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Activité de la glucokinase


D'après Solomon et al, 2013 ACC Biologie synthétique et de cette vidéo :

Ici, il y a 2 réactions concurrentes pour le glucose - une avec glk comme enzyme et l'autre avec gdh comme enzyme.

Dans le graphique, l'axe des y est le rendement en gluconate et l'axe des x est l'activité de la glk. Logiquement, à mesure que l'activité glk augmente, le rendement en gluconate devrait diminuer.

C'est le cas pour la majeure partie du graphique. Mais pourquoi y a-t-il initialement une augmentation de la production de gluconate (lorsque l'activité de la glk se situe entre 0,2 et 0,27 ) ?


Tout d'abord, voyons ce que ces gars veulent accomplir : ils veulent utiliser des bactéries pour fabriquer certains produits. Pour ce faire, ils souhaitent exploiter le métabolisme bactérien à des étapes où aucune voie alternative n'est disponible. L'une de ces étapes est la première étape de la glycolyse, lorsque le glucose est phosphorylé en glucose-6-phosphate (G6P). Chez les bactéries, la phosphorylation se fait lors de l'importation du glucose dans la cellule par le "système phosphoénolpyruvate (PEP):carbohydrate phosphotransferase", qui utilise le phosphorénolpyruvate comme source de phosphate. Cela présente l'inconvénient qu'il n'y a presque pas de glucose libre à l'intérieur de la cellule, mais principalement du G6P.

Pour surmonter ce problème, le groupe a exprimé des transporteurs alternatifs (qui transportent le glucose dans la cellule) et la glucokinase (Glk) pour permettre aux cellules de survivre. Cette étape a découplé l'importation et la phosphorylation du glucose et a abouti à du glucose libre à l'intérieur de la cellule. Ce glucose libre peut maintenant être utilisé par différents procédés. Elle permet également la glycolyse, puisque la Glk phosphoryle le glucose qui entre alors dans la voie de la glycolyse. Le Glk a été placé sous différents promoteurs pour fabriquer différents mutants afin de tester comment l'expression différente de Glk affecte la viabilité des cellules.

Pour introduire une autre enzyme qui métabolise également le glucose, ils ont utilisé la glucose déshydrogénase (Gdh) qui a été exprimée à partir d'un plasmide avec un puissant promoteur inductible par IPTG. Ils ont ensuite utilisé différentes concentrations d'IPTG pour tester l'effet sur la production de gluconate et la viabilité cellulaire (je n'entrerai pas dans le détail).

La figure ci-dessus est la figure 5 de l'article et montre l'effet des trois concentrations différentes d'IPTG utilisées pour induire l'expression de la Gdh. Pour 10 et 25 uM d'IPTG, le rendement en gluconate diminue, plus l'activité Glk augmente. Seule la petite activité montre un rendement inférieur. C'est complètement différent pour la concentration la plus élevée, mais ici les cellules sont probablement perturbées par l'expression élevée du Gdh (qui consomme également beaucoup d'énergie).

Dans l'article, ils ne donnent aucune explication ou au moins discutent du comportement du rendement en gluconate à la plus petite activité Glk (j'aimerais lire les commentaires des critiques à ce sujet). D'après les données, je m'attendrais à une production plus élevée. Il est possible que la production d'énergie plus faible (de faibles quantités de G6P signifient peu de glycolyse) ait des effets secondaires négatifs sur les cellules. Il est également possible que la Gdh soit inhibée à des activités Glk inférieures par d'autres substances dans la cellule. L'activité Gdh est par exemple inhibée par des concentrations plus élevées de nucléotides triphosphates (ATP, etc.), voir ici. Étant donné que Glk a besoin d'ATP comme cofacteur, il serait possible que la concentration d'ATP à des activités Glk inférieures ait un effet négatif sur l'activité Gdh (ma propre spéculation).

Ou c'est simplement un artefact de l'expérience. Cela a quelques points qui peuvent être critiqués (j'aimerais aussi voir les commentaires des critiques ici). Tout d'abord, les barres d'erreur sont assez grandes, donc cela peut aussi être quelque peu différent. Dans le texte, ils mentionnent que les données ont été acquises par

au moins 2 cultures parallèles dans une expérience représentative

Je m'attendrais à plus de répétitions (au moins trois expériences indépendantes), ce qui rendrait les données plus fiables. Ensuite (et ce point est beaucoup plus important) ils ne peuvent pas mesurer l'activité de Glk et Gdh dans la même culture en raison de restrictions dans le système de détection. Les mesures d'activité de Glk utilisent un système couplé qui, à la fin, mesure le changement de concentration en NADH, tandis que Gdh utilise le NADPH comme cofacteur. Les deux versions ne peuvent pas être différenciées en mesurant un spectre, de sorte que les mesures d'activité de Glk ne peuvent avoir lieu que dans des cellules non transfectées. Étant donné que l'expression change les conditions dans la cellule (et nous ne savons pas comment), je m'attendrais à au moins une discussion à ce sujet, mais il manque.


Contrôle à court terme de l'activité glucokinase : rôle d'une protéine régulatrice

La glucokinase est l'une des quatre hexokinases présentes dans les tissus des mammifères. Il est exprimé dans deux types cellulaires qui doivent répondre aux changements de la concentration de glucose dans le sang, la cellule parenchymateuse du foie et les cellules β des îlots pancréatiques. Les premiers sont responsables du métabolisme et du stockage d'une partie importante du glucose ingéré, tandis que les seconds sécrètent de l'insuline en réponse à une augmentation de la glycémie. Une caractéristique majeure de la glucokinase est qu'elle a une affinité relativement faible pour le glucose et qu'elle présente une coopérativité positive pour ce substrat, malgré le fait qu'il s'agisse d'une enzyme monométique. De plus, contrairement aux autres hexokinases, elle n'est pas inhibée par des concentrations micromolaires (physiologiques) de glucose 6-phosphate mais par une protéine régulatrice qui transduit l'effet du fructose 6-phosphate et du fructose 1-phosphate. Le but de cette revue est de décrire ces aspects de la régulation de la glucokinase. — Van Schaftingen, E., Detheux, M., Veiga da Cunha, M. Contrôle à court terme du rôle d'activité de la glucokinase d'une protéine régulatrice. FASEB J. 8: 414-419 1994.


Article PERSPECTIVE

  • 1 Programme de sciences biomédicales translationnelles, Graduate College, Ohio University, Athens, OH, États-Unis
  • 2 Diabetes Institute, Heritage College of Osteopathic Medicine, Ohio University, Athens OH, États-Unis
  • 3 Département des sciences biomédicales, Heritage College of Osteopathic Medicine, Ohio University, Athens, OH, États-Unis

Les cellules bêta pancréatiques sont les seules cellules du corps capables de synthétiser et de sécréter de l'insuline. Grâce au processus de sécrétion d'insuline stimulée par le glucose, les cellules bêta libèrent de l'insuline dans la circulation, stimulant l'absorption de glucose dépendante de GLUT4 dans les tissus périphériques. L'insuline est normalement sécrétée sous forme d'impulsions qui favorisent la signalisation au niveau du foie. Bien avant que le diabète de type 2 ne soit diagnostiqué, les cellules bêta deviennent hypersensibles au glucose, provoquant une altération de la pulsatilité et une surstimulation des taux de glucose à jeun. L'hypersécrétion d'insuline qui en résulte peut entraîner une mauvaise signalisation et clairance de l'insuline au niveau du foie, entraînant une hyperinsulinémie et une résistance à l'insuline. Une suractivité continue peut éventuellement conduire à l'épuisement et à l'échec des cellules bêta, moment auquel le diabète de type 2 commence. Pour prévenir ou inverser les effets négatifs de la surstimulation, l'activité des cellules bêta peut être réduite. Des études cliniques ont révélé le potentiel du repos des cellules bêta pour inverser les nouveaux cas de diabète, mais les traitements manquent d'avantages durables. Dans cette perspective, nous proposons une intervention qui réduit l'activité hyperactive de la glucokinase dans la cellule bêta. La glucokinase est connue comme le capteur de glucose de la cellule bêta en raison de son contrôle élevé sur la sécrétion d'insuline. Par conséquent, l'hyperactivité glycolytique peut être responsable d'une hyperinsulinémie au début de la maladie et peut être réduite pour restaurer un couplage stimulus-sécrétion normal. Nous avons déjà signalé que la réduction de l'activité de la glucokinase dans les îlots de souris prédiabétiques peut restaurer la pulsatilité et améliorer la sécrétion d'insuline. Sur la base de cette découverte contre-intuitive, nous passons en revue l'importance de la sécrétion d'insuline pulsatile et soulignons comment la normalisation de la détection du glucose dans la cellule bêta pendant l'hyperinsulinémie prédiabétique peut restaurer la pulsatilité et améliorer l'homéostasie du glucose.


Résultats

La glucokinase interagit avec l'arginine dans les cellules

Pour évaluer dans quelle mesure l'arginine prend en charge GSIS, les cellules β NIT-1 ont été pré-cultivées dans un milieu appauvri en arginine pendant 30 min. Ensuite, du glucose a été ajouté au milieu et la sécrétion d'insuline a été analysée (Fig. 1a). L'épuisement de l'arginine a émoussé de manière significative le GSIS des cellules NIT-1. Fait intéressant, l'administration de G6P a induit une sécrétion d'insuline dose-dépendante avec et sans déplétion en arginine (Fig. 1b). L'augmentation de G6P intracellulaire par l'administration de G6P a été confirmée par spectrométrie de masse (Fig. 1a, b). Ainsi, l'arginine est nécessaire à la sécrétion d'insuline en réponse au glucose mais pas à la G6P, ce qui indique que l'arginine peut jouer un rôle dans la production de G6P par la GCK dans les cellules .

une, b Le glucose-6-phosphate (G6P) a permis de réduire la sécrétion d'insuline en l'absence de L-arginine dans les cellules NIT-1. En présence de L-sécrétion d'insuline induite par l'arginine, le glucose et le G6P. En l'absence de L-arginine, uniquement G6P (cercle vide dans b), mais pas le glucose (cercle vide dans une) induit la sécrétion d'insuline. Les données représentent la moyenne ± S.E. (m = 4). c Préparation de nanobilles magnétiques immobilisées par l'arginine 18 . Les groupes époxy sur les billes FG ont été aminolysés par NH4OH et couplé à EGDE. Les groupes époxy ont été ré-aminolysés par NH4OH. Les billes ont ensuite été couplées à des groupes carboxyle de L-arginine dans du DMF contenant de l'EDC, de la triméthylamine et du DMAP (Fig. 1 supplémentaire). La glucokinase se lie à L-arginine et glucose directement. La glucokinase produite dans la cellule HEK293 transfectée avec le vecteur d'expression de la glucokinase-HA a été mélangée avec de l'arginine ou des billes immobilisées avec du glucose en utilisant des billes sans arginine ni glucose comme contrôle négatif. Les deux L-arginine et glucose se lient à la glucokinase-HA. e La glucokinase-HA liée au glucose immobilisé a été éluée par L-arginine et glucose. Glucokinase-HA liée à L-les billes d'arginine ont été éluées par L-arginine mais pas par le glucose. F La glucokinase co-localise avec l'insuline dans le granule de sécrétion et non dans le réticulum endoplasmique (RE) et l'appareil de Golgi dans les cellules NIT-1. Glucokinase (vert), insuline (magenta), ER (magenta, KDEL), cis-Golgi (magenta, GM130) et le nucléole (bleu) ont été colorés et des images fusionnées ont été affichées en bas. La glucokinase a montré une colocalisation élevée avec l'insuline et moins colocalisée avec le RE et le réseau de Golgi indiquant que la glucokinase se localise principalement dans les vésicules sécrétoires. Barre d'échelle 20 um.

Nous avons précédemment démontré que PFK1, PFK2 et HXK1 dans l'extrait cellulaire HeLa étaient des protéines de liaison à l'arginine en utilisant la technologie des nanobilles magnétiques immobilisées à l'arginine (Fig. 1c, Fig. 1 supplémentaire et réf. 18). Considérant que PFK1/2 et HXK1 sont des enzymes de la glycolyse 22,23, l'arginine pourrait servir de régulateur clé de la glycolyse. Ainsi, nous avons émis l'hypothèse que l'arginine se lie également à la GCK et fonctionne comme un activateur de la GCK dans les cellules . Lorsqu'il est testé à l'aide de nanobilles magnétiques immobilisées au glucose ou à l'arginine (Fig. 1c, Fig. 1 supplémentaire et réf. 18), GCK se lie à la fois au glucose et à l'arginine (Fig. 1d). Ensuite, nous avons testé si le glucose et l'arginine sont en compétition pour la liaison de GCK aux nanobilles magnétiques immobilisées (Fig. 1e). La GCK liée au glucose immobilisé a été éluée par le glucose et l'arginine, bien que la liaison de la GCK à l'arginine immobilisée ait été moins concurrencée par le glucose (Fig. 1e) indiquant une liaison plus forte de la GCK à l'arginine qu'au glucose. Ensuite, la localisation intracellulaire de GCK a été analysée par immunohistochimie dans des cellules NIT-1 (Fig. 1f). Signal GCK a été principalement fusionné avec l'insuline dans les vésicules sécrétoires et partiellement avec la proinsuline dans le RE en accord avec le rapport précédent 24,25.

L-L'arginine stimule la production de G6P et la sécrétion d'insuline

La figure 1 indique collectivement que l'arginine favorise GSIS par interaction directe avec GCK. Dans une étape suivante, nous avons analysé si l'arginine altère l'activité GCK dans les cellules β NIT-1. Administration de glucose ou L-arginine aux cellules NIT-1 a augmenté G6P mais stéréoisomère -arginine n'augmente pas la G6P (Fig. 2a). Il est intéressant de noter que l'induction de la sécrétion d'insuline, telle que la différence de sécrétion d'insuline à 0,5–1,5 min à 7 mmol/l de glucose, est plus rapide après L-administration d'arginine par rapport à -arginine (Fig. 2b). L-Sécrétion d'insuline stimulée par l'arginine plus forte que -arginine en présence de glucose mais pas en l'absence de glucose (pas d'arginine, et Fig. 2c, d). GCK lié à L-arginine a été éluée par L-arginine mais pas par -arginine indiquant que seulement L-arginine interagit avec GCK (Fig. 2e). Pris ensemble, L-arginine se lie stéréospécifiquement à la GCK, augmente la teneur en G6P et favorise la sécrétion d'insuline. Il est à noter que la sécrétion d'insuline indépendante du glucose peut être stimulée à la fois par L- et -arginine, qui est probablement due à UGGT1, une autre protéine de liaison à l'arginine qui se lie à la fois L- et -arginine (Fig. 2a–d supplémentaire) 26 .

une L-L'arginine (2 mmol/l) et le glucose (7 mmol/l) ont stimulé la production de G6P dans les cellules β NIT-1, mais stéréoisomère -arginine (2 mmol/l) n'a pas induit la production de G6P. Les données représentent la moyenne ± S.E. (m = 6). b Une mmol/l L-la sécrétion d'insuline induite par l'arginine est légèrement supérieure à un mmol/l -arginine le fait dans les cellules NIT-1. L- ou -arginine ont été administrés à L-cellules NIT-1 appauvries en arginine. Les données représentent la moyenne ± S.E. (m = 3). *p < 0.05 (m = 6). c En présence de glucose, L-sécrétion d'insuline stimulée par l'arginine plus de -arginine. En l'absence de glucose, les deux L- et -arginine a stimulé la sécrétion d'insuline de manière similaire. Les données représentent la moyenne ± S.E. (m = 3). *p < 0.05 (m = 6). Une mmol/l L-arginine augmente la sécrétion d'insuline glucose-dépendante. Les données représentent la moyenne ± S.E. (m = 3). *p < 0.05 (m = 6). e Glucokinase liée à L-arginine mais ne s'est pas lié à -arginine. Il est à noter que UGGT1 se lie à L- et -arginine (Fig. 2a supplémentaire et réf. 26).

Trois résidus glutamate sont impliqués dans la signalisation de l'arginine

Pour identifier les résidus dans GCK qui sont nécessaires pour se lier à L-sécrétion d'arginine et d'insuline stimulée par L-arginine, cinq mutants de GCK (Y214C, E256K, A456V, E157T et E443Δ) ont été préparés et analysés (Fig. 3 et Fig. 3 supplémentaire). Les résidus ont été choisis sur la base des mutations du patient MODY2 11,26,27,28,29,30 et de notre article précédent montrant l'interaction de l'arginine acide aminé cationique avec le résidu acide glutamate 26. Type sauvage et E443Δ GCK lié L-arginine fortement, cependant, se liant à L-arginine a été à peine observée pour les mutants E256K et E157T GCK (Fig. 3a et Fig. 3a, b). Lorsque la sécrétion d'insuline en réponse à L-arginine a été comparée pour les cinq mutants, la sécrétion d'insuline était altérée pour trois mutants GCK, à savoir E256K, A456V et E443Δ (Fig. 3b). Ainsi, le résidu E256 semble critique à la fois pour L-la liaison à l'arginine et L-sécrétion d'insuline induite par l'arginine. Par contre, le résidu E443 est nécessaire pour L-sécrétion d'insuline induite par l'arginine mais pas pour la liaison de L-arginine à GCK. Bien que E443Δ n'ait pas été suffisant pour empêcher la liaison de L-arginine à GCK, nous avons noté qu'il existe un groupe de résidus E (E442 et E443) dans la région C-terminale de GCK26. En utilisant les données de structure GCK (réf. 31, PDB-1V4S et 1V4T), nous avons prédit la position tridimensionnelle de ces trois résidus E (E256, E442 et E443) sur la protéine GCK (Fig. 3c, d) et trouvé que ces résidus créent une structure en forme de grille qui peut servir de poche de liaison pour L-arginine. Par conséquent, nous avons créé un triple mutant E256/442/443R (Fig. 3e-g) et avons constaté que ce mutant GCK présentait une altération marquée de la liaison à l'arginine (Fig. 3e), l'augmentation de G6P par L-arginine (Fig. 3f) et sécrétion d'insuline induite par l'arginine (Fig. 3g). Pris ensemble, les résidus E256, E442 et E443 de GCK sont impliqués dans L-la liaison à l'arginine et la sécrétion d'insuline.

une Les mutants de glucokinase E256K, E440/442/3R et E442* ont montré une liaison réduite à L-billes immobilisées par de l'arginine lorsque plusieurs protéines de glucokinase ont été analysées (Fig. 2b supplémentaire). b Les cellules NIT-1 exprimant les mutants E256K, E443Δ et A456V-glucokinase ont montré une sécrétion d'insuline réduite en réponse à L-arginine par rapport à ceux exprimant la glucokinase WT. Les données représentent la moyenne ± S.E. (m = 3, une et b). c, Trois résidus glutamate de E256, E442 et E443 de la glucokinase sont proches et forment une structure en forme de porte pour la liaison de L-arginine sur la base des données structurelles de la protéine glucokinase (PDB-1V4S 31 ). Liaison à l'arginine altérée (e), production G6P (F) et la sécrétion d'insuline (g) dans des cellules NIT-1 exprimant la glucokinase mutante E256/442/443R. Les données représentent la moyenne ± S.E. (m = 3). *p < 0.05 (m = 6, F et g).

Diminution de la sécrétion d'insuline chez les patients E442* MODY2

Nous avons examiné 489 patients MODY japonais pour les variantes GCK qui impliquent E442 et E443 et identifié un sujet avec la variante GCK E442* (Figs. 3a, S4a et réf. 27,28,29 supplémentaires). Lorsqu'un sujet avec la variante GCK E442 * (Fig. 4a, b et Fig. 4b supplémentaire) et deux autres sujets sains ont été testés, le sujet E442 * présentait une valeur inférieure pour l'évaluation du modèle homéostatique de la cellule (Fig. 4a) . Le sujet avec le variant GCK E442* présentait une sécrétion d'insuline plus faible pendant le jeûne. Dans un test de tolérance à l'arginine, le variant E442* a montré un rapport peptide C/glucose inférieur (réf. 32 et figure 4b), indiquant une altération de la sécrétion d'insuline en réponse à l'arginine. Lorsqu'ils sont exprimés dans des cellules NIT-1, E442* et les mutants similaires E442/443R GCK ont montré une sécrétion réduite d'insuline induite par l'arginine (Fig. 4c), des niveaux de GSIS (Fig. 4c supplémentaire) et de G6P en présence d'arginine (Fig. 4d). Nos données du sujet GCK E442* et des mutants similaires étudiés dans les cellules NIT-1 suggèrent que L-arginine module la sécrétion d'insuline GCK-dépendante, ce qui n'était pas apparent dans un groupe de mutations étudiées par l'étude de Pueyo 16 .

Évaluation du modèle homéostatique des cellules (HOMAβ, une) et le rapport peptide C/glucose (b) ont été réduites chez un sujet porteur de la mutation E442* de la glucokinase par rapport à deux témoins avec la glucokinase WT. Un HOMAβ inférieur indique une capacité réduite à sécréter de l'insuline après un état de jeûne (une). Le rapport C-peptide/glucose est l'un des marqueurs démontrant l'efficacité de la sécrétion d'insuline 32 (b). c L- La sécrétion d'insuline induite par l'arginine a été réduite dans les cellules NIT-1 qui exprimaient la glucokinase mutante E442* et E442/3R par transfection avec pCDNA-GCK-HA et des vecteurs d'expression d'insuline. Production G6P en réponse à L-arginine a été réduite dans les cellules NIT-1 qui exprimaient la glucokinase mutante E442* et E442/3R par transfection avec des vecteurs pCDNA-GCK-HA et insuline. Les données représentent la moyenne ± S.E. (m = 3). *p < 0.05 (m = 6).

L'arginine protège la GCK de l'ubiquitination et de la dégradation

Ensuite, nous avons abordé un mécanisme par lequel la liaison de l'arginine à la GCK augmente les niveaux de G6P dans les cellules . Nous avons noté que GCK a le motif d'interaction avec l'ubiquitine (UIM 33,34) au C-terminal 35,36 près du résidu E442. Nous n'avons observé aucune différence dans les protéines ubiquitinées totales dans les lysats en présence ou en l'absence d'arginine lorsque les protéines ubiquitinées ont été détectées en utilisant le vecteur d'expression ubiquitine-Myc (Fig. 5a). Cependant, la GCK ubiquitinée n'a été observée qu'après déplétion en arginine (Fig. 5a) indiquant que l'arginine empêche l'ubiquitination de la GCK. Étant donné que le taux d'arginine dans le sang diminue pendant le (long) jeûne, la libération d'arginine de la GCK peut augmenter la protéolyse de la GCK à médiation par l'ubiquitine lorsque la disponibilité du glucose et les besoins en sécrétion d'insuline sont réduits pendant le jeûne. Un traitement de douze heures des cellules NIT-1 par l'inhibiteur de protéasome MG132 a augmenté le niveau de WT GCK d'environ dix fois mais n'a pas modifié le niveau de protéine mutante E256K (figure 5b). Sécrétion d'insuline induite par L-arginine a également augmenté en présence de MG132 dans les cellules NIT-1 exprimant WT GCK mais pas celles exprimant E256K (Fig. 5a supplémentaire). Les données ont indiqué que

90 % de la GCK WT est dégradée en 24 h, ce qui soutient l'hypothèse que la déplétion en arginine accélère la dégradation de la GCK par ubiquitination. Cependant, il semble que la présence de faibles niveaux de GCK soit suffisante pour augmenter la sécrétion d'insuline en réponse à L-arginine indiquant que l'interaction directe entre L-arginine et GCK augmente de manière aiguë le GSIS (Fig. 5b, c supplémentaire). Ensuite, pour déterminer comment l'ubiquitination de la GCK est accélérée en l'absence d'arginine, nous avons testé le rôle de cereblon, la seule ubiquitine ligase E3 inductible par le médicament (thalidomide et ses analogues, médicaments immunomodulateurs imide) parmi plus de 500 à 1000 E3 ubiquitine ligases chez l'homme 19,20,21 . Dans les cellules HEK293 dans lesquelles le céréblon a été assommé, nous avons constaté que le céréblon est indispensable pour observer l'ubiquitination de la GCK (Fig. 5c et Fig. 5d supplémentaire). En utilisant l'analyse de mutagenèse, deux résidus lysine de K458 et K459 sont responsables de l'ubiquitination céréblon-dépendante qui est réduite par l'arginine (Fig. 5d). La mutation K458/459R a empêché l'ubiquitination en l'absence d'arginine, indiquant que ces résidus sont responsables de l'ubiquitination dépendante de l'arginine sur 26 résidus de lysine dans GCK (Fig. 5d). Lorsque les cellules HEK293 ont été transfectées avec des vecteurs d'expression GCK, ubiquitine et cereblon, l'expression de GCK déterminée par Western blot et le contenu de G6P ont diminué sur 4 h sous l'épuisement de l'arginine dans les cellules exprimant WT tandis que les deux niveaux restaient inchangés dans les cellules exprimant E256K (Fig. 5e , F). En outre, L-arginine a été montré pour réduire l'interaction entre GCK et céréblon (Fig. 5g). De plus, L-arginine stimule l'activité GCK in vitro (Fig. 5h et Fig. 5e supplémentaire). Dans l'ensemble, il semble que le céréblon se lie à la GCK en l'absence d'arginine et ubiquitine la GCK, tandis que l'administration d'arginine dissocie la GCK du céréblon et favorise la phosphorylation du glucose par la GCK pour induire la sécrétion d'insuline (Fig. 5f supplémentaire).

une L'arginine inhibe l'ubiquitination de la glucokinase. Les cellules NIT-1 ont été transfectées avec le vecteur d'expression ubiquitine-Myc et soumises à une déplétion en arginine. Les extraits de lysat, de contrôle et de glucokinase IPed ont été visualisés avec un anticorps anti-Myc. b Une incubation de vingt-quatre heures avec l'inhibiteur de protéasome MG132 a empêché la réduction de la glucokinase WT, mais a eu peu d'effet sur l'expression et le niveau d'ubiquitination de la glucokinase mutante E256K. c L'ubiquitination de la glucokinase-HA est observée dans les cellules WT HEK293, mais pas dans les cellules cereblon KO HEK293. La réduction du cereblon dans les cellules cereblon KO est illustrée sur la figure supplémentaire 5a. Les résidus K458 et K459 de la glucokinase sont nécessaires pour l'ubiquitination réductible à l'arginine et dépendante du cereblon en l'absence d'arginine. Des cellules NIT-1 transfectées avec des vecteurs d'expression de glucokinase WT, E442* ou K458/459R ainsi que des vecteurs d'expression cereblon-FLAG et ubiquitine-Myc ont été incubées dans un milieu appauvri en arginine. La déplétion en arginine réduit la protéine glucokinase WT (e) et l'activité (F). Les données représentent la moyenne ± S.E. (m = 3). *p < 0.05 (m = 6). g L'arginine inhibe l'interaction de la glucokinase et du cereblon. h L'arginine augmente la production de G6P par la protéine glucokinase recombinante dans un système acellulaire. (m = 6).


RÉSULTATS

La GK marquée par GFP est catalytiquement active lorsqu'elle est exprimée en MIN6.

Transfection transitoire de MIN6 avec GK marqué avec GFP soit au NH2- ou COOH-terminal était associé à une immunoréactivité à la GK à 62-64 kDa, comme prévu, et à une augmentation de 7 à 10 fois de l'activité GK, confirmant que la GK marquée par la GFP est catalytiquement active (Fig. 1UNE). Parce que la microscopie à fluorescence a montré une grande hétérogénéité intercellulaire dans l'expression de la GFP après transfection transitoire, nous avons généré des lignées cellulaires non clonales stables par sélection G418. L'activité de la GK conférée par la GK marquée à la GFP était stable lors des premiers passages (<p9) mais a diminué lors des passages ultérieurs (Fig. 1B). De même, l'ARNm-GK humain a diminué avec le passage progressif (cinq à huit fois entre p9 et p19). L'expression de l'ARNm GK endogène (murin) était similaire dans les lignées cellulaires GK GFP et GFP GK (125 et 93 %, respectivement) que dans MIN6 non transfecté. L'affinité de GK pour le glucose (mmol/l) était similaire dans les extraits de cellules GK GFP et GFP GK (8,9 ± 0,3 et 8,9 ± 0,8, respectivement) que dans MIN6 surexprimant GK non marqué avec un vecteur adénoviral (8,5 ± 0,6). Il a été augmenté de manière similaire par un GKA (32) dans les lignées cellulaires (2,3 ± 0,3 et 2,1 ± 0,1) comme dans le MIN6 non transfecté (2,8 ± 0,3), indiquant que le tag GFP ne compromet pas l'affinité pour le glucose ou l'activation par un GKA .

Effets de l'activation et de la surexpression de GK sur la sécrétion d'insuline.

La sécrétion d'insuline induite par le glucose était similaire dans les lignées cellulaires GK GFP et GFP GK comme dans le MIN6 à passage précoce non transfecté (Fig. 2UNE). La sécrétion d'insuline dans les cellules dépend de l'activité GK (36) et de l'état différencié, qui dans MIN6 diminue avec le passage (37). Les lignées cellulaires clonales transfectées avec la GFP seule ont été considérées comme un contrôle inapproprié car elles ont montré une plus grande augmentation des faibles Km hexokinase avec un passage croissant par rapport aux lignées cellulaires GFP GK, indiquant une plus grande dédifférenciation (résultats non présentés). A l'inverse, le passage précoce non transfecté MIN6 peut représenter un état plus différencié que les lignées cellulaires GFP GK, ce qui pourrait expliquer la sécrétion similaire d'insuline induite par le glucose (Fig. 2UNE). Pour étudier l'effet de l'activité et de la concentration de GK sur la sécrétion d'insuline indépendamment du nombre de passages ou de l'état différencié de MIN6, nous avons comparé l'effet de la surexpression adénovirale titrée de GK non marqué avec l'activation pharmacologique de GK. Alors que la surexpression de GK a eu peu d'effet sur la sécrétion d'insuline quelle que soit la concentration de glucose (Fig. 2UNE), le GKA a provoqué une forte stimulation à 3 mmol/l de glucose (Fig. 2B). Des résultats similaires ont été obtenus lorsque la sécrétion d'insuline a été déterminée dans des îlots de souris. Le GKA a provoqué une stimulation de 2,6 fois (P < 0,01), alors que la surexpression de GK (confirmée par immunoblot) n'a eu aucun effet significatif (Fig. 2C).

Localisation subcellulaire des chimères GK marquées GFP dans MIN6 et hépatocytes.

La colocalisation de GK avec des granules d'insuline dans les cellules β pancréatiques a été démontrée par microscopie à immunofluorescence (38–41) (Fig. 3UNE), la microscopie électronique (38,41) et le fractionnement subcellulaire (31). Pour déterminer si la GK marquée par la GFP colocalise avec les granules d'insuline, les lignées cellulaires GFP GK et les cellules MIN6 transitoirement transfectées avec la GFP GK ont été colorées pour l'insuline (rouge) et visualisées par microscopie confocale. La GK endogène a montré une colocalisation claire avec l'insuline endogène (Fig. 3UNE), tandis que la GFP GK exprimée de manière transitoire a montré une colocalisation négligeable (Fig. 3B) et la GFP exprimée de manière stable La GK a montré une colocalisation partielle avec l'insuline (Fig. 3C).

Lorsque les constructions GK GFP et GFP GK ont été transitoirement transfectées dans des hépatocytes, les deux protéines se sont accumulées dans le noyau pendant l'incubation avec 5 mmol/l de glucose (résultats non montrés), indiquant que le tag GFP n'interfère pas avec la liaison au GKRP nucléaire, en accord avec les découvertes précédentes avec un NH2-étiquette GFP terminale (42).

Effet de MG132 sur l'expression de chimères GK marquées par GFP.

Nous avons testé si la diminution de l'expression du transgène dans les passages tardifs pouvait être empêchée par l'inhibition de la dégradation protéosomique à l'aide de MG132. MG132 n'a eu aucun effet sur MIN6 non transfecté ou MIN6 surexprimant GK non marqué, cependant, il a augmenté l'activité et l'immunoréactivité de la GK (64 kDa) dans les lignées cellulaires GK GFP (Fig. 4UNE). Pour tester si cette augmentation de l'activité GK et de l'immunoréactivité était due à l'inhibition de la dégradation des protéines, nous avons déterminé l'effet du MG132 en présence de cycloheximide pour inhiber la synthèse des protéines. Bien que l'activité GK ait diminué en présence de cycloheximide, cette diminution n'a pas été empêchée par MG132, à l'exception d'un effet sur la dégradation des protéines (Fig. 4B). MG132 a provoqué une forte augmentation de l'ARNm GK humain dans les lignées cellulaires GFP GK (100 à 200 fois) (Fig. 4C). Ceci a été aboli par l'inhibiteur transcriptionnel, l'actinomycine D (Fig. 4C), indiquant que MG132 a augmenté l'expression du transgène. MG132 a été utilisé dans le reste de l'étude pour augmenter l'expression du transgène.

Activation pharmacologique de GK.

Des études de cinétique enzymatique antérieures sur des protéines de fusion GST-GK purifiées ont montré que les mutants V62M et G72R ont une plus faible S0.5 pour le glucose que la GK de type sauvage et n'étaient pas activés par une GKA (24,25). Nous avons déterminé l'affinité pour le glucose de GFP V62M et GFP G72R dans des extraits cellulaires des lignées cellulaires clonales précultivées avec MG132 (voir ci-dessus). Les deux mutants avaient une plus faible S0.5 pour le glucose que le type sauvage (type sauvage, 9,0 ± 1,0 V62M, 5,2 ± 0,4 G72R, 4,6 ± 1,0 mmol/l), et aucun n'a été significativement activé par le GKA (32) (Fig. 5UNEC). Il n'y avait aucun effet de MG132 sur l'affinité pour le glucose (Fig. 5).

Activité GK et immunoréactivité de GFP V62M et GFP G72R dans des lignées cellulaires clonales.

L'activité catalytique et l'immunoréactivité GK des mutants ont été déterminées dans les lignées cellulaires clonales GFP V62M et GFP G72R et comparées à deux lignées cellulaires clonales exprimant la GFP GK de type sauvage (WT3B et WT10B). L'activité GK, l'immunoréactivité et l'ARNm ont été déterminés après préculture avec ou sans MG132, ce qui a provoqué une forte augmentation de l'ARNm du transgène, de la protéine GK et de l'activité (Fig. 6UNEC). GFP V62M et GFP G72R avaient une activité GK inférieure à celle des clones de type sauvage (Fig. 6) lorsqu'il est exprimé par rapport à l'immunoréactivité ou à l'ARNm (Fig. 6E et F). Il n'y avait pas de différence significative dans l'immunoréactivité de GK par rapport aux niveaux d'ARNm pour l'un ou l'autre mutant par rapport aux clones de type sauvage, suggérant une instabilité de l'activité catalytique mais pas de la protéine immunoréactive.

Études de transfection transitoire avec GFP V62M et GFP G72R.

Le rapport activité/immunoréactivité a également été déterminé après transfection transitoire de MIN6 avec différentes quantités de plasmides de GFP GK (type sauvage), GFP V62M et GFP G72R (Fig. 7UNE et B). Les tracés de l'activité GK contre l'immunoréactivité ont montré un rapport activité/immunoréactivité plus faible pour la GFP V62M et la GFP G72R par rapport à la GFP GK de type sauvage (Fig. 7C), ce qui est cohérent avec les résultats des lignées cellulaires clonales.

L'effet du GKA (35) sur la sécrétion d'insuline a été déterminé dans MIN6 qui étaient soit non transfectés soit transitoirement transfectés avec les constructions GFP. Le GKA a augmenté (P < 0,05) sécrétion d'insuline à 5 mmol/l de glucose dans les quatre conditions testées (non transfecté, 1,7 ± 0,2 à 2,7 ± 0,1 GFP GK, 1,8 à ± 0,1 à 3,6 ± 0,1 GFP V62M, 1,7 ± 0,1 à 3,0 ± 0,1 et GFP G72R , 1,5 ± 0,1 à 3,7 ± 0,2 g · h -1 · mg de protéine -1 ).

Stabilisation de GK par le foie PFK2/FDP2 et GKRP.

Les protéines de liaison GK PFK2/FDP2 et GKRP modulent l'activité GK dans les cellules β pancréatiques et le foie, respectivement. Nous avons donc testé si les mutants présentent une activation ou une stabilisation altérée lorsque ces protéines sont exprimées de manière hétérologue dans des cellules MIN6. L'expression de PFK2/FDP2 à l'aide d'un vecteur adénoviral dans les lignées cellulaires clonales a augmenté l'activité GK dans les clones de type sauvage et dans GFP V62M mais pas dans GFP G72R ou dans les cellules non transfectées (Fig. 8UNE). L'absence d'effet dans les cellules non transfectées peut être due à un effet saturant du PFK2/FDP2 endogène sur la GK endogène.

La surexpression de la protéine GKRP du foie a entraîné une augmentation faible mais significative de l'activité GK dans la GFP GK de type sauvage mais pas dans les lignées cellulaires mutantes ou dans MIN6 non transfecté (Fig. 8B). L'interaction des mutants avec la GKRP a également été testée par transfection transitoire des constructions GFP dans les hépatocytes. Contrairement à la GFP GK, qui s'accumulait dans le noyau à 5 mmol/l de glucose et s'est déplacée vers le cytoplasme à 25 mmol/l de glucose, ni la GFP V62M ni la GFP G72R ne s'accumulaient dans le noyau à 5 mmol/l de glucose (Fig. 8C).


Contenu

La glucokinase (GK) dans les cellules hépatiques phosphoryle le glucose, le préparant à son incorporation dans le glycogène ou à la glycolyse. During periods of ample glucose supply, most GK activity can be found in the peripheral cytoplasm where glycogen synthesis is occurring. [5] As the glucose supply declines during periods of fasting, GK activity in the cytoplasm diminishes. GKRP participates in this modulation of GK activity and location by binding free cytoplasmic GK as glucose levels decline, and moving it into the nucleus, where it is held in reserve in an inactive form. [6] As glucose and insulin levels rise, as during digestion of a meal, GK is released from GKRP and moves back to the cytoplasm, where much of it associates with the bifunctional enzyme. [7]

In hepatocytes of various mammals, GKRP has always been found in molar excess of the amount of GK, but the GKRP:GK ratio varies according to diet, insulin sufficiency, and other factors. Free GKRP shuttles between the nucleus and the cytoplasm. It may be attached to the microfilament cytoskeleton. [8]

GKRP competes with glucose to bind with GK, but inactivates it when bound. In conditions of low glucose, GKRP then pulls the GK into the nucleus. Rising amounts of glucose coming into the hepatocyte prompt the GKRP to rapidly release GK to return to the cytoplasm.

GKRP itself is subject to modulation. Fructose and sorbitol can both be converted to fructose-1-phosphate, which inhibits GKRP and frees GK. [1] Fructose 6-phosphate binds to the same site of GKRP, but enhances the ability of GKRP to bind and inactivate GK. In contrast, phosphorylation of GKRP by AMP-activated protein kinase, induced by elevated levels of AMP, reduces its capacity to inactivate GK. [9]

A presence and role of GKRP in other organs and tissues beyond the liver remains uncertain. Some researchers have finding small amounts of GKRP, or at least RNA coding for it, in small amounts in certain rat lung cells, in pancreatic islet cells, and in periventricular neurons of the hypothalamus in rats, [10] but physiological function and significance in these organs are unknown.

GKRP was originally discovered in rat liver. GKRP was found to serve a similar function in livers of mice and humans as well as other animals. [11] Cats are unusual in lacking GK activity, and have also been found to lack GKRP, though the genes for both GK and GKRP can be identified in the feline genome. [12]

Many mutant forms of human GK are associated with impaired or amplified insulin secretion or action, resulting in higher or lower blood glucose levels, and either diabetes (MODY2) or hyperinsulinemic hypoglycemia, respectively. Some of these variants have altered interaction with GKRP, which may contribute to the hyperglycemia. [13] [14] [15] [16]

The glucokinase of "knockout mice" who lack GKRP has a reduced expression and is entirely found in the cytoplasm. The knockout mice do not respond rapidly to glucose, exhibiting impaired glucose tolerance. [17] Mutations of the GKRP gene (GCKR) in humans have been sought as possible causes of monogenic diabetes (MODY), but no examples have yet been discovered. However, variant forms of GCKR have been found to be associated with small differences in levels of glucose, insulin, triglycerides, C-reactive protein, and higher or lower risks for type 2 diabetes mellitus. [18] [19] [20] [21]

Activators of GK are being investigated as possible medicines for type 2 diabetes. One of the mechanisms of activation may be protection from binding by GKRP. [22]


Molecular mechanism of catalysis: critically dependent on sulfhydryl groups

The sulfhydryl groups of several cysteines surround the glucose binding site. All except cys 230 are essential for the catalytic process, forming multiple disulfide bridges during interaction with the substrates and regulators. At least in the beta cells, the ratio of active to inactive glucokinase molecules is at least partly determined by the balance of oxidation of sulfhydryl groups or reduction of disulfide bridges.

These sulfhydryl groups are quite sensitive to the oxidation status of the cells, making glucokinase one of the components most vulnerable to oxidative stress, especially in the beta cells.


Correlation Between the Presence of GCK and Glucose Response by Cells Contributing to Glucose Homeostasis

Many different, functionally specialized glucose sensing cell types have evolved to assure blood glucose is maintained within a narrow, physiologically safe range of 4𠄸 mM. These cells complement each other in providing continuous measure and adjustment of the concentration of glucose in blood. We hypothesize that GCK is the primary glucose sensor utilized for maintaining glucose homeostasis, i.e., GCK is responsible for sensing blood glucose not only by β-cells but also by other cells involved in regulating blood glucose. In the case of α-cells, a recent and striking advance was made by specifically deleting GCK from the α-cells in mice, the deletion resulting in substantial loss of glucose induced suppression of glucagon release (Basco etਊl., 2018). The resulting hyperglucagonemia causes overactive glucagonogenesis, consistent with metabolism of glucose by GCK having a central role in α-cell function in glucose homeostasis. The authors conclude that glucose sensing is by GCK and that downstream signaling in α-cells is similar to that of β-cells: increased glucose increases the [ATP]/[ADP] ratio leading to closure of ATP-regulated K + channel and membrane depolarization. In α-cells, however, depolarization leads to voltage-dependent inactivation of voltage-gated Na + channels involved in action potential firing. Diminution of action potential height decreases activation of the P/Q Ca 2+ channels that mediate Ca 2+ entry, and this decreases glucagon release. Note that Le Marchand and Piston (2012), have provided evidence that glucose induced suppression of glucagon secretion does not involve decreased intracellular [Ca 2+ ].

Pancreatic δ-cells respond to increased glucose by releasing somatostatin which acts locally as a paracrine inhibitor of insulin and glucagon release rather than a systemic hormone (Boden etਊl., 1981, Gylfe, 2016 Rorsman and Huising, 2018). Glucose sensing by δ-cells most likely involves GCK for sensing as indicated by substantial expression of the gene as measured by single cell RNA-seq. It should be noted that pancreatic α-, β-, and δ-cells have a common progenitor cell (Sosa-Pineda etਊl., 1997 Gradwohl etਊl., 2000 Chung and Levine, 2010) which could help explain the obvious similarities in their glucose sensing pathways. δ-cells also respond directly to a physiological amino acid mixture independently of glucose, perhaps the consequence of membrane depolarization caused by sodium co-transport being sufficient to reach the threshold for secretory response (Boden etਊl., 1981 Rorsman and Huising, 2018).

Similar GCK-dependent sensing paths have been proposed for glucose excited (GE) and glucose inhibited (GI) neurons of the CNS. Dunn-Meynell etਊl. (2002) reported that GCK mRNA is expressed in norepinephrine neurons of locus ceruleus, and in hypothalamic neuropeptide Y, pro-opiomelanocortin, and γ-aminobutyric acid neurons. Moreover, in GE neurons intracellular Ca 2+ oscillations were inhibited and in GI neurons Ca 2+ oscillations were stimulated by four selective GCK inhibitors. Lamy etਊl. (2014) studied GLUT2-expressing excitatory neurons (GE) in the nucleus of tractus solitarius of the vagus nerve. These neurons form a distinct population of hypoglycemia-activated neurons. The authors concluded that glucose is sensed through GCK because hypoglycemia decreases energy state and increases [AMP]. Increased [AMP] then activates AMP-dependent protein kinase and this suppresses a K + leak current, hyperpolarizes the cells, and increases afferent electrical activity. Similar results have been presented for GI neurons of the hypothalamic arcuate nucleus (Burdakov etਊl., 2005 Routh, 2010 Hussain etਊl., 2015). There are a large number of different types of neurons for which glucose sensitivity has been reported (Levin etਊl., 2004 Jordan etਊl., 2010 Thorens, 2012 Lamy etਊl., 2014 Steinbusch etਊl., 2015, 2016) and in most of these neurons glucose sensing appears to be through GCK, although orexin neurons of the hippocampus are apparently an exception (see section on alternate glucose sensors).

GCK has also been implicated in glucose sensing in the anterior pituitary gland of rat and monkey (Zelent etਊl., 2006 Sorenson etਊl., 2007). GCK activity was measured spectrophotometrically in whole pituitary extracts and identified as a generalized cytoplasmic staining co-localized in cells with follicle-stimulating hormone (FSH) or luteinizing hormone (LH). In addition to gonadotropes, GCK was observed in a minor subpopulation of corticotropes and thyrotropes (Sorenson etਊl., 2007). It is puzzling, however, that in gonadotropes of the cynomolgus monkey GCK appeared to be clearly confined to cytosolic substructures, tentatively identified as Golgi complex (Sorenson etਊl., 2007). Pulsatile stimulation of the gonadotropes FSH and LH is mediated by GNRH released from GNRH neurons of the preoptic nucleus, which in turn are regulated by hypothalamic Kisspeptin neurons. GNRH receptor activation results in phospholipase C activation, IP3 mediated ER-calcium release causing secretion of the hormones (Stojilkovic etਊl., 2005). It remains to be tested whether, and if so how, glucose might influence these cells as they control puberty and/or reproduction. Nutrient supply profoundly influences reproductive biology, and GCK-dependent glucose regulation at the level of the pituitary might play a hitherto not considered role. Note that in the case of gonadotropes, glucose sensing might influence the release of FSH and/or LH which would impact glucose homeostasis directly passant par sex steroids or indirectly through increased nutrient consumption due to the pubertal growth spurt or pregnancy.

A case can also be made that GCK is the glucose sensor for cells in the adrenal gland which secrete epinephrine and corticosteroids to counteract hypoglycemia. Three lines of evidence support this contention. A rather mild form of hypoglycemia, observed clinically, later found to be caused by an activating mutation of GCK (M197 T?), was initially diagnosed as adrenal insufficiency. The patient was treated for 12 years with a maintenance dose of 10 mg cortisol to ameliorate hypoglycemia symptomatology (Morishita etਊl., 2017). After reevaluation of the original diagnosis, steroid treatment was discontinued because hypertension had developed and adrenal insufficiency was discounted. It is noteworthy that this particular GCK mutation increases activity of the enzyme only moderately as indicated by a thorough kinetic analysis (Sayed etਊl., 2009). It is therefore not unreasonable to hypothesize the clinical presentation resulted from complex additive effects of GCK activation that involved altered glucose sensing by both pancreatic α- and β-cells as well as cells of the adrenal gland. This interpretation is strengthened by a recent demonstration of GCK mRNA in mouse adrenal glands (see Supplement figure in Steinbusch etਊl., 2016) and immunohistochemical data indicating GCK is present in cells of the human adrenal gland (online Human Atlas showing histochemical staining of GCK).

These examples illustrate that each cell type having a role related to blood glucose levels expresses GCK and there is evidence that glucose is sensed through the activity of GCK. Our hypothesis predicts that all utilize similar metabolism to couple GCK activity to energy state and their metabolic response to changes in glucose concentration closely approximate those in pancreatic α- and β-cells and in glucose sensing neurons. The mechanism and metabolism related to glucose sensing is similar for all of the cells, while differences in coupling of energy state to membrane permeability, specific hormone and/or neurotransmitter released determining outcome and role in glucose/energy metabolism regulation. Examples of how similar changes in energy state elicit different cell specific responses have been presented for β-cells, α-cells, and glucose sensing neurons.

It is also important that GCK is absent or very low in cells and tissues that do not serve as glucose sensors as defined. These cells express hexokinase instead of GCK and the higher affinity for glucose (0.05𠄰.2 vs 1.5� mM, (Cárdenas, 2004)) results in cellular metabolism being insensitive to changes in glucose concentration in the physiological ranges found in different species. Zelent etਊl. (2006), for example, measured expression of GCKmRNA in islets of Langerhans (pancreas), pituitary, adrenal gland, whole brain, acinar pancreas, liver, skeletal muscle, adipose tissue, lung, kidney, and spleen. Of these, GCK mRNA was expressed in substantial amounts in the islets of Langerhans, pituitary, and liver with only trace amounts in the other tissues. Even more telling is that in brain, GCK mRNA is expressed in only a very small fraction of neurons and then only in neurons that respond to changes in physiological glucose concentrations (see Hussain etਊl., 2015 De Backer etਊl., 2016).


Introduction

Glucokinase (GK) * activity is a major determinant of β cell glucose metabolism and insulin secretion (Sweet et al., 1996 Matschinsky et al., 1998 Matschinsky, 2002). Thus, a complete model of its regulation is central to our understanding of glucose homeostasis and the pathogenesis of diabetic disease states. To maintain physiological glucose responsiveness, GK activity needs to be constrained within a very narrow range (Wang and Iynedjian, 1997 Matschinsky et al., 1998). Regulation of GK expression in β cells has been widely studied and is induced mainly by glucose, although it can be modulated by other factors, including insulin (Leibiger et al., 2001 Matschinsky, 2002). Posttranslational regulation of GK has only more recently been described, and the mechanisms involved in this mode of regulation are not well known. Recent studies have shown that low levels of glucose cause an association of GK with secretory granules (Toyoda et al., 1999 Stubbs et al., 2000 Rizzo et al., 2002) and that this association correlates with a decrease in GK activity (Rizzo et al., 2002). Prolonged exposure to high glucose (>20 min) causes dissociation of GK from the granule along with conformational changes associated with activation. Glucose-stimulated GK regulation is blocked by inhibitors of insulin secretion, and insulin by itself can rapidly (<2 min) induce similar changes to GK localization and activity (Rizzo et al., 2002). This suggests that minute-to-minute regulation of GK activity and localization occurs through receptor-mediated signaling and not by interaction between glucose and GK.

The molecular mechanism of GK association with secretory granules and the processes that modulate this association are unknown. To address the mechanism of GK association with secretory granules, we examined the role of nitric oxide synthase in this regulation. Neuronal nitric oxide synthase (nNOS) is activated by a rise in intracellular calcium, which is a known response of β cells to glucose or insulin stimulation (Aspinwall et al., 2000) and nNOS is also known to be localized on insulin secretory granules (Lajoix et al., 2001). Nitric oxide (NO) has also been shown to have a stimulatory affect on glucose-stimulated insulin secretion from both cultured β cell lines and pancreatic islets (Smukler et al., 2002 Kaneko et al., 2003). However, these findings are highly controversial, and an inhibitory effect on insulin secretion has also been shown using a variety of experimental approaches. (Salehi et al., 1996 Lajoix et al., 2001 Henningsson et al., 2002). This controversy points to the need for more careful consideration of potential targets for NO in the regulation of glucose-stimulated insulin secretion in order to understand the role of NO synthase (NOS) in β cell function. GK is one potential target for regulation by NO, since GK contains several cysteines that have been shown to be critical for maintaining catalytic activity (Tiedge et al., 2000).


Loss of function mutations cause diabetes

Over 190 of these mutations reduce the functional efficiency of the glucokinase molecule. Heterozygosity for alleles with reduced enzyme activity results in a higher threshold for insulin release and persistent, mild hyperglycemia. This condition is referred to as maturity onset diabetes of the young, type 2 (MODY2).

Homozygosity for GCK alleles with reduced function can cause severe congenital insulin deficiency resulting in persistent neonatal diabetes.

Gain of function mutations cause hyperinsulinemic hypoglycemia

As of 2004, 5 mutations have been found to enhance insulin secretion. Heterozygosity for gain of function mutations reduces the threshold glucose that triggers insulin release. This creates hypoglycemia of varying patterns, including transient or persistent congenital hyperinsulinism, or fasting or reactive hypoglycemia appearing at an older age.


Voir la vidéo: 7- BIOCHEMISTRY GLYCOLYSIS. HEXOKINASE VS GLUCOKINASE (Janvier 2022).