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4.7B : Mitochondries - Biologie


Objectifs d'apprentissage

  • Expliquez le rôle des mitochondries.

L'une des principales caractéristiques qui distinguent les procaryotes des eucaryotes est la présence de mitochondries. Les mitochondries sont des organites à double membrane qui contiennent leurs propres ribosomes et ADN. Chaque membrane est une bicouche phospholipidique enrobée de protéines. Les cellules eucaryotes peuvent contenir de un à plusieurs milliers de mitochondries, selon le niveau de consommation d'énergie de la cellule. Chaque mitochondrie mesure 1 à 10 micromètres (ou plus) de longueur et existe dans la cellule sous la forme d'un organite qui peut être ovoïde à en forme de ver à ramifié de manière complexe.

Structure des mitochondries

La plupart des mitochondries sont entourées de deux membranes, ce qui se produirait lorsqu'un organisme lié à la membrane était englouti dans une vacuole par un autre organisme lié à la membrane. La membrane interne mitochondriale est étendue et comporte des replis substantiels appelés crêtes qui ressemblent à la surface externe texturée des alpha-protéobactéries. La matrice et la membrane interne sont riches en enzymes nécessaires à la respiration aérobie.

Les mitochondries ont leur propre chromosome d'ADN (généralement) circulaire qui est stabilisé par des attaches à la membrane interne et porte des gènes similaires aux gènes exprimés par les alpha-protéobactéries. Les mitochondries ont également des ribosomes spéciaux et des ARN de transfert qui ressemblent à ces composants chez les procaryotes. Ces caractéristiques soutiennent toutes l'hypothèse selon laquelle les mitochondries étaient autrefois des procaryotes libres.

Fonction mitochondrie

Les mitochondries sont souvent appelées les « centrales » ou « usines d'énergie » d'une cellule, car elles sont responsables de la fabrication de l'adénosine triphosphate (ATP), la principale molécule porteuse d'énergie de la cellule. L'ATP représente l'énergie stockée à court terme de la cellule. La respiration cellulaire est le processus de fabrication de l'ATP en utilisant l'énergie chimique trouvée dans le glucose et d'autres nutriments. Dans les mitochondries, ce processus utilise de l'oxygène et produit du dioxyde de carbone comme déchet. En fait, le dioxyde de carbone que vous expirez à chaque respiration provient des réactions cellulaires qui produisent du dioxyde de carbone comme sous-produit.

Il est important de souligner que les cellules musculaires ont une très forte concentration de mitochondries qui produisent de l'ATP. Vos cellules musculaires ont besoin de beaucoup d'énergie pour garder votre corps en mouvement. Lorsque vos cellules ne reçoivent pas assez d'oxygène, elles ne produisent pas beaucoup d'ATP. Au lieu de cela, la petite quantité d'ATP qu'ils produisent en l'absence d'oxygène s'accompagne de la production d'acide lactique. En plus de la génération aérobie d'ATP, les mitochondries ont plusieurs autres fonctions métaboliques. L'une de ces fonctions est de générer des amas de fer et de soufre qui sont des cofacteurs importants de nombreuses enzymes. De telles fonctions sont souvent associées aux organites dérivés des mitochondries réduites des eucaryotes anaérobies.

Origines des mitochondries

Il existe deux hypothèses sur l'origine des mitochondries : endosymbiotique et autogène, mais la théorie la plus accréditée à l'heure actuelle est l'endosymbiose. L'hypothèse endosymbiotique suggère que les mitochondries étaient à l'origine des cellules procaryotes, capables de mettre en œuvre des mécanismes oxydatifs. Ces cellules procaryotes ont peut-être été englouties par un eucaryote et sont devenues des endosymbiotes vivant à l'intérieur de l'eucaryote.

Points clés

  • Les mitochondries contiennent leurs propres ribosomes et ADN ; combinées à leur double membrane, ces caractéristiques suggèrent qu'ils pourraient avoir été autrefois des procaryotes libres qui ont été engloutis par une cellule plus grande.
  • Les mitochondries jouent un rôle important dans la respiration cellulaire grâce à la production d'ATP, en utilisant l'énergie chimique présente dans le glucose et d'autres nutriments.
  • Les mitochondries sont également responsables de la génération d'amas de fer et de soufre, qui sont des cofacteurs importants de nombreuses enzymes.

Mots clés

  • alpha-protéobactéries: Une classe taxonomique au sein du phylum Proteobacteria - les protéobactéries phototropes.
  • l'adénosine triphosphate: un nucléoside triphosphate multifonctionnel utilisé dans les cellules comme coenzyme, souvent appelé « unité moléculaire de la monnaie énergétique » dans le transfert d'énergie intracellulaire
  • cofacteur: molécule inorganique nécessaire au fonctionnement d'une enzyme

Les diverses conséquences de l'aneuploïdie

L'aneuploïdie, ou nombre de chromosomes déséquilibré, a des effets profonds sur les cellules eucaryotes. Chez l'homme, l'aneuploïdie est associée à diverses pathologies, dont le cancer, ce qui suggère qu'elle médie un avantage prolifératif dans ces conditions. Ici, nous discutons des changements physiologiques déclenchés par l'aneuploïdie, tels que la croissance cellulaire altérée, les changements transcriptionnels, le stress protéotoxique, l'instabilité génomique et la réponse aux interférons, et comment les cellules cancéreuses s'adaptent au génome aneuploïde changeant.


INTRODUCTION

Les organites telles que les mitochondries sont principalement héritées par la mère dans les embryons de métazoaires (Ukeshima et Fujimoto, 1984 Pepling et Spradling, 2001 Wilding et al., 2001 Dumollard et al., 2006 Zhang et al., 2008). Les mitochondries sont des organites semi-autonomes qui participent à la production d'énergie et au tampon calcique dans la cellule. Ils produisent des espèces réactives de l'oxygène (ROS) en tant que sous-produit de la chaîne de transport d'électrons et des métabolites importants qui interagissent avec divers processus dans une cellule eucaryote.

Les mitochondries sont petites et fragmentées dans les premiers embryons de vertébrés et d'invertébrés du blastoderme (Bavister et Squirrell, 2000 Sathananthan et Trounson, 2000 Van Blerkom et al., 2002 Dumollard et al., 2007 Chowdhary et al., 2017). La taille et la forme des mitochondries sont régulées par des machines dédiées à la fission et à la fusion. La protéine de fission Drp1 (protéine liée à la dynamique 1) s'oligomérise autour de la membrane mitochondriale externe pour former des mitochondries filles plus petites. Opa1 (atrophie optique 1) et Mfn/Mfn2 (mitofusines) (facteur de régulation de l'assemblage mitochondrial Marf dans Drosophile) sont impliqués dans la fusion des membranes interne et externe, respectivement (van der Bliek et al., 2013). La forme mitochondriale et l'architecture des crêtes ont été corrélées avec leur production métabolique, les ROS et le tampon calcique (Yu et al., 2006 et al., 2010 Chen et al., 2012 Cogliati et al., 2013 Mishra et Chan, 2016 Toyama et al., 2016). La perte de protéines régulant la morphologie mitochondriale au cours de l'embryogenèse conduit à l'abrogation du développement. Les souris knock-out Drp1, Mfn et Opa1 sont mortelles embryonnaires (Chen et al., 2003 Ishihara et al., 2009 Wakabayashi et al., 2009 Moore et al., 2010).

La régulation de la morphologie mitochondriale est importante pour un transport mitochondrial efficace au sein des cellules. Les mitochondries se déplacent sur les microtubules à l'aide de moteurs spécifiques vers des emplacements distincts de la cellule (Yaffe et al., 1996 Hollenbeck et Saxton, 2005 Saxton et Hollenbeck, 2012 Schwarz, 2013). Leur transport vers des emplacements distincts dans les neurones est nécessaire pour l'approvisionnement énergétique local et le tampon calcique, ce qui est essentiel pour la fonction synaptique neuronale (Morris et Hollenbeck, 1993 Mironov et Symonchuk, 2006 Rice et Gelfand, 2006 Saotome et al., 2008 Wang et Schwarz, 2009). Les mitochondries fusionnées dans les neurones mutants Drp1 s'accumulent dans le corps cellulaire et l'axone et entraînent une diminution de l'activité synaptique (Verstreken et al., 2005 Rikhy et al., 2007).

La littérature souligne l'implication de la forme et de la fonction mitochondriale dans les processus morphogénétiques de l'embryogenèse métazoaire. Cependant, le mécanisme et la fonction de régulation de la morphologie mitochondriale au cours de l'embryogenèse restent à étudier. Dans cette étude, nous visons à discerner la fonction de la morphologie et de la distribution mitochondriale au cours de la formation cellulaire dans Drosophile embryogenèse. Les Drosophile L'embryon du blastoderme est un syncytium où les cycles nucléaires (NC) 1 à 13 se produisent dans un cytoplasme commun. La formation de cellules se produit dans l'interphase prolongée de NC14 dans un processus appelé cellularisation. Au cours de la cellularisation, les membranes cellulaires courtes d'environ 3 à 5 µm de longueur s'étendent à la base de manière synchrone dans l'ensemble de l'embryon. Cela forme une couche corticale d'environ 6 000 cellules épithéliales hautes de 40 à 45 m de hauteur en 45 à 50 minutes environ (Lecuit et Wieschaus, 2000 Mazumdar et Mazumdar, 2002). L'extension membranaire s'accompagne de l'assemblage de structures contractiles d'actomyosine au niveau des fronts membranaires pénétrants (Warn et Robert-Nicoud, 1990 Young et al., 1991 Schejter et Wieschaus, 1993 Il et al., 2016), ainsi que des protéines de remodelage du cytosquelette (Afshar et al., 2000 Champ et al., 2005 Grosshans, 2005 Mavrakis et al., 2014) pour resserrer la membrane à la base et enfermer le contenu cytoplasmique dans les cellules.

Nous avons examiné si la morphologie et la distribution des mitochondries sont régulées au cours de Drosophile cellularisation. Les mitochondries sont petites, fragmentées et abondantes dans le syncytial Drosophile embryons (Chowdhary et al., 2017). Nous avons constaté que les mitochondries étaient fragmentées et enrichies à la base au début de la cellularisation. Leur distribution s'est accentuée au niveau apical pendant la cellularisation par transport à base de microtubules. Le transport apical des mitochondries a échoué lors de leur regroupement dans les embryons mutants de la protéine de fission mitochondriale Drp1. L'épuisement de Drp1 a entraîné une diminution des ROS cytoplasmiques et des défauts dans l'entrée du sillon et la constriction de l'anneau contractile, similaire à celui des mutants de la myosine II. Ces défauts ont été supprimés lors de la fission mitochondriale forcée et de l'élévation des ROS cytoplasmiques dans les embryons mutants Drp1. Notre étude propose un rôle pour la morphologie et l'activité mitochondriale dans le maintien d'un seuil de fonction active de la myosine II pour conduire la formation de cellules et la constriction contractile de l'anneau pendant Drosophile embryogenèse.


Résumé

Objectif-

L'activation des cellules endothéliales (CE) induite par l'hyperlipidémie est considérée comme un événement initial responsable du recrutement des monocytes dans l'athérogenèse. Cependant, il reste mal défini quel est le mécanisme sous-jacent à l'activation des CE induite par l'hyperlipidémie. Ici, nous avons testé une nouvelle hypothèse selon laquelle les espèces réactives de l'oxygène mitochondrial (mtROS) servent de médiateurs de signalisation pour l'activation de la CE dans l'athérosclérose précoce.

Approche et résultats—

Des analyses métabolomiques et transcriptomiques ont révélé que plusieurs espèces de lysophosphatidylcholine (LPC), telles que 16:0, 18:0 et 18:1, et leurs enzymes de transformation, y compris Pla2g7 et Pla2g4c, étaient significativement induites dans les aortes de souris knock-out pour l'apolipoprotéine E au cours de athérosclérose précoce. En utilisant la résonance de spin électronique et la cytométrie en flux, nous avons constaté que le LPC 16:0, 18:0 et 18:1 induisait des mtROS dans les CE aortiques humaines primaires, indépendamment des activités de la nicotinamide adénine dinucléotide phosphate oxydase. Mécaniquement, en utilisant la microscopie confocale et l'analyseur mitochondrial Seahorse XF, nous avons montré que le LPC induisait mtROS via une augmentation unique de la fuite de protons et de l'O mitochondrial induite par l'entrée de calcium.2 réduction. En outre, nous avons constaté que mtROS contribuait à l'activation des CE induite par LPC en régulant la liaison nucléaire de la protéine activatrice-1 et en induisant l'expression du gène de la molécule d'adhésion intercellulaire-1 in vitro. En outre, nous avons montré que l'inhibiteur de mtROS MitoTEMPO supprimait l'activation de la CE et le recrutement des monocytes aortiques chez les souris knock-out pour l'apolipoprotéine E en utilisant des méthodes de microscopie intravitale et de cytométrie en flux.

Conclusion—

L'augmentation de mtROS non couplée par synthèse d'ATP, mais couplée par fuite de protons, médie l'activation de la CE induite par LPC au cours de l'athérosclérose précoce. Ces résultats indiquent que les antioxydants mitochondriaux sont des thérapies prometteuses pour l'inflammation vasculaire et les maladies cardiovasculaires.

L'athérosclérose est un processus pathogène inflammatoire chronique des artères, qui conduit à des maladies cardiovasculaires (MCV), y compris un infarctus du myocarde et un accident vasculaire cérébral. 1 Malgré les thérapies actuelles, les MCV restent la première cause de décès aux États-Unis. 2 Nous et d'autres avons déjà montré que l'hyperlipidémie, ainsi que d'autres facteurs de stress cardiovasculaires, tels que l'hyperglycémie et l'hyperhomocystéinémie, favorisent l'athérosclérose via plusieurs mécanismes. Ces mécanismes comprennent l'activation et la lésion des cellules endothéliales (CE) 3,4 le recrutement et la différenciation des monocytes 5,6 une diminution des cellules T régulatrices 7,8 et une altération de la capacité de réparation vasculaire des cellules progénitrices dérivées de la moelle osseuse. 9,10 L'activation des CE induite par l'hyperlipidémie est considérée comme un événement initial responsable du recrutement des monocytes dans l'athérogenèse. 1 Cependant, le mécanisme moléculaire sous-jacent à l'activation des CE induite par l'hyperlipidémie reste mal défini.

Les lysophosphatidylcholines (LPC) sont un groupe de lipides pro-inflammatoires, qui sont impliqués de manière critique dans la pathogenèse de l'athérosclérose. 11 De multiples sources de données indiquent que les LPC aortiques sont induites dans l'athérosclérose avancée. Dès 1969, il a été rapporté que la concentration de LPC aortiques de singes nourris avec un régime athérogène pendant 3 à 6 mois était près de 8 fois supérieure à celle du groupe témoin. 12 De plus, les porcs diabétiques et hypercholestérolémiques atteints d'athérosclérose coronarienne avancée ont montré une augmentation de 305% du contenu en LPC artériel. 13 De plus, différentes espèces de LPC, y compris le palmitoyl-LPC (16:0), le stéaroyl-LPC (18:0) et l'oléoyl-LPC (18:1), étaient ≈ 2 fois plus élevées dans les plaques d'athérosclérose associées aux symptômes que celles dans plaques asymptomatiques chez l'homme. 14 Cependant, si la LPC est induite au cours de l'athérogenèse précoce reste inconnue.

Il a été montré il y a 30 ans que lorsque des lipoprotéines de basse densité étaient incubées avec des CE, les lipoprotéines de basse densité étaient oxydées et jusqu'à 40 % du phospholipide des lipoprotéines de basse densité était hydrolysé en LPC par l'action enzymatique de la phospholipase. 15 Il a ensuite été découvert que le LPC pouvait activer puissamment les CE et induire l'adhésion des monocytes en régulant positivement l'expression du gène de la molécule d'adhésion intercellulaire-1 (ICAM-1) dans les CE de la veine ombilicale humaine (HUVEC). 16 En outre, l'inhibiteur des espèces réactives de l'oxygène (ROS) et l'inhibiteur du calcium intracellulaire pourraient bloquer l'expression du gène ICAM-1 induite par le LPC dans les HUVEC. 17 De plus, le LPC a également activé des facteurs de transcription pro-inflammatoires, tels que le facteur nucléaire-κB (NF-κB) et la protéine activatrice-1 (AP-1), dans les HUVEC. 18 Néanmoins, la source de ROS qui contribue à l'activation de l'EC induite par LPC et les liens mécanistiques entre ces événements de signalisation cellulaire restent incertains.

Il existe de multiples sources cellulaires de ROS, notamment la chaîne de transport d'électrons mitochondriale, la nicotinamide adénine dinucléotide phosphate oxydase (NADPH oxydase), la xanthine oxydase, l'oxyde nitrique synthase non couplé et le cytochrome P450. En tant que contributeur majeur aux ROS cellulaires, les ROS mitochondriales (mtROS) sont générés à partir de la réduction partielle de l'oxygène pour former du superoxyde au complexe I et au complexe III dans la chaîne de transport d'électrons mitochondriale. 19 Bien que les mtROS soient historiquement considérés comme des sous-produits toxiques du métabolisme mitochondrial, il a été récemment découvert que les mtROS sont en fait des molécules de signalisation qui contribuent directement à la production de cytokines pro-inflammatoires, 19 indépendamment du générateur cytosolique clé de ROS, la NADPH oxydase. 20 De plus, la production de mtROS est régulée par plusieurs facteurs, tels que le potentiel membranaire mitochondrial, le Ca 2+ mitochondrial et la fuite de protons mitochondriaux. 19 Cependant, étant donné que la production de mtROS et d'ATP sont toutes deux couplées à l'activité de la chaîne de transport d'électrons, on ne sait toujours pas comment mtROS pourrait être induit indépendamment de la synthèse d'ATP.

Ainsi, malgré des progrès récents, 2 lacunes importantes dans les connaissances existent : premièrement, on ne sait pas si l'expression de LPC est augmentée au cours de l'athérosclérose précoce. Dans cette étude, nous testons une nouvelle hypothèse selon laquelle les mtROS servent de médiateurs de signalisation pour l'activation des CE induite par LPC. En utilisant l'analyse métabolomique et le profilage de microréseaux, ainsi que des approches de biochimie et de biologie moléculaire, nous avons constaté que les LPC étaient induites dans l'aorte au cours de l'athérosclérose précoce et que mtROS médiait l'activation des CE induite par LPC. En outre, nous avons découvert un nouveau mécanisme de synthèse d'ATP, non couplé, mais couplé par fuite de protons, dans la conduite de la production de mtROS dans la cellule. Ainsi, mtROS peut servir de nouvelle cible pour une intervention thérapeutique dans l'inflammation vasculaire et les maladies cardiovasculaires.

Matériaux et méthodes

Les matériaux et méthodes sont disponibles dans le supplément de données en ligne uniquement.

Résultats

Les LPC sont induits dans l'aorte au cours de l'athérosclérose précoce chez la souris

Pour déterminer si le LPC est impliqué dans le développement précoce de l'athérosclérose, nous avons examiné les niveaux de LPC dans les aortes de souris knockout pour l'apolipoprotéine E (ApoE -/-) (un modèle de souris athéroscléreuse) par rapport à ceux de souris témoins de type sauvage. Nous avons effectué une analyse métabolomique non ciblée sur les aortes de ces souris nourries avec un régime riche en graisses pendant 3 semaines (Figure I dans le supplément de données en ligne uniquement). Il est à noter qu'un régime riche en graisses de type occidental a été utilisé pour accélérer l'athérosclérose, et nous et d'autres avons déjà montré que chez des souris ApoE −/− nourries avec un régime riche en graisses pendant 3 semaines, le taux de cholestérol plasmatique a triplé, mais une plaque minimale s'est développée. dans l'aorte. 3,21 Ainsi, il sert bien de modèle de souris d'athérosclérose précoce. Nous avons pu détecter 8 espèces différentes de LPC dans les aortes de souris sauvages et ApoE −/−. Les 3 espèces les plus abondantes dans l'aorte comprenaient le palmitoyl-LPC (16:0), le stéaroyl-LPC (18:0) et l'oléoyl-LPC (18:1). Étonnamment, toutes les espèces LPC détectées ont été induites de manière significative dans les aortes des souris ApoE -/-, à l'exception du linoléoyl-LPC (18:2) (figure 1A). Le LPC est produit par l'action enzymatique de la phospholipase A2 (APL2) sur la phosphatidylcholine et le PLA2 les membres enzymatiques de la superfamille sont fortement impliqués dans l'athérosclérose. 11,22 Pour ces raisons, nous avons également examiné les changements d'expression génique de tous les PLA2 enzymes de la superfamille entre les souris ApoE -/- et les souris de type sauvage en utilisant l'analyse par microarray. Les résultats ont montré que Pla2g7 (également connu sous le nom de PLA associé aux lipoprotéines2) et Pla2g4c ont été induits de manière significative dans les aortes de souris ApoE -/- au début de l'athérosclérose (Figure 1B Tableau I dans le supplément de données en ligne uniquement). Notamment, les niveaux d'expression de 3 gènes de ménage se situaient dans la plage de 0,97 à 1,06, suggérant la haute qualité de notre analyse de microarray et la spécificité de PLA2 régulation à la hausse. Il est possible que le LPC aortique soit augmenté en raison de la disponibilité accrue du substrat chez les souris ApoE -/-. Cependant, il est peu probable que ce soit le cas car plusieurs acides gras à longue chaîne, dont le palmitate (16:0), le stéarate (18:0) et l'oléate (18:1n9), n'étaient pas significativement augmentés dans les aortes d'ApoE - /− souris (Figure I dans le supplément de données en ligne uniquement). Pris ensemble, ces résultats indiquent que le LPC est induit au début de l'athérosclérose, probablement en raison de l'induction de l'expression des enzymes Pla2g7 et Pla2g4c (Figure I dans le supplément de données en ligne uniquement).

Figure 1. Les espèces de lysophoshatidylcholine aortique (LPC) sont induites au cours de l'athérogenèse précoce chez la souris. Des souris de type sauvage (WT) âgées de huit semaines et des souris knockout pour l'apolipoprotéine E (ApoE -/-) ont été nourries avec un régime riche en graisses pendant 3 semaines avant d'être euthanasiées. Des aortes ont été prélevées sur ces souris pour une analyse métabolomique (UNE) et l'analyse des puces à ADN (B). UNE, Les espèces LPC aortiques ont été induites au début de l'athérosclérose. Des changements relatifs de LPC aortique entre WT et ApoE −/− ont été montrés (n=8 par groupe). B, des enzymes générant des LPC, dont Pla2g4c et Pla2g7, ont été induites dans les aortes au cours de l'athérosclérose précoce. Le tracé du volcan a été présenté qui a montré un changement de pli et des statistiques P valeur des changements d'expression de la phospholipase A2 membres de la superfamille et 3 gènes de ménage (Actb, Gapdh, et Non non) entre les souris ApoE −/− et les souris WT (n=5 par groupe triangle plein, augmentation significative de la phospholipase A2 [APL2] gènes diamant gris, PLA inchangé2 cercle vide des gènes, contrôle des gènes de ménage). Pour tous les panels, les valeurs représentent la moyenne ± SEM. NS indique non significatif. *P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001.

Le LPC induit mtROS indépendamment de la NADPH oxydase, dans les CE aortiques humaines

Ensuite, nous avons émis l'hypothèse que l'induction de LPC aortique pourrait contribuer au développement de l'athérosclérose en favorisant l'activation de l'EC aortique. Il convient de noter que les macrophages lésionnels sont également présents dans l'athérosclérose précoce, mais notre étude actuelle se concentre sur l'étude du rôle de la LPC dans l'activation de la CE aortique. Il a déjà été démontré que le LPC induisait l'activation de la CE dans les HUVEC. 16 De plus, l'activation de la CE induite par le LPC dans les HUVEC pourrait être bloquée par le diphénylèneiodonium, 17 qui inhibe la génération de ROS à partir des mitochondries ainsi que la NADPH oxydase, cette dernière étant un générateur cytosolique majeur de ROS. Ainsi, la source intracellulaire de ROS contribuant à l'activation des CE aortiques humaines (HAEC) induite par LPC reste à préciser. Pour examiner cette question, nous avons d'abord comparé les effets du LPC sur la production de mtROS et de ROS cytosoliques dans les HAEC simultanément en utilisant la méthode de résonance de spin électronique. Nous avons constaté que 10 µmol/L de palmitoyl-LPC (16:0) induisaient rapidement la production de mtROS en 30 minutes, qui durait au moins 6 heures et diminuait après 24 heures (Figure 2A et 2B). En outre, LPC induit des ROS cytosoliques d'une manière similaire, mais à un degré moindre (figure 2B). Il est important de noter qu'un inhibiteur spécifique de la NADPH oxydase, le VAS-2870, n'a pas empêché le mtROS induit par le LPC dans les HAEC, mais l'a plutôt augmenté (Figure 2C). Il convient de noter que le traitement VAS-2870 seul a également induit de manière significative le mtROS dans les HAEC, suggérant que le mtROS peut être induit pour compenser la perte de ROS cytosolique dans la cellule. Il est possible que le VAS-2870 lui-même ait stimulé la production de mtROS en plus d'inhiber la NADPH oxydase. Cependant, il est peu probable que ce soit le cas car un autre inhibiteur spécifique de la NADPH oxydase, VAS3947, induit de la même manière mtROS (données non présentées). De plus, l'inducteur de mtROS, Antimycin A, a induit à la fois des mtROS et des ROS cytosoliques, tandis que l'activateur de la NADPH oxydase, l'acétate de myristate de phorbol, n'a induit que des ROS cytosoliques (figure 2D). Pris ensemble, ces résultats ont démontré que les mtROS induits par LPC sont situés en amont du pipeline dans la génération de ROS cytosoliques.

Figure 2. La lysophoshatidylcholine (LPC) induit des espèces oxygénées réactives mitochondriales (mtROS) dans les cellules endothéliales aortiques humaines (HAEC). UNE, LPC induit en fonction du temps mtROS. Les HAEC ont été traités avec du LPC (16:0, 10 mol/L) à différents moments, et des aliquotes de cellules ont été incubées avec MitoTEMPO-H (1 mmol/L) à 37°C pendant 20 min avant l'analyse par résonance de spin électronique (ESR) (n=4 P valeurs vs contrôle). B, Des mtROS plus élevés que les espèces réactives de l'oxygène cytosoliques (ROS) ont été induits par LPC. Les HAEC ont été traités avec du LPC (16:0, 10 mol/L) à différents moments, et des aliquotes de cellules ont été incubées avec la sonde de spin mtROS MitoTEMPO-H (1 mmol/L, ligne rouge) ou la sonde de spin ROS cytosolique CP-H (1-hydroxy-3-carboxy-pyrrolidine 1 mmol/L, trait vert) à 37°C pendant 20 min avant mesure par ESR. C, L'effet de l'inhibition de la nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) oxydase sur mtROS induite par LPC. Après chargement avec MitoSOX (5 mol/L) pendant 10 min, les HAECs ont été traités avec LPC (16:0, 10 mol/L) avec ou sans inhibiteur de la NADPH oxydase VAS-2870 (5 μmol/L) pendant 1 h avant cytométrie en flux analyse (n=6). Le changement de pli de la population de cellules MitoSOX+ a été montré. , L'effet de l'activation de la NADPH oxydase sur mtROS. Les HAEC ont été traités avec de l'Antimycine A (5 mol/L) ou de l'acétate de myristate de phorbol (5 μmol/L) pendant 1 h, et les cellules ont été incubées avec la sonde mtROS MitoTEMPO-H (1 mmol/L) et la sonde ROS cytosolique CP-H ( 1 mmol/L) avant mesure par ESR. Les signaux ESR ont été montrés et les changements de pli ont été quantifiés en mesurant la différence entre le signal de sonde de spin maximal et minimal. E, mtROS induite de manière dose-dépendante par le LPC. Après chargement avec MitoSOX (5 mol/L) pendant 10 min, les HAECs ont été traités avec différentes doses de LPC (16:0) allant de 2,5 à 40 μmol/L pendant 1 h avant analyse par cytométrie en flux (n=8 P valeurs vs contrôle). F, Une concentration plus élevée de cytotoxicité induite par LPC. Les HAECs ont été traités avec différentes doses de LPC (16:0) pendant 1 h, et les milieux cellulaires ont été collectés pour la mesure de la libération de lactate déshydrogénase (LDH) comme indicateur de cytotoxicité (n = 15 P valeurs vs contrôle). g, Trois espèces majeures de LPC ont toutes induit des mtROS. Trois espèces majeures de LPC (10 μmol/L), dont LPC (16 : 0), LPC (18 : 0) et LPC (18 : 1). méthode (n=6 P valeurs vs contrôle). H, Visualisation de l'induction de mtROS par LPC. Après traitement des HAEC avec un véhicule témoin ou LPC (16:0, 10 mol/L) pendant 1 h, la coloration MitoSOX a été visualisée par microscopie à fluorescence. Les données sont représentatives de 3 champs choisis au hasard. Pour tous les panels, les valeurs représentent la moyenne ± SEM, et les données sont représentatives d'au moins 2 expériences indépendantes. NS indique non significatif. *P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001.

Pour confirmer les résultats de la résonance de spin électronique, nous avons utilisé une autre sonde de fluorescence mtROS spécifique, MitoSOX, combinée à l'utilisation de la cytométrie en flux et avons constaté que le LPC augmentait de manière dose-dépendante la production de mtROS dans les HAEC (figure 2E). Une dose plus élevée de LPC (40 mol/L), cependant, n'a pas induit davantage de mtROS mais était cytotoxique (Figure 2E et 2F). De plus, nous avons constaté que l'induction de mtROS est une caractéristique commune partagée par les membres de la famille LPC car les 3 espèces principales de LPC, y compris LPC (16:0), LPC (18:0) et LPC (18: 1) , induit de la même manière la production de mtROS dans les HAEC (figure 2G). Parce que LPC (16:0) était l'espèce LPC aortique la plus abondamment exprimée (Figure 1A), 10 mol/L LPC (16:0) a été utilisé ci-après dans cette étude. Enfin, nous avons utilisé une troisième méthode, la microscopie à fluorescence, et confirmé que le LPC induisait des mtROS dans les HAEC (figure 2H). Collectivement, ces résultats indiquent que 3 espèces majeures de LPC, régulées à la hausse dans les aortes athéroscléreuses précoces (figure 1A), pourraient toutes induire des mtROS dans les HAEC. Bien que des niveaux élevés de mtROS induits par une concentration élevée de LPC soient associés à la mort des CE, des niveaux modérés de mtROS stimulés par 10 µmol/L de LPC pourraient servir de molécules de signalisation pour l'activation des CE.

L'entrée mitochondriale du Ca 2+ médie la production de mtROS induite par LPC en augmentant la fuite de protons mitochondriaux et la réduction de l'oxygène dans les HAEC

La production de mtROS est régulée par plusieurs facteurs, tels que l'état métabolique des mitochondries, le potentiel de membrane mitochondriale et l'influx mitochondrial de Ca 2+. 19,23 Parce que des études antérieures ont rapporté que le LPC pouvait induire des niveaux de Ca 2+ cytosolique 24 et que l'influx de Ca 2+ dans les mitochondries est un régulateur positif de l'O mitochondrial2 taux de réduction, 25 nous avons émis l'hypothèse que l'entrée de Ca 2+ induite par le LPC dans les mitochondries pourrait entraîner une augmentation de la production de mtROS. Premièrement, nous avons examiné les effets du LPC sur les niveaux de Ca 2+ cytosolique et mitochondrial simultanément en utilisant la microscopie confocale. Les résultats ont montré que le LPC induisait considérablement le Ca 2+ cytosolique, qui était rapidement suivi par l'induction mitochondriale du Ca 2+ (Figure 3A et 3B). La réponse maximale de l'entrée du Ca 2+ mitochondrial était similaire à celle du Ca 2+ cytosolique, et les deux signaux ont duré au moins 5 minutes (Figure 3B et 3C). Ces résultats indiquent que le LPC induit l'entrée de Ca 2+ mitochondrial à partir du cytosol.

Figure 3. La lysophoshatidylcholine (LPC) induit l'entrée mitochondriale du Ca 2+ dans les HAEC. UNE, LPC induit à la fois du Ca 2+ cytosolique et du Ca 2+ mitochondrial dans les HAEC. Les HAEC chargés d'indicateur cytosolique Ca 2+ (cytoCa 2+ ) Fluo-4/AM (vert) et mitochondrial Ca 2+ (mitoCa 2+ ) indicateur Rhod-2 (rouge) ont été stimulés par 10 μmol/L LPC et analysés par confocal microscopie. Les images ont été prises avant et après la stimulation du LPC. B, le Ca 2+ mitochondrial induit par le LPC a suivi rapidement après l'augmentation du Ca 2+ cytosolique. Le traçage en temps réel de la mobilisation du Ca 2+ cytosolique et mitochondrial en réponse à la LPC à partir de l'analyse en microscopie confocale a été montré. Chaque ligne représente la valeur moyenne de 3 cellules. C, le LPC a induit des niveaux similaires de Ca 2+ mitochondrial et de Ca 2+ cytosolique. La quantification du pic de réponse du Ca 2+ cytosolique et du Ca 2+ mitochondrial à partir de l'analyse en microscopie confocale a été montrée (n = 9). Pour tous les panels, les valeurs représentent la moyenne ± SEM, et les données sont représentatives d'au moins 3 expériences indépendantes. ***P<0.001. CytoCa 2+ indique Ca 2+ F/F cytosolique0, les rapports d'intensité de fluorescence et mitoCa 2+ , mitochondrial Ca 2+ .

Ensuite, nous avons émis l'hypothèse que l'entrée de Ca 2+ mitochondrial induite par LPC pourrait conduire à la production de mtROS dans les HAEC. Pour examiner cela, nous avons utilisé le rouge de ruthénium (RR), qui est un inhibiteur de l'uniporteur de calcium mitochondrial (MCU) qui peut bloquer l'entrée de Ca 2+ dans les mitochondries. Nous avons constaté que RR abolissait complètement la production de mtROS induite par LPC (figure 4A), indiquant que l'entrée mitochondriale de Ca 2+ médie le mtROS induit par LPC dans les HAEC. Pour déterminer comment l'entrée mitochondriale de Ca 2+ induite par LPC a accéléré la production de mtROS, nous avons utilisé l'analyseur Seahorse XF96 pour évaluer les fonctions des mitochondries. L'analyseur Seahorse XF pourrait mesurer 6 paramètres mitochondriaux différents, y compris l'O mitochondrial2 taux de réduction, O non mitochondrial2 taux de réduction, fuite de protons, production d'ATP, respiration maximale et capacité respiratoire disponible (Figure II dans le supplément de données en ligne uniquement). Nous avons constaté que le LPC induisait significativement l'O mitochondrial2 taux de réduction mais n'a pas affecté l'O non mitochondrial2 taux de réduction (Figure 4B et 4C), qui était en corrélation avec nos conclusions précédentes selon lesquelles les ROS stimulées par LPC provenaient des mitochondries, mais pas du cytosol (Figure 2). De plus, l'inhibiteur de MCU, RR, a inhibé de manière significative l'O mitochondrial induit par le LPC.2 taux de réduction (figure 4C), en corrélation avec les résultats précédents selon lesquels l'entrée mitochondriale de Ca 2+ médie le mtROS induit par LPC dans les HAEC (figure 4A). Le LPC a également augmenté de manière significative les taux de respiration maximale, mais il n'a pas modifié la capacité respiratoire de réserve des mitochondries (figure 4C), ce qui suggère que l'O maximal induit par le LPC2 l'augmentation de la réduction était principalement due à l'augmentation de l'O basal2 réduction. Le taux d'O mitochondrial2 la réduction est couplée aux taux de production d'ATP et de fuite de protons (Figure II dans le supplément de données en ligne uniquement). La fuite de protons mitochondriaux est la rentrée de protons de l'espace intermembranaire dans la matrice mitochondriale indépendamment de la synthèse d'ATP, ce qui conduit généralement à une diminution du potentiel de membrane mitochondriale (ΔΨm). 25 Fait intéressant, nous avons constaté que le LPC induisait de manière significative la fuite de protons mais pas la production d'ATP et que la fuite de protons induite par le LPC pouvait être bloquée par l'inhibiteur de MCU, RR (figure 4C). De plus, le LPC n'a pas changé de m dans les HAEC (figure 4D), alors que le découpleur chimique de la membrane mitochondriale, FCCP (carbonyl cyanure-p-trifluorométhoxyphénylhydrazone), a significativement diminué m. Ces résultats suggèrent ce qui suit : premièrement, l'entrée de Ca 2+ mitochondrial induite par le LPC stimule préférentiellement la fuite de protons mais pas la synthèse d'ATP, suggérant que le LPC à faible dose n'est pas un stimulus générant de l'énergie dans les CE. deuxièmement, la fuite de protons induite par LPC est utilisée par EC pour l'induction de O2 réduction de la troisième chaîne de transport d'électrons, les mtROS sont augmentés en réponse à la stimulation LPC et inversés par l'inhibiteur de MCU RR, et quatrièmement, la fuite de protons induite par LPC est équivalente à l'efflux de protons dans l'espace intermembranaire, de sorte que le potentiel de la membrane mitochondriale n'est pas affecté. Pris ensemble, ces résultats indiquent que le LPC induit l'entrée de Ca 2+ mitochondrial, ce qui augmente la synthèse d'ATP – non couplée, mais couplée par fuite de protons, mtROS (Figure 4E).

Figure 4. L'entrée du Ca 2+ mitochondrial médie les espèces réactives de l'oxygène mitochondrial (mtROS) induites par la lysophoshatidylcholine (LPC) en augmentant l'O mitochondrial2 réduction et fuite de protons dans les cellules endothéliales aortiques humaines (HAEC). UNE, LPC induit mtROS via l'entrée mitochondriale de Ca 2+. Après chargement avec MitoSOX (5 mol/L) pendant 10 min, les HAECs ont été traités avec un véhicule témoin, LPC (10 mol/L) ou LPC (10 μmol/L) plus rouge de ruthénium (RR) (10 μmol/L) pendant 1 h, et mtROS ont été mesurés par cytomètre de flux (n = 8). B et C, O mitochondrial induit par LPC2 réduction et fuite de protons via l'entrée mitochondriale de Ca 2+. Après l'ajout du véhicule témoin, LPC (10 mol/L) et LPC (10 μmol/L) plus RR (10 mol/L), le taux de consommation d'oxygène (OCR) a été mesuré toutes les 20 min pendant 1 h. Par la suite, le test de stress XF Mito a été effectué par ajout séquentiel d'oligomycine (1 mol/L), de cyanure de carbonyle-p-trifluorométhoxyphénylhydrazone (FCCP 1 μmol/L) et de roténone (1 mol/L). Courbe d'expérimentation (B) et quantification de 6 paramètres mitochondriaux (C) ont été présentés (n=6). , LPC n'a pas affecté le potentiel de membrane mitochondriale (ΔΨm). After HAECs were treated with vehicle control, LPC (10 μmol/L), or FCCP (1 μmol/L) for 1 h, they were loaded with ΔΨm probe tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM 30 nmol/L) for 20 min, and ΔΨm was measured by flow cytometer (n=4 P values vs control). E, Schematic representation of how LPC induced mtROS. For all panels, values represent mean±SEM, and data are representative of at least 2 independent experiments. MFI indicates mean fluorescence intensity and NS, not significant. *P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001.

Because ROS production in mitochondria is determined by the rates of both mtROS production and disposal, 19 we also investigated the effects of LPC on regulating the expression of mitochondrial antioxidant superoxide dismutase 2 and uncoupling molecules including uncoupling protein 3 and adenine nucleotide translocator. We found that LPC did not regulate the expression of superoxide dismutase 2 and uncoupling protein 3, although there was a trend of adenine nucleotide translocator induction after LPC stimulation (Figure III in the online-only Data Supplement). Adenine nucleotide translocator, also known as the ADP/ATP translocator, exports ATP from the mitochondrial matrix, imports ADP into the matrix, and also mediates both basal and inducible proton conductance. The induction of adenine nucleotide translocator by LPC correlated with the findings that LPC induced mitochondrial proton leak in HAECs (Figure 4C).

MtROS Contribute to LPC-Induced Upregulation of ICAM-1 and Other EC Activation–Related Genes by Regulating Nuclear Binding of AP-1

To determine the downstream effects of LPC-induced mtROS in ECs, we determined the effects of LPC in regulating EC-related gene expressions by performing Human Endothelial Cell Biology polymerase chain reaction (PCR) array profiling. HAECs were stimulated by LPC with or without a specific mtROS scavenger, MitoTEMPO. PCR array was performed afterward to screen for the changes of 84 genes related to EC functions, including vessel tone, angiogenesis, EC activation, and EC injury. We were able to detect the expressions of 57 genes in both control and LPC-treated HAECs. Among these 57 expressed genes, we found that 34 genes were induced >1.2-fold by LPC, and 3 genes were decreased >1.2-fold (Table II in the online-only Data Supplement). More importantly, we found that 14 out of these 34 LPC-induced genes (41.2%), such as ICAM-1, plasminogen activator, tissue, interleukin 6, and matrix metalloproteinase-2, could be blocked by cotreatment of mtROS inhibitor, MitoTEMPO. Importantly, the expression of EC adhesion molecule, ICAM-1, was the most sensitive gene in response to mtROS scavenging (Figure 5A). By using real-time polymerase chain reaction and Western blots, we confirmed that LPC increased ICAM-1 RNA and protein expression, which could be inhibited by MitoTEMPO cotreatment (Figure 5B and 5C). Furthermore, we performed monocyte adhesion assay and showed that LPC-treated HAECs had increased their adhesion to untreated monocytes, which was inhibited by MitoTEMPO (Figure 5D). Taken together, these results demonstrate that mtROS are required for LPC-induced EC activation by regulating the mRNA and protein expressions of certain EC biology–related genes, including ICAM-1.

Figure 5. Lysophoshatidylcholine (LPC)-induced mitochondrial reactive oxygen species (mtROS) are required for intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) upregulation in human aortic endothelial cells (HAECs). UNE, LPC induced ICAM-1 and other endothelial cell (EC) function–related genes via mtROS. HAECs were treated with vehicle control, LPC (10 μmol/L), and LPC (10 μmol/L) plus MitoTEMPO (1 μmol/L) for 6 h, and RNA was collected for Human EC Biology polymerase chain reaction (PCR) array (QIAGEN) analysis. Nonsupervised hierarchical clustering of genes was used to generate heat map to show the genes that were regulated by LPC-induced mtROS. Three samples were pooled in each group. B, Confirmation by real-time PCR. HAECs were treated with LPC (10 μmol/L) with/without MitoTEMPO (1 μmol/L) for 18 h before RNA was collected for real-time PCR analysis. Quantification of ICAM-1 RNA expression normalized by β-actin was shown (n=6). C, Confirmation by Western blot. HAECs were treated with LPC (10 μmol/L) with/without MitoTEMPO (1 μmol/L) for 18 h before proteins were collected for ICAM-1 expression. Representative Western blots from 3 independent experiments were shown. , Effects of mtROS inhibition on LPC-induced monocyte adhesion to HAECs. HAECs were treated with LPC (10 μmol/L) with/without MitoTEMPO (1 μmol/L) for 4 h, after which the adhesion of nonstimulated, fluorescence-labeled human peripheral blood mononuclear cells to stimulated HAECs was quantified (n=5). For all panels, values represent mean±SEM, and data are representative of at least 2 independent experiments. *P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001.

Transcription factor–binding sites of NF-κB and AP-1 have been previously identified in the promoter region of ICAM-1 26 (Figure 6A). In addition, LPC has been shown to increase the nuclear translocation of NF-κB and AP-1 in HUVECs. 18 Thus, we hypothesized that LPC-induced mtROS contribute to the nuclear bindings of proinflammatory transcription factors to the promoter of ICAM-1 in HAECs, which leads to ICAM-1 upregulation. Using electrophoretic mobility shift assay, we showed that LPC potently induced nuclear translocation of AP-1 but weakly induced NF-κB in HAECs (Figure 6B and 6C). In addition, cotreatment of MitoTEMPO almost completely abolished LPC-induced AP-1 but not NF-κB nuclear binding. These results correlated well with our previous finding that AP-1 mediated LPC-induced EC activation. 3 Moreover, by performing a literature search, we found that out of the 14 upregulated genes that were the targets of LPC-induced mtROS (Figure 5A), 12 genes, including ICAM-1, were also previously proposed to be the downstream targets of AP-1 or ROS pathway (Table III in the online-only Data Supplement). Taken together, these results suggest that mtROS contributes to upregulated expressions of ICAM-1 and other genes involved in EC activation by upregulating AP-1–targeted gene transcription.

Figure 6. Mitochondrial reactive oxygen species (mtROS) contribute to lysophosphatidylcholine (LPC)-induced endothelial activation by upregulating nuclear binding of activator protein-1 (AP-1) on the promoter of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1). UNE, Putative AP-1 and nuclear factor-κB (NF-κB)–binding site in the promoter of ICAM-1. B et C, mtROS inhibitor MitoTEMPO blocked LPC-induced nuclear AP-1 binding. HAECs were treated with vehicle or LPC (10 μmol/L) for 1 h with or without MitoTEMPO (1 μmol/L) 1-h preincubation, and nuclear proteins were collected afterward for electrophoretic mobility shift assay (EMSA). Two micrograms of nuclear proteins were used for AP-1 EMSA (B) and 5 μg nuclear proteins were used for NF-κB EMSA (C). Representative images from 3 independent experiments were shown.

MtROS Inhibition Suppresses EC Activation and Monocyte Recruitment Into the Aorta During Early Atherosclerosis In Vivo

To examine whether mtROS contribute to EC activation during early atherosclerosis in vivo, we implanted the ALZET osmotic minipumps containing either saline control or MitoTEMPO (1500 μg/kg/d) subcutaneously into 8-week-old ApoE −/− mice before they were put on a high-fat diet for another 3 weeks. We determined their EC activation status afterward by examining leukocyte rolling and adhesion to the endothelium in cremaster muscle vessels using intravital microscopy. We found that MitoTEMPO significantly inhibited leukocyte rolling and adhesion to the endothelium on the postcapillary venule wall (Figure 7A and 7B). Of note, there was no difference in the venule diameters between the 2 groups (Figure 7C), suggesting that MitoTEMPO did not significantly change the venule diameters. In addition, we did not detect any leukocyte rolling or adhesion in the arterioles of the cremaster muscle (data not shown) because of the rapid movement of blood cells within these vessels, as shown previously. 27 Similarly, the high blood flow speeds and high pulse vibrations in middle and aortic arteries make the current technology of intravital microscope unsuitable in determining in vivo leukocyte rolling and adhesion to the endothelium in aortic arteries. 28 To determine whether MitoTEMPO could decrease the recruitment of monocytes into the aortas of ApoE −/− mice, we prepared aortic single cell suspensions from these mice and performed flow cytometric analysis with fluorescence-conjugated antibodies staining for Indo-1 (dead cell), CD45 (leukocyte), CD11b (monocyte), and Ly6c (inflammatory or resident monocyte), as we reported previously 6 (Figure 7D). The results showed that MitoTEMPO significantly decreased the recruitment of CD45 + CD11b + total monocytes as well as CD45 + CD11b + Ly6c + inflammatory monocytes into the aortas of ApoE −/− mice (Figure 7E and 7F), whereas MitoTEMPO did not significantly affect the recruitment of CD45 + CD11b + Ly6c − resident monocytes (Figure 7G). We further determined whether aortic monocyte composition changes resulted from the global changes in the peripheral blood monocyte composition. The results showed that MitoTEMPO did not significantly affect the populations of CD45 + CD11b + monocytes and CD45 + CD11b + Ly6C + monocytes in the blood (Figure IV in the online-only Data Supplement). Taken together, these results demonstrate that MitoTEMPO treatment suppresses aortic EC activation in ApoE −/− mice but do not rule out the potential beneficial effects of MitoTEMPO on lesional macrophages.

Figure 7. MitoTEMPO treatment decreases in vivo endothelial activation during early atherosclerosis. At 8 wk of age, minipumps containing saline or MitoTEMPO (1500 μg/kg/d) were implanted in ApoE −/− mice before they were fed with a high-fat diet for 3 wk. Afterward, intravital microscopy (A–C, n=4–6 mice per group, 3 vein vessels per mouse were recorded) and flow cytometry analyses (g, n=7–9 mice per group) were performed to determine the endothelial activation status in vivo. UNE, MitoTEMPO treatment decreased leukocyte rolling to endothelium. Number of leukocytes that rolled past an imaginary line that was perpendicular to the vessels during a 1-min period observed. B, MitoTEMPO decreased leukocyte adhesion to endothelium. Number of cells adhered to the endothelium for 1 min, 100-µm length observed. C, MitoTEMPO did not change mean vessel diameter of venule. , Gating strategy of aortic monocyte by flow cytometry. Total monocytes were gated as Indo-1 − CD45 + CD11b + , and inflammatory monocytes were gated as Indo-1 − CD45 + CD11b + Ly6c + . E, MitoTEMPO decreased aortic monocyte infiltration. Percentages of CD11b + monocytes (Gate A+B in C) in total aortic leukocyte cell population (Indo-1 − CD45 + ) were shown in each group. F, MitoTEMPO decreased aortic inflammatory monocyte infiltration. Percentages of CD11b + Ly6c + inflammatory monocytes (Gate B in C) in total aortic leukocyte cell population were shown in each group. g, MitoTEMPO did not significantly affect aortic resident monocyte infiltration. Percentages of CD11b + Ly6c − resident monocytes (Gate A in C) in total aortic leukocyte cell population were shown in each group. For all panels, values represent mean±SEM. NS indicates not significant. *P<0.05 ***P<0.001.

Discussion

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease that is a major pathogenic process underlying the development of coronary heart disease, stroke, and peripheral vascular disease. In spite of recent progress, novel anti-inflammatory strategies are still in urgent need for prevention and treatment of atherosclerotic CVD. 29 LPCs are a group of endogenous proinflammatory lipids considered to be a causative factor for atherosclerosis. For this reason, inhibitors of sPLA2 and Lp-PLA2, the key enzymes responsible for the generation of LPC, have been developed in the hope of developing novel anti-inflammatory therapies against atherosclerosis. 29 The beneficial effects of sPLA2 inhibitor (Varespladib) and Lp-PLA2 inhibitor (Darapladib) have been demonstrated in atherosclerotic animal models 13,30 and human phase 2 clinical trials. 31,32 However, 3 recent phase 3 clinical trials failed to show their therapeutic efficacy. 33–35 One possibility that may explain these failures is related to the fact that LPC also plays important physiological roles, such as stimulating insulin release from pancreatic β cells 36 and transporting essential fatty acids. 37 For this reason, targeting the pathogenic downstream effects of LPC, instead of blocking the production of LPC itself, may lead to the development of better therapeutics. Along this line, our approaches using metabolomics and transcriptomics in this study demonstrated that 7 out of 8 detected LPC species were induced in the aorta of early atherosclerotic mice, presumably because of increased expression of PLA2 in the aorta. More importantly, we found that proatherogenic lipid, LPC, via a mtROS-mediated mechanism, induced EC activation, which is an initiation step of atherogenesis. Therefore, blocking excessive mtROS production downstream of LPC might protect arteries against atherogenesis. This idea is supported by previous findings reporting that various other vascular stressors, including oxidized low-density lipoprotein, glucose, angiotensin II, hypoxia, and proinflammatory cytokines, also induced mtROS production in ECs. 19 In addition, pharmacological drugs, such as statins, metformin, resveratrol, and cannabidiol, could inhibit glucose-induced mtROS production in ECs. 19 Moreover, it has been shown previously that ApoE −/− mice deficient in superoxide dismutase 2 gene, which scavenges mtROS, displayed accelerated atherogenesis. 38 EC-specific overexpression of thioredoxin 2, another mitochondrial antioxidant enzyme, improved endothelial function and reduced atherosclerosis development in ApoE −/− mice. 39 Collectively, we and others have demonstrated a critical proatherogenic role for mtROS in EC activation during early atherosclerosis. Notably, LPC could also activate macrophages besides promoting EC activation 11 and diminishing mtROS in macrophages reduced lesion development in atherosclerotic mice. 40 Further study is needed to determine the role of LPC-induced mtROS in lesional macrophages during the development of atherosclerosis.

Previous studies have reported that LPC could induce nicotinamide adenine dinucleotide oxidase (mitochondrial)/NADPH oxidase (cytosolic)–related ROS in ECs. 41 In addition, it was found that LPC-induced ROS was more prominent in mitochondria and much less abundant in cytosol. 24 It has also been shown that mitochondria, rather than NADPH oxidase, was the major source of inflammatory ROS in monocytes. 20 Along the same line, we identified that LPC-induced mtROS production was independent of NADPH oxidase in ECs.

Even when there is ample oxygen, ECs rely heavily on glycolysis for their ATP demand, yet ECs contain functional mitochondria and little is known about the role of mitochondria in endothelium. 42 By using the novel, state-of-art mitochondrial Seahorse XF96 analyzer for assaying mitochondrial functions, we demonstrate that when ECs are activated, LPC induces mtROS by accelerating electron transport chain and proton efflux, which is uncoupled from ATP synthesis by simultaneously accelerating proton leak. Thus, we propose that one of the major functions of mitochondrial proton leak in ECs may be fine-tuning mtROS generation for cell-signaling purpose, such as endothelial activation. By doing this, in response to proatherogenic/proinflammatory stimuli including LPC, ECs could upregulate mtROS production without affecting ATP level and EC survival (Figure 8). This hypothesis is supported by the findings that mtROS were involved in regulating important physiological endothelial functions, such as hypoxia adaptation and angiogenesis effects, and in activating proinflammatory signaling pathways in response to various vascular stressors. 19

Figure 8. A new working model. La gauche, during early atherosclerosis, lysophosphatidylcholines (LPCs) are induced in the aorta, presumably because of increased expression of Pla2g4c and Pla2g7. LPC then induces cytosolic Ca 2+ , which then enters into the mitochondria of aortic endothelial cells. LPC-induced mitochondrial Ca 2+ then stimulates mitochondrial electron transport chain and proton leak without affecting ATP synthesis and mitochondrial membrane potential. As a result, mitochondrial reactive oxygen species (mtROS) are specifically induced without causing mitochondria injury. LPC-induced mtROS could then be released to the cytosol, where they regulate nuclear binding of activator protein-1 (AP-1) to the promoter of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and other genes, contributing to endothelial activation. Anterograde signaling describes signal transduction from cytosol to mitochondria, and retrograde signaling describes signal transduction from mitochondria to cytosol and nucleus. Droit, LPC induces ATP-uncoupled, but proton leak-coupled, mtROS. ΔΨm indicates mitochondrial membrane potential.

Although controversies exist regarding what the real LPC receptor(s) is in the cell, LPC has been shown to stimulate cytosolic Ca 2+ in different cell types. 11 In addition, it has been shown that LPC induced cellular Ca 2+ uptake from an extracellular source via transient receptor potential vanilloid 2 channel. 43 Interestingly, RR, which was used in this study for inhibiting MCU for mitochondrial Ca 2+ entry, could also potently inhibit transient receptor potential vanilloid 2 for cytosolic Ca 2+ entry. Future studies are needed to determine the roles of MCU and transient receptor potential vanilloid 2 in LPC-induced mtROS production.

To summarize (Figure 8), our study suggests that during early atherosclerosis, aortic LPCs are induced, presumably because of increased enzyme expression of Pla2g4c and Pla2g7. LPC then induces Ca 2+ entry from cytosol to mitochondria, where it drives ATP synthesis–uncoupled, but proton leak-coupled, mtROS. LPC-induced mtROS then regulate nuclear binding of AP-1 to the promoters of ICAM-1 and other EC activation–related genes, contributing to endothelial activation, monocyte adhesion to ECs, and monocyte recruitment into aorta. These findings are important, as they have improved our understanding of the molecular mechanisms of hyperlipidemia stimuli–induced EC activation in early atherogenesis. Such findings may, in turn, lead to the development of novel therapies, such as mitochondria-targeting antioxidant, which might greatly improve the outcome of CVDs.