cependant, c'est que ces trois antagonistes de Wnt conduisent à l'internalisation de Lrp6 dans une population endolysosomale qui n'est pas impliquée dans la génération de signal.

L'existence de tant de régulateurs souligne la riche complexité de la voie de signalisation Wnt. Nous pensons généralement au Wnt canonique comme un signal qui augmente simplement les niveaux de -caténine nucléaire pour réguler la transcription par le facteur de liaison à l'amplificateur lymphoïde (TCF/LEF). Cependant, Wnt a des effets supplémentaires. Par exemple, dans la stabilisation des protéines dépendante de Wnt, des centaines de protéines cellulaires se stabilisent, entraînant une augmentation de la taille de la cellule (60, 61). Ceci est causé par la séquestration de GSK3 à l'intérieur des endosomes/corps multivésiculaires tardifs (MVB) (62, 63), diminuant la phosphorylation des phosphodegrons dans les protéines cytosoliques qui conduisent normalement à leur dégradation dans les protéasomes. En plus de la GSK3, une autre enzyme cytosolique importante, la protéine arginine méthyltransférase 1 (PRMT1), est séquestrée à l'intérieur des MVB lorsque les corécepteurs Wnt sont endocytosés avec leur ligand Wnt (64). La récente prise de conscience que Wnt3a stimule grandement l'endocytose non médiée par les récepteurs de BSA-DQ à partir du milieu extracellulaire (64) suggère que Wnt est un régulateur majeur du trafic membranaire. Nous proposons que Lrp5/6 est un régulateur majeur non seulement du trafic de Wnts mais aussi de l'absorption globale de liquide et de nutriments cellulaires. L'endocytose est une propriété cellulaire universelle qui pourrait être régulée par Dkk1, Angptl4 et Bighead. Il reste beaucoup à apprendre sur la physiologie de la remarquable voie de signalisation Wnt (65, 66).


Remerciements

Nous remercions F. Cong d'avoir fourni les constructions ZNRF3 D. Koinuma d'avoir fourni les constructions ALK C. Janda d'avoir fourni la construction de substitution WNT R. Thomas pour les cellules H1581. Nous remercions G. Roth et Aska Pharmaceuticals Tokyo pour avoir généreusement fourni de l'hCG. Nous remercions NXR (RRID : SCR_013731), Xenbase (RRID : SCR_004337) et EXRC pour Xénope Ressources. Nous remercions Fabio da Silva pour la lecture critique du manuscrit. Le soutien technique d'experts par l'installation centrale du DKFZ pour la microscopie optique et le laboratoire animalier central du DKFZ est grandement apprécié. Ce travail a été financé par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche) – SFB1324 – numéro de projet 331351713.


ENDOBLAST DE FAUCILLE (HYPOBLAST SECONDAIRE)

L'endoblaste de faucille forme une couche unicellulaire qui s'étend loin et prolifère à partir du bord médial de la faucille de Rauber ou de l'endoblaste jonctionnel dans une direction centripète et crânienne au début de l'incubation (Callebaut et Van Nueten, 1994 Callebaut et al., 1999 Fig. 13). Principalement, il contient γ ooplasme.

L'endoblaste de la faucille appartient à la même lignée cellulaire que la faucille de Rauber et a un comportement similaire mais est dominé par la faucille de Rauber

Si un fragment d'endoblaste de faucille de caille est placé sur la région anti-faucille d'un blastoderme de poulet non incubé à partir duquel la faucille de Rauber a été sélectivement grattée, alors un embryon entier avec un PS, un endoderme définitif, un nœud de Hensen et une plaque neurale se développe dans un direction diamétralement opposée, à partir de la région anti-faucille (Callebaut et al., 2003a, b). La même chose se produit lorsqu'un fragment d'endoblaste de drépanocytose est placé sur la partie centrale isolée d'un blastoderme de poulet non incubé (Callebaut et al., 2002c). L'ooplasme sous-germinal central placé artificiellement au contact du matériel de faucille de Rauber ou de l'endoblaste de faucille en culture, peut fonctionner comme un substrat pour la prolifération cellulaire avec à nouveau des capacités d'induction et/ou de régénération dans la couche supérieure voisine (Callebaut et al., 2000c). Même l'activation de la formation d'embryons peut se produire par des blastodisques de cailles non fécondés (Callebaut et al., 2000d ).

Lorsque l'endoblaste de drépanocytose est placé sur la région anti-faucille isolée d'un blastoderme de poulet non incubé en culture, une plaque neurale précoce se développe. En revanche, lorsqu'un morceau d'endoblaste de faucille de caille est placé sur la région anti-faucille d'un poulet entier non incubé en culture, il n'a aucun effet inducteur. Cette découverte indique que la faucille de Rauber domine ou inhibe l'endoblaste de faucille placé ectopique, qui est dérivé de la même lignée cellulaire. Cet endoblaste de faucille, s'il est soustrait à l'influence de la faucille de Rauber, a des pouvoirs d'induction de gastrulation et/ou de neurulation sur la couche supérieure du blastoderme non incubé, mais il n'a aucune influence sur la formation d'îlots sanguins. Le gène homeobox cHex est exprimé dans la drépanocytose et l'endoblaste falciforme de Rauber (Yatskievych et al., 1997). Des transcrits cHex ont également été détectés dans des îlots sanguins commençant au stade 4 (Hamburger et Hamilton, 1951) et dans des cellules endothéliales vasculaires extra-embryonnaires et intra-embryonnaires. Parce que nous avons montré que la faucille de Rauber et l'endoblaste jonctionnel ont un effet inducteur sur la formation d'îlots sanguins, nous pouvons postuler une relation inconnue avec le gène cHex.

Influence de l'endoblaste falciforme sur la neurulation et la gastrulation

La base moléculaire de l'induction neurale a été largement étudiée dans Xénope laevis, et il s'est avéré étroitement lié à l'établissement de l'axe dorsoventral (De Robertis et Sasai, 1996 Hemmati-Brivanlou et Thomsen, 1995 Hemmati-Brivanlou et Melton, 1997 ). Chez les grenouilles, l'ectoderme potentiel est induit par les BMP. En revanche, un développement neuronal nécessite l'inactivation des BMP et est obtenu par la formation directe d'un complexe entre les BMP et des facteurs inducteurs neuronaux tels que la cordine, la noggine ou la follistatine (Piccolo et al., 1996 Zimmermann et al., 1996). Dans le blastoderme de poulet aux stades précoces, l'épiderme prospectif est caractérisé par l'expression du gène homéobox DLX5, qui reste un marqueur épidermique lors de la gastrulation et de la neurulation et permet de le distinguer de la plaque neurale plus centrale (Pera et al., 1999 ). Que les signaux verticaux de la couche inférieure soient nécessaires à l'établissement de la plaque neurale a été démontré par ces derniers auteurs par des extirpations répétées de l'endoblaste sous-jacent. En l'absence des couches germinales inférieures, l'épiderme s'est étendu dans la région qui forme normalement la plaque neurale.

Knoetgen et al. ( 1999a , b ) ont analysé le GANF (Gallus pli neural antérieur) -potentiel d'induction de divers tissus à différents stades du développement du poussin par transplantation à la marge externe de la zone pellucide, où les cellules épiblastiques sont destinées à devenir épiderme (Spratt, 1952 Rosenquist, 1966 Schoenwolf et Sheard, 1990 Bortier et Vakaet, 1992 Garcia-Martinez et al., 1993). Des greffes de ganglion de Hensen (HH3+/HH4) sur des blastodermes entiers ont conduit à l'induction d'une structure neuroectodermique avec une forte expression de GANF dans sa marge crânienne. Le greffage du processus de la tête jeune (HH4) à la région pellucide latérale du crâne a provoqué un épaississement de l'épiblaste et une induction de l'expression de GANF dans des cellules juxtaposées.

Une molécule sécrétée nommée « Cerberus », qui est exprimée dans l'endoderme antérieur, a la propriété d'induire des structures de tête ectopique lorsqu'elle est microinjectée dans les régions ventrales de Xénope embryons (Bouwmeester et al., 1996 Bouwmeester, 1997 ). La structuration de l'ébauche du cerveau antérieur du poussin par la plaque précordale a été décrite par Pera et Kessel (1997). Selon ces auteurs également, la plaque neurale aviaire est évidente avant la première pénétration des cellules mésendodermiques ou mésodermiques axiales, excluant la plaque préchordale et la notochorde comme sources primaires d'induction neurale. Au début de la gastrulation, les cellules s'invaginent à travers l'extrémité de la ligne de croissance et s'étendent radialement pour former l'endoderme définitif (intestinal) (Vakaet, 1970). Au cours de cette expansion radiale, ce dernier endoderme définitif pousse l'endoblaste falciforme également radialement (Callebaut et Van Nueten, 1994 Fig. 13). L'endoblaste de la drépanocytose hémicirculaire crânienne glisse sous les cellules de la couche supérieure qui se transforment en un ébauche de plaque neurale hémicirculaire (Bortier et Vakaet, 1992 ). Ces dernières cellules sont localisées à proximité de l'ancienne région anti-faucille, exactement dans la concavité du croissant endophile déplacé crâniennement. L'endoblaste falciforme plus caudale restant est localisé sous la couche supérieure, ce qui donnera naissance à la région centralis de la zone formant PS. Cette évolution différente de la région crânienne (anti-faucille) par rapport à la région centrale (area centralis) peut probablement s'expliquer par la réactivité différente dans ces deux régions de la couche supérieure (Callebaut et al., 2002c).

L'absence d'induction neurale après les expériences de greffe de la couche profonde sur des blastodermes entiers par Gallera et Nicolet (1969) et par Knoetgen et al. ( 1999a , b ) peut probablement s'expliquer par la pleine présence du matériel de faucille de Rauber. Cette découverte indique également que les conclusions antérieures des expériences de greffe sur des blastodermes entiers non incubés (contenant la faucille de Rauber, l'organisateur principal principal, ou sur des blastodermes PS, contenant le nœud de Hensen, un organisateur principal secondaire) doivent être reconsidérées. Par conséquent, nous ne pouvons être d'accord avec aucune des conclusions de Knoetgen et al. (1999b) que l'endoblaste à lui seul provoque tout changement détectable dans l'ectoblaste hôte adjacent après la transplantation ou que l'organisateur aviaire est confiné au nœud de Hensen uniquement. Foley et al. ( 2000 ) ont étudié le rôle éventuel de la couche profonde précoce (endophylle et/ou endoblaste falciforme) sur l'expression des marqueurs moléculaires Sox3 (Uwanogho et al., 1995 ) et Otx2 (Bally-Cuif et al., 1995 ) dans le couche supérieure. À partir du stade 6-7 de Hamburger et Hamilton, Sox3 est spécifiquement exprimé dans l'ensemble de la plaque neurale du poulet et Otx2 est exprimé dans le cerveau antérieur et le mésencéphale. Foley et al. (2000) ont découvert que la couche profonde précoce régule une phase transitoire précoce de l'expression d'Otx2 et de Sox3 dans la couche supérieure adjacente. Par conséquent, ils ont conclu que la couche profonde précoce n'induit pas définitivement le tissu neural ou le cerveau antérieur. Cependant, leurs expériences de transplantation n'ont pas été réalisées sur la faucille de Rauber - ou des fragments de blastoderme sans endoblaste jonctionnel mais sur des blastodermes entiers. Récemment, Knezevic et Mackem (2001) ont trouvé des preuves que deux gènes, associés plus tard à l'organisateur de la gastrula (Gnot-1 et Gnot-2), sont induits par les signaux de la couche profonde dans les embryons avant la séquence. Selon ces derniers auteurs, ces gènes pourraient peut-être réguler la formation de l'axe dans l'embryon précoce, ce qui pourrait également expliquer l'induction d'une strie dans la partie isolée de l'area centralis par l'endoblaste falciforme (Callebaut et al., 2003b).


Partie 3 : Développement précoce de la grenouille : Comment faire un têtard ou un jumeau

00:00:0708 Je suis Richard Harland.
00:00:0808 Je suis à l'UC Berkeley.
00:00:0926 Et aujourd'hui, je vais vous parler des activités de signalisation qui donnent lieu à
00:00:1322 the neural plate, the forerunner of the spinal cord and brain in vertebrate embryos.
00:00:1914 In previous talks, I've talked about the introduction to the Xenopus embryo, why it has some advantages
00:00:2509 for experiments.
00:00:2609 And I've talked about the cell shape changes that have happened in the. in the embryo
00:00:3015 that lead to the three-layered ectoderm/mesoderm/endoderm structure that is the case, the.
00:00:3625 the state at which neural tissue formation happens.
00:00:4120 Let's initially start by just reviewing the classic experiment, the organizer experiment
00:00:4520 done by Hilde Mangold and Hans Spemann.
00:00:4819 And this is the one that really set the stage for what I'm going to talk about.
00:00:5304 In this experiment, they used marked embryos.
00:00:5607 They used newts of different colors: a dark-colored, pigmented newt, and a light-colored newt.
00:01:0104 And what they were. asking the question, what happens if we move pieces of the embryo around?
00:01:0814 Do they differentiate according to how they normally were set up in the embryo?
00:01:1209 It's self-differentiating according to their original fate?
00:01:1502 Or do they adopt the fate of their surroundings?
00:01:1728 Are they told to become the fate of their surroundings?
00:01:2017 Well, there was one particular experiment that was quite spectacular,
00:01:2426 where not only did the cells self-differentiate, but they recruited cells from the rest of the embryo
00:01:3025 to make new structures, the phenomenon of embryonic induction.
00:01:3604 So here, what they did was to take this embryo, here. the dark embryo is the host, and there's
00:01:4212 this paler donor.
00:01:4328 And what they did was to cut out this dorsal lip region from the pale embryo, flip it around,
00:01:5013 and graft it in to the ventral side of the host.
00:01:5318 So, not only does this have its normal organizer side but it has a new piece of dorsal mesoderm
00:01:5904 stuck in the ventral side.
00:02:0028 And what they found was that this was enough to make the embryo twin.
00:02:0602 And that's shown down here in a representation, this particular one done by Andrea Wills,
00:02:1014 who was a student with me.
00:02:1204 So, you can see that there's a normal primary axis with a head with two eyes.
00:02:1619 Then down here, there's a secondary axis, which is fused down at the tail, but it's
00:02:2116 a complete, proper, organized secondary axis.
00:02:2524 Now, the important thing was, since they were using marked issues, they could tell
00:02:3006 what is the contribution of the graft and the host.
00:02:3228 And so here's a. a representation of the section that was made by Hilde Mangold.
00:02:3702 Here's the primary axis, with the tissues that should be familiar to us by now:
00:02:4121 the nervous system, the notochord, and the muscle.
00:02:4510 And here's the secondary axis.
00:02:4626 And there's the pale graft.
00:02:4801 The pale graft invariably contributes just to the midline tissues.
00:02:5215 Here, it's contributing to the notochord and a little bit of the somites.
00:02:5707 Sometimes it would contribute to a bit of the spinal cord.
00:02:5926 But the consistent observation is that it contributes to the midline tissues,
00:03:0420 whereas the bulk of these tissues are recruited from the host: most of the nervous system,
00:03:0810 the muscle, and so on.
00:03:1202 So this graft really must be instructing the surroundings to make this second axis and
00:03:1620 organize it properly.
00:03:1805 Here's a modern equivalent of the experiment, also done by Andrea Wills, where she's
00:03:2216 labeled the donor embryo with a red stain.
00:03:2515 And you can see in this twin, where the two axes have arranged themselves conveniently
00:03:3013 next to each other.
00:03:3117 Here is the red-labelled graft.
00:03:3308 And you can see above it the induced neural tissue.
00:03:3613 So, it's not a phenomenon just of the 1920s, but can be done in the current times.
00:03:4221 Now, I'm really going to emphasize that this induction mechanism was not obvious.
00:03:4714 And in fact, Warren Lewis, who is not as famous as Spemann and Mangold, tried a similar experiment
00:03:5313 earlier than they did.
00:03:5504 But what he concluded -- largely because the embryos were not marked --
00:03:5915 was that the result he was getting was exclusively the result of self-differentiation of the grafted tissue.
00:04:0521 And he couldn't see any induction, because the tissues were not marked.
00:04:0922 And so the bottom line is that he'd. because of this assumption of self-differentiation,
00:04:1506 he missed on the phenomenon of induction.
00:04:1800 And so we remember Spemann and Mangold, and less so Lewis.
00:04:2201 Okay, let's go back to the whole embryo and remind ourselves what we're looking at.
00:04:2713 So, we know from molecular mapping that the organizer is gonna be the top of this
00:04:3323 when it loops around again.
00:04:3428 We're going through gastrulation and neurulation.
00:04:3804 And when we loop around again. here's the organizer up here.
00:04:4013 It's going inside the embryo and is opposed to this neural plate, and is able to
00:04:4615 instruct it to make the neural tissue.
00:04:4907 So again, if we look at this MRI movie, we can see that dorsal mesoderm moving up
00:04:5604 against this overlying neural plate.
00:04:5811 And during this process, where it's opposed to the neural plate, it's in the right place
00:05:0207 to be inducing the neural tissue.
00:05:0407 So, that's the normal organizer that's going up there and is thought to be signaling
00:05:1005 to induce the neural plate.
00:05:1113 Okay, so we're going to discuss this more.
00:05:1501 But we first need to understand how we get to that position.
00:05:1724 And I'm not going to go through this in detail, but I'm going to give a brief summary of the
00:05:2126 initial events that happen to set up the organizer.
00:05:2517 And it comes down largely to the activity of two different signaling pathways: the Nodal/Smad2 pathway
00:05:3221 and the Wnt/beta-catenin pathway.
00:05:3512 We don't need to know about these pathways in detail, but what we do know is the way
00:05:4018 they're turned on in the embryo.
00:05:4224 So initially, when the egg is laid, it's got this axis from animal to vegetal,
00:05:4822 from the pigmented to the yolky side.
00:05:5122 And subsequently it was found that there are a number of pre-localized components in that
00:05:5515 polarized egg.
00:05:5717 And I'm going to talk about this red mRNA, messenger RNA, that's pre-localized,
00:06:0300 called vegt, first described by Mary Lou King's group.
00:06:0612 And there's also, slightly less well-characterized, activators of the Wnt/beta-catenin pathway
00:06:1119 down here.
00:06:1303 So initially, this is cylindrically symmetrical about the animal-vegetal axis.
00:06:1618 And an important process here, as is widespread in embryology, is the symmetry breaking.
00:06:2118 So, you have to go from a cylinder to a bilaterally symmetrical egg.
00:06:2523 And this is achieved during normal development because the sperm is going to enter on one side.
00:06:3213 That makes this giant aster.
00:06:3504 So, these astral microtubules extend throughout the egg cytoplasm during the first cell cycle.
00:06:4115 And not only do they serve to pull the maternal pronucleus towards it, but they also
00:06:4603 serve to bias the way that microtubules polymerize. polymerize in the outside cortex,
00:06:5101 the outer ten-micron layer.
00:06:5313 So as a result of this bias, there's an oriented array of microtubules that go around the embryo,
00:06:5928 here.
00:07:0028 And they act as tracks for carriage via kinesins of some of these purple components.
00:07:0622 There's a selectivity.
00:07:0822 The purple components that activate the Wnt/beta-catenin pathway get smeared out along the
00:07:1413 entire dorsal side of the embryo, whereas the red do not do this.
00:07:1826 They're sort of passively released from the vegetal cortex and spread in a graded way
00:07:2417 through the egg.
00:07:2517 So, we now have a broken symmetry, where we have the red going from vegetal to animal
00:07:2926 and the Wnt/beta-catenin concentrated from dorsal to ventral.
00:07:3504 Now, these two molecules get together and turn on the. the Nodal genes.
00:07:4000 The Nodal genes are signaling proteins in the TGF-beta superfamily.
00:07:4307 And they're turned on in the margin.
00:07:4515 And in normal development, there's a cooperativity between the purple Wnt signal and, now,
00:07:5026 this yellow protein produced from the vegt RNA.
00:07:5409 So, they get together and turn on these Nodal genes.
00:07:5802 And they turn them on at a higher level on the dorsal side and the ventral side.
00:08:0216 But they do turn them on everywhere.
00:08:0500 And these Nodal genes induce mesoderm.
00:08:0710 So, the cells that are initially naive get told, in this marginal zone, to become
00:08:1310 the prospective mesoderm.
00:08:1504 But where this interaction is the strongest -- the strongest interaction of beta-catenin
00:08:1922 and the Nodal gene expression -- that converges on the promoters of organizer gene and
00:08:2512 turns them on, especially in this dorsal region here.
00:08:2822 So, the marginal zone. the mesoderm goes all the way across in the equator,
00:08:3224 but the organizer is special in that it's only turned on at the convergence, the strongest convergence
00:08:3702 of these signals.
00:08:3804 Okay, so we've discussed that.
00:08:4024 And let's just contrast that with what happens if this cortical rotation doesn't occur.
00:08:4701 And so you can see here what. there are various tricks to. to cause this to happen.
00:08:5024 One is to irradiate the vegetal side of the embryo with ultraviolet light.
00:08:5413 And that prevents the polymerization of microtubules.
00:08:5726 The alternative is to eliminate beta-catenin production by using a reagent that
00:09:0209 blocks beta-catenin production.
00:09:0324 We'll come back to that.
00:09:0611 Either way, what happens is that we get the release of the vegt and we get the
00:09:1014 graded vegt protein, which turns on Nodal, but, in the case of the lack of cortical rotation,
00:09:1626 then this purple signal stays down here.
00:09:2001 And so as a result, there is no synergy on this side.
00:09:2225 There's no overlap between the signals.
00:09:2522 And so this whole marginal zone behaves like the ventral marginal zone.
00:09:3008 You get a. a ventralized type of embryo with no organizer.
00:09:3506 Okay, so that symmetry-breaking event back here was important.
00:09:3902 But we're gonna use this trick in the next experiment, that proves that we need organizer signal
00:09:4327 to get the neural plate to be formed.
00:09:4905 Before we go into that, we're just gonna discuss a little bit more about the graded Nodal signaling.
00:09:5327 Because there. a quite widespread view in the field is that this graded Nodal signaling
00:09:5823 is important in setting out the pattern of the marginal zone.
00:10:0217 It seems quite obvious that if there's going to be a graded signal with more on this side
00:10:0620 than that side, it should be used for something.
00:10:0922 So, we're going to get a graded response, and the phospho-Smad2 is the intracellular effector,
00:10:1515 which is known to be distributed like this.
00:10:1804 There really is graded expression of Smad2 going from dorsal to ventral.
00:10:2226 And then this proceeds as a wave across the embryo.
00:10:2505 So, it seems perfectly reasonable to think that in normal development what ought to be
00:10:3002 happening is that that signal will tell the embryo to make different kinds of mesoderm.
00:10:3618 And indeed, that whole idea is supported by this experiment, where we can take,
00:10:4127 from the blastula stage, naive ectoderm from this so-called animal cap and put it in culture.
00:10:4822 By itself, it will self-differentiate into epidermis.
00:10:5125 But if we add a signal, and we can use either Nodal or more conveniently, Activin,
00:10:5619 another member of the TGF-beta superfamily.
00:10:5908 If one adds increasing doses of that Activin signal, the mesoderm-inducing signal,
00:11:0416 one can get caps that develop in a more ventral way, making mesenchyme, whereas as one
00:11:0923 doses in the signal, more and more dorsal tissues, like muscle and ultimately a lot of notochord.
00:11:1519 So, those kinds of experiments, the description of the graded expression, as well as
00:11:2107 this result, where one's reconstructing what may be going on in the embryo, suggest that
00:11:2502 that graded signal may cause pattern.
00:11:2616 But I'm going to argue that's not true.
00:11:2913 So, just to sum up, this normal pattern in the marginal zone -- from notochord through
00:11:3502 muscle, kidney, and blood -- could in principle be set up by that graded Nodal signaling.
00:11:4204 But this was explicitly tested in a series of experiments by Ron Stewart and John Gerhard,
00:11:4724 and other very similar experiments by Jonathan Slack.
00:11:5102 And so what I want to review briefly is this experiment that shows that there's not enough
00:11:5617 information imparted by that early signal to give substantial pattern in the marginal zone.
00:12:0228 Now, what they did. they wanted to assess the effectiveness of organizer grafts.
00:12:0815 And they did this at the late blastula stage.
00:12:1021 So, this is a really early stage, before gastrulation goes on and before there's much to. là.
00:12:1522 there certainly is pattern is the marginal zone later on.
00:12:1822 So, they took normal embryos and cut them in half, vertically, so they got two hemispheres.
00:12:2418 And they used that UV irradiation trick.
00:12:2607 So, they had a graft. they were able to graft these -- labeled grafts, of course --
00:12:3220 onto UV-irradiated hosts.
00:12:3320 So, they made this recombinant.
00:12:3611 In this case, the organizer is schematically illustrated in red.
00:12:4005 So, you've got a half organizer here.
00:12:4214 One of their first questions was, if you only put in a right organizer, do you only get
00:12:4612 a right embryo?
00:12:4714 And there are. the answer was no.
00:12:4822 You get a bilaterally symmetrical embryo.
00:12:5101 But also, in many cases this graft will give you a normal tadpole.
00:12:5517 So, you rescue development also, as shown by the lineage tracing experiment,
00:13:0009 from this ventralized half.
00:13:0215 But this is really the key one in my exper. in my view.
00:13:0615 So here, they've cut just 30 degrees off the dorsal midline axis, so they've cut the organizer
00:13:1228 into the right piece, and this piece has no organizer.
00:13:1607 Now, by the model I was discussing earlier, there should be some graded Activin signaling
00:13:2212 or graded. graded Nodal signaling in here that's inducing things like muscle.
00:13:2707 Well, we're gonna ask that question.
00:13:2819 We're gonna take this side and, again, fuse it to a naive ventralized piece,
00:13:3418 put them together, and ask what happens.
00:13:3806 And the result in most cases is there's absolutely no dorsal pattern in the embryo.
00:13:4411 And just to nail this home, I want to stress that.
00:13:4713 So, they're taking this ventralized piece and putting on this piece from a normal embryo
00:13:5305 that lacks just the organizer, but still has that dorsolateral prospective mesoderm
00:13:5714 that would make muscle if it were left alone.
00:14:0002 But in the context of this recombinant, you just get this completely ventralized embryo,
00:14:0518 as opposed to something that would make a little muscle and so on.
00:14:0819 So, this experiment shows I think quite well that the pattern that's induced by
00:14:1423 that graded Activin/Nodal signaling is not enough to have any permanent effect on this tissue.
00:14:2021 And that you actually need the organizer signaling.
00:14:2226 So, that sort of loss of organizer function proves that you need organizer signaling
00:14:2901 in normal development.
00:14:3219 Another is a sort of descriptive view, where we've looked at gene expression at different phases.
00:14:3715 And here's a case where we see two. expression of two different genes.
00:14:4016 This is noggin expressed in the organizer -- we'll come back to that -- and this
00:14:4422 prospective muscle gene, myod, that's expressed in a complementary way, in the non-organizer tissue.
00:14:5020 When it's first turned on, it's turned on fairly uniformly around the rest of the marginal zone.
00:14:5508 Later on, this expression turns off, and this gets enhanced by signaling from the organizer.
00:15:0022 But when it first turns on, it looks like the marginal zone is organized in a binary way.
00:15:0513 Now, this very rapidly changes.
00:15:0625 So, we see expression of genes such as this one, lhx1, that's high in the dorsal marginal zone
00:15:1127 and then graded off to the side.
00:15:1408 So, that's a later stage.
00:15:1524 We also see that with this split, where the blue and the brown genes are expressed
00:15:2010 in complementary domains at the end of the blastula stage, but very quickly become elaborated
00:15:2600 so that the brown gene, Wnt8, is restricted away from the organizer and just in the marginal zone.
00:15:3027 So, things are very dynamic.
00:15:3228 And one really has to look at this early stage to see this binary difference.
00:15:3624 By this stage, this tissue has already been instructed by the organizer to make muscle.
00:15:4125 But anyway, this descriptive experiment does support the idea that initially the marginal zone
00:15:4715 is split in a binary way and is not graded in this induction.
00:15:5017 So again, arguing that you need a signal from the organizer and it's not enough to have
00:15:5500 that graded Nodal signaling.
00:15:5824 This just reinforces that.
00:16:0106 And as that slides up, I'll say that we need. need now to figure out, what are these other signals?
00:16:0801 And at the time, there were a lot of experiments that were done using both cell biology,
00:16:1223 using secreted signals from cells and assaying them in embryos, and many of these signals do have
00:16:1716 important embryonic functions: fibroblast growth factors Nodals, Activins, and so on.
00:16:2318 But the dorsalizing molecules that are made from the organizer were not understood.
00:16:2816 So, how do we find those?
00:16:3027 And here I give much credit to Bill Smith, who's now a professor at UC Santa Barbara,
00:16:3418 who in the early '90s joined me and decided to use an expression cloning approach
00:16:4013 to try to find these molecules.
00:16:4122 And again, he used this trick of ventralizing embryos.
00:16:4513 But at the four-cell stage, he then took synthetic messenger RNAs made from a library.
00:16:5112 This library was a library of gastrula-specific RNAs in a plasmid that could be transcribed
00:16:5618 with this synthetic phage polymerase, SP6 polymerase, so that we could get a library of,
00:17:0204 in the first instance, 100,000 colonies, extract the DNA, and then transcribe
00:17:0820 that whole library of plasmids to make a complex mixture of synthetic RNA that we hoped mimicked
00:17:1315 what was in the embryo.
00:17:1524 Remarkably, that first injection of the synthetic RNA, when it was injected back at the four-cell stage,
00:17:2107 instead of these embryos looking like this -- complete belly pieces as Spemann would
00:17:2525 have called them -- they looked more like this.
00:17:2723 They had some tail structures, some muscle, and spinal cord.
00:17:3107 So, that RNA conferred a morphological rescue.
00:17:3421 At that point, we knew there was an active ingredient in the library, and it was
00:17:3909 just a question of sub-selection, where we would split the library into smaller and smaller pools,
00:17:4400 assaying those pools as we go along, and ask, is there a pool in there that
00:17:4908 confers this ability to dorsalize embryos?
00:17:5219 And sure enough, we. he did this a couple of times.
00:17:5502 The first time, he isolated a Wnt signal, which I won't discuss but is thought to mimic
00:17:5907 that early Wnt signal in dorsalizing the embryos.
00:18:0128 But for the purposes of this presentation, the second one he isolated was really exciting
00:18:0623 because it was completely new.
00:18:0824 And as a single RNA, as you can see in this picture, with increasing dose of the gene
00:18:1324 we called noggin RNA, you get this progressive rescue of structures to the normal state.
00:18:1917 And then when one overdoses the embryo, ultimately you end up with these little noggins,
00:18:2420 these little heads alone.
00:18:2520 So, that. that single RNA is able to transform, from the four-cell stage, a ventralized embryo.
00:18:3023 And if it's put in at enough dose, you get just a big head.
00:18:3604 This has been a very useful assay to isolate a number of other embryological activities,
00:18:4006 but that's the one I want to concentrate on, noggin.
00:18:4310 And so this is an in situ hybridization where we're looking at the messenger RNA
00:18:4810 that's expressed from the noggin gene in early development.
00:18:5100 And so let's look at this stage.
00:18:5319 This is a late blastula.
00:18:5504 Noggin has already turned on.
00:18:5613 And as you can see, it's turned on in just one side of the embryo.
00:18:5909 And we know this is the dorsal side.
00:19:0109 So, this gene is expressed. it not only has the right activity in these messenger
00:19:0614 RNA injections, but it's also expressed in the right place -- here's a vegetal pole view,
00:19:1025 remarkably it's a 60-degree sector, just the same as the sector that Ron Stewart identified
00:19:1622 in his activity assay -- and then in the gastrula stage it continues to be expressed
00:19:2408 in the dorsal marginal zone, in this involuting dorsal mesoderm that is lying just underneath
00:19:2915 the neural plate, and in the right place to induce the neural plate.
00:19:3218 Now, here's a neural. neurula stage where it continues to be expressed in the head,
00:19:3626 mesoderm, and notochord, again, in the right place to continue inducing the neural plate.
00:19:4304 So, the activity is promising, the extra expression is promising, but could we show that it
00:19:4817 had the right properties?
00:19:4924 So, we initially used a protein that we made in CHO cells that Teresa Lamb had transformed
00:19:5523 with noggin plasmids.
00:19:5624 But later in the collaboration with Regeneron Pharmaceuticals, they made a human noggin,
00:20:0210 particularly, Aris Economides, and gave us that recombinant human noggin for our experiments.
00:20:0706 So we were able to ask, now, can noggin protein mimic what we know are the embryological effects
00:20:1317 of grafting this tissue?
00:20:1705 So, again, this is the normal case, where noggin is expressed in this red dorsal mesoderm,
00:20:2218 and potentially instructing this overlying ectoderm to become neural plate.
00:20:2606 But how do we assay that activity?
00:20:2809 Well, again, we turned to our animal cap assay.
00:20:3021 And actually, we can turn to that assay in the gastrula stage, where the sensitivity
00:20:3616 of these cells up here has changed, and they're no longer responsive to the Activin/Nodal signal.
00:20:4402 But we know from recombination experiments that if we graft an organizer onto here
00:20:4903 neural induction will occur.
00:20:5111 So now we can replace the graft of organizer by soaking this tissue in noggin protein.
00:20:5720 And so this is a schematic, which we can do in the late blastula or the gastrula,
00:21:0124 where we take this prospective ectoderm off into culture.
00:21:0503 Normally, just makes a hollow ball of epidermis when left alone.
00:21:0825 As I mentioned before, with. with Activin or Nodal, you get a complex induction of
00:21:1504 dorsal mesodermal cell types.
00:21:1717 And those in turn can secondarily induce neural tissue.
00:21:1926 But the induction is not direct.
00:21:2120 The important thing for our purposes is that, when we treat this just with recombinant noggin,
00:21:2707 we get a clean neural induction.
00:21:2820 There's a little epidermis that's on the outside and an epithelial layer that's not so responsive,
00:21:3405 but all of the underlying cells, here, are trans. transformed into neural cells.
00:21:3809 So, we get a cleaner. clean neural tissue, and that can't be induced by any mesoderm
00:21:4300 because there's no mesoderm in this explant.
00:21:4611 We can also do this as at a time when the mesoderm can no longer be induced.
00:21:5004 So, if we do this at the gastrula stage instead of the late blastula stage, this experiment
00:21:5511 wouldn't work.
00:21:5611 Activin would have no effect.
00:21:5714 And yet noggin can still induce neural tissue.
00:22:0002 So this, then, really identified noggin as an authentic neural inducer, that it's expressed
00:22:0421 in the right place and time, and has the right activity to be doing the job in the normal embryo.
00:22:1117 Here are some pictures of the kind of results that we get.
00:22:1417 These are the works of. these are done by Anne Knecht in the lab.
00:22:1722 And so, here we have a molecular assay for neural tissue.
00:22:2022 This is a gene that's expressed throughout the nervous system.
00:22:2413 And here are some of these explants, the explants that lack noggin, and they don't stain
00:22:2922 for this gene.
00:22:3022 But the parallel explants that were soaked in noggin protein, as you can see, are robustly
00:22:3514 induced to make this marker gene, and so we can say they're neural.
00:22:3805 And that contrasts. again, I'll draw the contrast with the Activin mesoderm inducer.
00:22:4413 Here, we're looking down on the top of the embryo with the muscle and notochord in the middle.
00:22:4819 These are mesodermal structures that we've lit up with this collagen probe.
00:22:5226 If we take explants just like these ones, but treat them with Activin at the late blastula stage,
00:22:5714 we get lots of this mesoderm induced.
00:22:5909 But down here, we see that noggin induces no mesoderm.
00:23:0220 So, we do get neural tissue in the absence of mesoderm, and hence a clean neural induction.
00:23:0804 Just as an interesting side point -- I won't be discussing this much today -- that we
00:23:1315 also have to account for production of the entire neural plate from brain to spinal cord.
00:23:1811 So, what kind of tissue does noggin induce?
00:23:2111 Here we can use regional markers like this cement gland, this very anterior marker,
00:23:2612 or this forebrain-midbrain marker, otx2, and then this engrailed-2 is expressed just
00:23:3123 at the border of the hindbrain.
00:23:3326 And the noggin-treated explants will make these very anterior marker genes.
00:23:3904 they'll turn them on, but they don't turn on the more posterior ones.
00:23:4304 And so noggin, exclusively in this explant situation, induces anterior brain-like tissue.
00:23:5114 So, we have a molecule that works very well, but of course we then had to figure out how it works.
00:23:5820 And so, for this experiment, we for a long time labored under the delusion that
00:24:0220 we may have invented a new kind of signal transducer.
00:24:0600 At the time, it wasn't really appreciated that development gets by with a remarkably
00:24:0914 limited number of pathways.
00:24:1125 And so, here, what eventually turned out, with some very useful information from
00:24:1627 Chip Ferguson's lab, it was suggested that it may be impacting the BMP pathway.
00:24:2201 And Lyle Zimmerman was able to show that, because we had all these reagents in the lab
00:24:2523 at the. à l'époque.
00:24:2725 And the way that noggin actually works is not by activating any new signal transduction pathway,
00:24:3304 but rather by interfering with the BMP signaling pathway.
00:24:3611 Normally, BMP binds to its two receptors, brings them together, and that has the consequence
00:24:4117 of ventralizing the embryo.
00:24:4325 In this case, when noggin is present, it binds tightly to BMP, prevents this interaction,
00:24:5009 and then by default, instead of being ventralized, the embryo is dorsalized.
00:24:5513 So I'll stress that, that it's the absence of this BMP signal that is instructive to the embryo
00:25:0104 and allows the embryonic structures to make dorsal structures rather than BMP-induced
00:25:0712 ventral structures.
00:25:0901 And satisfyingly, this crystal structure from Jay Groppe shows that noggin, as a dimer,
00:25:1423 sort of embraces the dimer of BMP.
00:25:1626 So, it's not surprising that it, as Lyle Zimmerman showed, prevents the BMP from binding their receptors.
00:25:2606 It's a very high-affinity reaction, as was shown here by this competition experiment.
00:25:2913 And this was done again by Lyle Zimmerman.
00:25:3126 Here took iodinated BMP4 and was able to bind it to a chimeric human noggin, which has an
00:25:3926 immunoglobulin tail which makes it easy to precipitate.
00:25:4303 And so if one simply mixes these together, you get a very active binding and precipitation.
00:25:4916 But by mixing in different doses of different kinds of other TGF-betas, we could work out
00:25:5510 the affinity of this interaction.
00:25:5708 And so, notably, if we take BMP4, the red one, and plot how that interferes
00:26:0214 with binding of iodinated BMP4, we get this nice curve.
00:26:0714 And if we plot the half-maximal inhibition, it comes out that the interaction there is.
00:26:1202 it has a remarkably tight Kd of about 20 picomolar.
00:26:1626 Other BMPs, like BMP7, in blue here, have a lower affinity.
00:26:2305 And then yet other TGF-beta family members, like TGF-beta itself, have no measurable affinity.
00:26:2820 So, there is a variation in affinity, but very tight affinity for the BMP2 and -4 class.
00:26:3500 So, we come up with this general model that in normal development you set up the mesoderm
00:26:4026 with a special dorsal territory, this naive and fairly uniform ventral-lateral territory,
00:26:4626 and the rest of the patterning is mediated during gastrulation by dorsalizing signals
00:26:5128 like noggin that come from the dorsal-marginal zone, instruct the overlying epidermis
00:26:5713 to instead become nervous system, and instruct this ventral mesoderm to become things like muscle.
00:27:0222 So, is that it?
00:27:0420 Really, we've done this by add-back, but what about loss of function?
00:27:0900 And in the interim, a large number of other antagonists were discovered.
00:27:1213 And a lot of these were discovered by Eddy De Robertis' lab, so chordin and cerberus.
00:27:1916 Noggin, we discovered, Bill Smith discovered, as well as this Nodal-3 molecule.
00:27:2422 And follistatin had already been known about, but its activity as a dorsalizing molecule
00:27:2928 was worked out by Ali Brivanlou in Doug Melton's lab.
00:27:3302 So, looking at all these, they're all expressed in the organizer, and they all have some similar
00:27:3911 anti-BMP activities.
00:27:4113 You can see that they turn on at different times.
00:27:4316 This is the early stage, so some are turned on very early.
00:27:4718 And then some are turned on in slightly different territories.
00:27:5004 And perhaps that's important in how they work in detail, but so far, as far as we can tell,
00:27:5424 they all work essentially the same way.
00:27:5617 But there are a lot of them, and they probably have overlapping activity.
00:28:0108 And so if we try to knock down their activity, do we. can we knock down one and get a result,
00:28:0517 or do we have to knock down many?
00:28:0824 To do this experiment, we use morpholino oligonucleotides.
00:28:1114 These are synthetic, uncharged, and very stable oligonucleotides that can hybridize
00:28:1526 to the messenger RNA and interfere with translation, in this case.
00:28:2000 So, we can specifically use the information from base pairing to specifically knock down
00:28:2602 these individual RNAs.
00:28:2720 So, Mustafa Khokha, when he was in the lab, did this experiment using mixtures of morpholinos
00:28:3227 against follistatin, chordin, and noggin.
00:28:3517 And just as a side note, to make this simpler, we did it in the related species to Xenopus laevis,
00:28:4020 Xenopus tropicalis, which now had a sequenced genome, and so we could identify
00:28:4514 and design these oligonucleotides easily to target just single genes rather than two genes
00:28:5003 in the paleotetraploid, Xenopus laevis, genome.
00:28:5419 So, we can inject these morpholinos and then ask what happens.
00:28:5925 And we're going to use, for example, in the neurula stage, this neural marker, which at
00:29:0323 the mid-neurula stage has this nice ability to light up the neural plate.
00:29:1008 Because of worries about specificity of these reagents, which always become toxic if you
00:29:1404 put enough of them in, we do a specificity assay of rescuing.
00:29:1716 So, by cloning the pufferfish noggin, we could use that different sequence to put back BMP-antagonist activity,
00:29:2417 as we'll find out, and rescue the whole process.
00:29:2728 So, these are the kinds of results.
00:29:3009 So, we're going to do single, double, and triple knockdowns.
00:29:3410 And the results are pretty simple.
00:29:3527 When comparing the uninjected to the morpholino-injected, when we knocked down noggin we see no effect.
00:29:4203 Essentially no effect with follistatin.
00:29:4402 Some mild effect, as reported by De Robertis' group, for chordin.
00:29:4716 But then, when we knocked down two -- follistatin/noggin, chordin/noggin, chordin/follistatin --
00:29:5220 we see a more extreme effect.
00:29:5324 There's a smaller neural plate.
00:29:5511 Well, when we knocked down all three, there's a spectacular result, where now, instead of
00:29:5919 making the neural plate, the neural plate is eliminate. eliminated.
00:30:0328 Not only is the neural plate eliminated, but the underlying muscle is almost completely gone.
00:30:0908 And by this hedgehog control, the notochord and the floor plate are also gone.
00:30:1428 So, this is important to rescue.
00:30:1627 We can rescue it with this mixture of morpholinos, rescuing it with the pufferfish noggin.
00:30:2303 And as you see, we get back all of these tissues, demonstrating specificity.
00:30:2817 We can also rescue it by knocking down additional BMPs.
00:30:3206 So, instead of this horrendously high mixture of morpholinos, we're putting in
00:30:3614 even more morpholinos, but also knocking down BMPs.
00:30:3925 And again, you can see that rescue.
00:30:4102 So, we're pretty satisfied that this is a specific manipulation.
00:30:4421 So, knocking down the BMP antagonists eliminates the neural plate.
00:30:4921 You need the antagonists to make the neural plate.
00:30:5327 As we would expect, as you can see on the right of this picture, the loss of those
00:30:5814 dorsal structures is accompanied by a gain in ventrolateral structures.
00:31:0302 So here, for instance, let's. let's look at msx1.
00:31:0522 It's expressed just in the flank.
00:31:0802 But in this manipulated embryo, there's just a narrow stripe left of nonexpressing tissue.
00:31:1306 So, all these ventral tissues are expanded.
00:31:1708 We can also ask, when does this dorsal identity fail?
00:31:2010 When we knock down those antagonists, we clearly lose dorsal structures, but at what step does
00:31:2417 this happen?
00:31:2517 And of course, we would predict that it should fail at the time that normal genes are expressed,
00:31:2906 at the late blastula stage.
00:31:3128 We can start to look at that, and contrast the situation where we interfere with antagonist function
00:31:3802 in normal development, with what happens when we ventralize the embryo from
00:31:4212 the get-go, either with UV light or by depleting beta-catenin, actually also with a beta-catenin
00:31:4727 specific morpholino.
00:31:4902 So, in that case, we lose the beta-catenin purple signal, and we get just this ventralized embryo.
00:31:5611 Okay.
00:31:5711 So, in looking at those, we can see that in the. in the. in the morpholino-knockdown cases,
00:32:0515 where we've knocked down follistatin, chordin, and noggin, we have normal mesoderm,
00:32:0905 as marked by this brachyury gene, but in the case where we look for dorsal identity
00:32:1521 with the goosecoid marker -- here's the control, here's the follistatin/chordin/noggin knockdown --
00:32:2013 there's still dorsal identity.
00:32:2322 Whereas if we contrast that with the beta-catenin knockdown, where we've knocked down
00:32:2705 the early dorsal signal, then of course we never get a dorsal identity.
00:32:3023 So, there's a contrast here, showing that in the absence of the antagonists
00:32:3528 we still get a dorsal identity.
00:32:3713 But then that dorsal identity fails to execute. execute its function.
00:32:4404 And indeed, we can also look at these embryos to ask what happens to BMP signaling.
00:32:4818 And in particular, we can use this useful mark, vent2, because that's normally expressed
00:32:5313 everywhere except the organizer.
00:32:5515 And we also know it's a direct target of BMP signaling.
00:32:5921 So again, when we knock down the follistatin, chordin, and noggin, we see that that gap
00:33:0323 is filled in.
00:33:0508 So in other words, in the absence of the antagonists, there's a sign pretty early on of excess BMP signaling,
00:33:1100 which is going to mess up dorsal developments and lead to a ventralized embryo.
00:33:1519 And again, we get the similar effect, as we would expect, if we eliminate the organizer
00:33:2000 completely with beta-catenin.
00:33:2104 The same result is found with this early muscle marker, which.
00:33:2528 muscle development used to be thought to be development mostly on the graded signal
00:33:2911 from Nodal.
00:33:3011 But you can see here, clearly, that we need that BMP antagonist in order to amplify the
00:33:3506 expression of this muscle determinant in the early embryo.
00:33:3928 So overall, we conclude now that this pathway, of knockdown of BMP activity by these BMP antagonists,
00:33:4726 by a cocktail of BMP antagonists, is crucial to get dorsal development,
00:33:5224 and in order to get neural induction to occur.
00:33:5508 We can show that these molecules by themselves, as protein, induce neural tissue.
00:33:5826 We can show that the combination is essential.
00:34:0127 And they are expressed in the right time and the right place to be ex. executing this function.
00:34:0704 So all in all, it's a comprehensive statement that these are crucial for neural induction
00:34:1303 and dorsal development.
00:34:1513 We can add on the additional observation from the end, that even in the absence of.
00:34:2200 well, in the absence of these antagonists, the early events go by perfectly normal. normally,
00:34:2725 and we get dorsal specification in the marginal zone.
00:34:3108 But in the absence of the antagonists, that organizer can no longer execute its function.
00:34:3621 So all in all, we can conclude then that BMP antagonists are essential for
00:34:4202 the Spemann organizer phenomenon.
00:34:4327 Thank you.

  • Part 1: Early Frog Development: How to Make a Tadpole


Voir la vidéo: Webinar Sonoscanner: Echographie du 1er trimestre expliquée pas à pas (Janvier 2022).