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9.13 : La liaison initie une voie de signalisation - Biologie


Une fois que le ligand se lie au récepteur de surface cellulaire, l'activation des composants intracellulaires du récepteur déclenche une chaîne d'événements appelée voie de signalisation ou cascade de signalisation. Dans un voie de signalisation, les seconds messagers, les enzymes et les protéines activées interagissent avec des protéines spécifiques, qui sont à leur tour activées dans une réaction en chaîne qui conduit finalement à un changement dans l'environnement de la cellule (Figure 1). Les interactions qui se produisent avant un certain point sont définies comme des événements en amont, et les événements après ce point sont appelés événements en aval.

Question de pratique

Dans certains cancers, l'activité GTPase de la protéine G RAS est inhibée. Cela signifie que la protéine RAS ne peut plus hydrolyser le GTP en GDP. Quel effet cela aurait-il sur les événements cellulaires en aval ?

[practice-area rows="2″][/practice-area]
[révéler-réponse q="265793″]Montrer la réponse[/révéler-réponse]
[hidden-answer a=”265793″]ERK deviendrait activé en permanence, entraînant la prolifération, la migration, l'adhésion et la croissance de nouveaux vaisseaux sanguins. L'apoptose serait inhibée.[/hidden-answer]

Les voies de signalisation peuvent devenir très compliquées très rapidement car la plupart des protéines cellulaires peuvent affecter différents événements en aval, selon les conditions au sein de la cellule. Une seule voie peut bifurquer vers différents points finaux en fonction de l'interaction entre deux ou plusieurs voies de signalisation, et les mêmes ligands sont souvent utilisés pour initier différents signaux dans différents types cellulaires. Cette variation de réponse est due à des différences d'expression des protéines dans différents types de cellules. Un autre élément de complication est intégration de signaux des voies, dans lesquelles les signaux de deux ou plusieurs récepteurs de surface cellulaire différents fusionnent pour activer la même réponse dans la cellule. Ce processus peut garantir que plusieurs exigences externes sont satisfaites avant qu'une cellule ne s'engage dans une réponse spécifique.

Les effets des signaux extracellulaires peuvent également être amplifiés par des cascades enzymatiques. A l'initiation du signal, un seul ligand se lie à un seul récepteur. Cependant, l'activation d'une enzyme liée à un récepteur peut activer de nombreuses copies d'un composant de la cascade de signalisation, ce qui amplifie le signal.


Voie de signalisation de récepteur de type péage

Les récepteurs Toll-like (TLR) sont une classe de protéines qui jouent un rôle clé dans l'immunité innée. Ce sont des récepteurs transmembranaires à domaine unique appartenant aux récepteurs de reconnaissance de formes (PRR) qui s'expriment généralement dans les cellules sentinelles telles que les cellules dendritiques des macrophages et de nombreuses autres cellules non immunitaires telles que les fibroblastes et les cellules épithéliales. Ils reconnaissent des molécules structurellement conservées dérivées de microbes qui sont appelées modèles moléculaires associés à des agents pathogènes (PAMP) ou des molécules auto-dérivées dérivées de cellules endommagées, appelées modèles de molécules associées à des dommages (DAMP). Les PAMP comprennent divers composants de la paroi cellulaire bactérienne tels que le lipopolysaccharide (LPS), le peptidoglycane (PGN) et les lipopeptides, ainsi que la flagelline, l'ADN bactérien et l'ARN double brin viral. Les DAMP comprennent des protéines intracellulaires telles que des protéines de choc thermique ainsi que des fragments de protéines de la matrice extracellulaire. Les PRR activent les voies de signalisation en aval qui conduisent à l'induction de réponses immunitaires innées en produisant des cytokines inflammatoires, de l'interféron de type I (IFN) et d'autres médiateurs. Ces processus déclenchent non seulement des réponses défensives immédiates de l'hôte telles que l'inflammation, mais amorcent et orchestrent également des réponses immunitaires adaptatives spécifiques à l'antigène. Ces réponses sont essentielles pour l'élimination des microbes infectants ainsi que cruciales pour l'instruction conséquente des réponses immunitaires adaptatives spécifiques de l'antigène.

Figure 2. Le diagramme schématique de la structure moléculaire des TLR.

Famille de récepteurs de type Toll

La famille TLR comprend 10 membres (TLR1-TLR10) chez l'homme et 12 (TLR1-TLR9, TLR11-TLR13) chez la souris. Les TLR se localisent à la surface des cellules ou dans des compartiments intracellulaires tels que le RE, l'endosome et le lysosome. Les TLR de surface cellulaire comprennent TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6 et TLR10, tandis que les TLR intracellulaires sont localisés dans l'endosome et comprennent TLR3, TLR7, TLR8, TLR9, TLR11, TLR12 et TLR13 (Figure 1). Les TLR de surface cellulaire reconnaissent principalement les composants de la membrane microbienne tels que les lipides, les lipoprotéines et les protéines. Les TLR intracellulaires reconnaissent les acides nucléiques dérivés de bactéries et de virus, et reconnaissent également les acides auto-nucléiques dans des conditions pathologiques telles que l'auto-immunité.

La fonction du récepteur Toll-like repose généralement sur un processus de dimérisation de deux molécules TLR, mais pas toujours. Par exemple, TLR-1 et TLR-2 se lieront l'un à l'autre pour former un gradateur lorsqu'ils reconnaîtront des molécules PAMP comprenant principalement des lipoprotéines, des peptidoglycanes, des acides lipotechoïques (LTA, Gram-), du zymosan, du mannane et de la tGPI-mucine. TLR-2 peut également former un gradateur avec TLR-6 lorsqu'ils reconnaissent les mêmes PAMP énumérés ci-dessus. TLR-4 peut reconnaître le lipopolysaccharide (LPS, Gram+) et former un homodimère avec une autre molécule de TLR-4. Le TLR-5 peut reconnaître la flagelline bactérienne, mais ils ne forment pas de gradateur. Le TLR-11 est fonctionnel chez la souris et reconnaît principalement les bactéries uropathogènes. Les TLR-3, 7, 8, 9, 13 sont exprimés à la surface de l'endosome dans le cytoplasme. TLR3 reconnaît l'ARN double brin viral (ARNdb), les petits ARN interférents et les auto-ARN dérivés de cellules endommagées. Le TLR-7 est principalement exprimé dans les DC plasmacytoïdes (pDC) et reconnaît l'ARN simple brin (ss) des virus. Il reconnaît également l'ARN des bactéries streptocoques B dans les DC conventionnelles (cDC). TLR8 répond à l'ARN viral et bactérien. Le TLR-9 reconnaît l'ADN bactérien et viral riche en motifs CpG-ADN non méthylés. Le TLR13 reconnaît l'ARNr 23S bactérien et les composants inconnus du virus de la stomatite vésiculeuse.

Bien qu'il existe tant de types de molécules de TLR qui reconnaissent une large gamme de ligands, tous ces TLR partagent un cadre structurel commun dans leurs domaines extracellulaires de liaison aux ligands. Ces domaines adoptent tous des structures en forme de fer à cheval construites à partir de motifs répétés riches en leucine. En règle générale, lors de la liaison du ligand, deux domaines extracellulaires forment un dimère en forme de « m » prenant en sandwich la molécule de ligand rapprochant les domaines transmembranaire et cytoplasmique et déclenchant une cascade de signalisation en aval (Figure 2).

Voie de signalisation du récepteur Toll-like

1. Cascade de signalisation des récepteurs de type Toll

Les récepteurs de type Toll permettent aux cellules sentinelles telles que les macrophages de détecter les microbes grâce aux PAMP tels que le LPS. Le LPS est un composant de la paroi cellulaire bactérienne. Le mécanisme de reconnaissance des lipopolysaccharides par les récepteurs de type Toll est complexe et nécessite plusieurs protéines accessoires. Une protéine sérique, la protéine de liaison au LPS se lie aux monomères LPS et les transfère à une protéine appelée CD14. Le CD14 peut être soluble ou se lier à la surface cellulaire via une ancre glycosylphosphatidylinositol. Le CD 14 délivre et charge le LPS dans le domaine extracellulaire des récepteurs de type Toll. Les TLR sont capables de détecter le LPS à l'aide d'une protéine accessoire appelée MD-2. Ensuite, l'homodimérisation des TLR est induite lorsque le LPS se lie au complexe TLR-CD14-MD2. Le changement de conformation des domaines extracellulaires initie la dimérisation du domaine cytoplasmique du récepteur Toll IL-1 (TIR). Le changement de conformation TIR fournit un nouvel échafaudage qui permet le recrutement de protéines adaptatrices pour former un complexe de signalisation post-récepteur. Le TIR contenant une protéine adaptatrice de différenciation myéloïde à réponse primaire 88 (MyD88).

MyD88 fonctionne comme un adaptateur reliant les TLR/IL-1R aux molécules de signalisation en aval qui ont des DD. Il reconnaît le changement de conformation dans le domaine TIR des TLR, se lie au nouveau complexe récepteur et transfère la signalisation par interaction avec le domaine de mort amino (N)-terminal (DD) avec les kinases associées à l'IL-1R (IRAK). Il en résulte une cascade complexe avec des inventions de signalisation qui avertissent la cellule de l'invasion d'agents pathogènes. Il y a 4 IRAK (IRAK 1, 2, 4, M). Ils contiennent une DD N-terminale et un domaine central sérine/thréonine-kinase. IRAK1 et IRAK4 ont une activité kinase intrinsèque, tandis que IRAK2 et IRAK-M n'ont aucune activité kinase détectable. IRAK4 activé par MyD88 et il continue à activer IRAK1. IRAK1 active alors le TRAF6 aval. TRAF6 est un membre de la famille des facteurs associés au récepteur du facteur de nécrose tumorale (TNFR) (TRAF) qui médie les voies de signalisation des cytokines. Lors de la stimulation, TRAF6 est recruté dans le complexe récepteur et activé par IRAK-1 qui se lie au domaine TRAF de TRAF6. Ensuite, le complexe IRAK-1/TRAF6 se dissocie du récepteur et s'associe à la kinase 1 activée par le TGF-bêta (TAK1) et aux protéines de liaison à TAK1, TAB1 et TAB2. Le complexe de TRAF6, TAK1, TAB1 et TAB2 se déplace dans le cytoplasme, où il forme un grand complexe avec d'autres protéines, telles que les ligases E2 Ubc13 et Uev1A. Il a été démontré que le complexe Ubc13 et Uev1A catalyse la synthèse d'une chaîne de polyubiquitine liée à Lys 63 de TRAF6 et induit ainsi l'activation médiée par TRAF6 de TAK1 et enfin de NF-kB. Ces voies de signal décrites ci-dessus sont appelées voie dépendante de MyD88 car le signal part de la molécule MyD88. Il existe également une autre voie appelée voie MyD88-independedt, dont la signalisation ne part pas de MyD88. Au lieu de cela, le signal à partir de la protéine TRIF. TRIF interagit avec TRAF6 et TRAF3.TRAF6 recrute la kinase RIP-1, qui à son tour interagit avec et active le complexe TAK1, conduisant à l'activation de NF-kB et MAPK et à l'induction de cytokines inflammatoires. En revanche, TRAF3 recrute les kinases liées à IKKTBK1 et IKKi avec NEMO pour la phosphorylation et l'activation d'IRF3. IRF3 forme un dimère et se transloque dans le noyau à partir du cytoplasme, induit l'expression de l'IFN de type I.

Les TLR signalent en fait principalement par le recrutement de molécules adaptatrices spécifiques, conduisant à l'activation des facteurs de transcription NF-kB et IRF, qui dictent le résultat des réponses immunitaires innées. Cette voie de signalisation en aval doit donc activer le facteur de transcription IRF, la voie de signalisation NF-kB et la voie MAKP. Vous pouvez trouver plus d'informations détaillées sur les voies NF-kB et MAKP à partir de :
Voie de signalisation NF-kB, voie de signalisation P38 et voie de signalisation MAKP.

De cause, il existe une certaine régulation négative par un certain nombre de molécules par le biais de divers mécanismes pour empêcher ou mettre fin aux réponses immunitaires excessives qui entraînent des conséquences néfastes associées à l'auto-immunité et aux maladies inflammatoires. L'activation de la voie dépendante de MyD88 est supprimée par ST2825, SOCS1 et Cbl-b, et l'activation de la voie dépendante de TRIF est supprimée par SARM et TAG. Ces molécules s'associent à MyD88 ou TRIF pour les empêcher de se lier aux TLR ou aux molécules en aval. L'activation de TRAF3 est régulée négativement par SOCS3 et DUBA. TRAF6 est ciblé par un certain nombre de molécules inhibitrices telles que A20, USP4, CYLD, TANK, TRIM38 et SHP. L'activation de TAK1 est inhibée par TRIM30a et A20.

4. Relation avec les maladies

Comme le TLR est impliqué dans la détection du LPS et qu'il pourrait avoir un rôle dans la septicémie, le ciblage des TLR est important pour le traitement de plusieurs maladies. En plus d'interférer avec les réponses TLR pour traiter les infections pathogènes, une application clinique évidente des connaissances acquises grâce aux études TLR consistait à utiliser des ligands TLR comme adjuvants vaccinaux. De plus, l'inhibition du TLR a également été tentée en clinique, dont le but est de limiter l'inflammation excessive qui est vraisemblablement entraînée par la suractivation d'un TLR particulier.


Résultats et discussion

La ligature Ncad active p38 d'une manière dépendante de Cdo, JLP et Bnip-2.

Pour évaluer si la ligature Ncad active la signalisation p38 dans les myoblastes, les cellules C2C12 ont été plaquées à faible densité (sans aucun contact cellule-cellule) sur des boîtes de culture ou des lamelles recouvertes de protéine de fusion ectodomaine-Fc Ncad (Ncad-Fc). Dans ces conditions, les cellules exprimant Ncad s'attachent et se propagent comme si elles adhèrent aux cellules voisines et subissent une signalisation dépendante de Ncad, mais sans autres signaux juxtacrines qui peuvent se produire indirectement en raison de l'adhésion cellule-cellule (26). Des plats et des lamelles recouvertes de fibronectine (qui, comme Ncad, favorise la myogenèse) (27) ou de poly-L-lysine (PLL) ont été utilisées comme témoins. Les cellules ont été visualisées par coloration à la phalloïdine pour révéler les structures d'actine F et récoltées pour l'analyse de la forme phosphorylée (activée) de p38 (pp38) par transfert de Western. Les cellules plaquées sur Ncad-Fc pendant 2 h se sont propagées, ont formé des fibres de stress et des extensions filopodiales et ont induit pp38 (Fig. 1 UNE et B). De plus, pp38 dans ces cellules était localisé dans le noyau et la région périnucléaire (Fig. 1C). Les cellules plaquées sur la fibronectine ont formé des fibres de stress et des projections plus longues et ont atteint une surface globale similaire à celles de Ncad-Fc, mais n'ont pas produit de pp38 (Fig. 1 UNE, B, et ). Les cellules plaquées sur PLL se sont attachées mais ne se sont pas propagées aussi bien et n'ont pas produit de pp38. Par conséquent, la ligature Ncad a spécifiquement activé p38 dans les myoblastes. De plus, les cellules plaquées à faible densité sur Ncad-Fc, mais pas sur PLL, pendant 24 h ont exprimé respectivement la myogénine et la troponine T, marqueurs précoces et tardifs de la différenciation (Fig. S1).

La ligature Ncad active p38 dans les myoblastes. (UNE) Microphotographies de cellules C2C12 cultivées sur Ncad-Fc (Ncad), fibronectine (FN) ou poly-L-lysine (PLL) pendant 2 h et colorées avec de la rhodamine phalloïdine pour révéler les structures F-actine. (B) Analyse par transfert Western de pp38 et de p38 total dans les cultures présentées dans UNE. (C) Photomicrographie d'une cellule C2C12 sur substrat Ncad-Fc pendant 2 h colorée avec de la rhodamine phalloïdine (rouge), anti-pp38 (vert) et DAPI pour révéler les noyaux (bleu). () Surface des cellules C2C12 cultivées sur les substrats indiqués pendant 2 h. Les valeurs sont des moyennes ± SD, m > 80 cellules. *, P < 0.01 par l'étudiant t test. (Barres d'échelle, 10 m.)

Étant donné que Ncad et Cdo s'associent dans les myoblastes et que les complexes contenant Cdo sont impliqués dans l'activité p38 dépendante de la différenciation (6, 7, 11), les protéines de liaison Cdo et Cdo ont été évaluées pour leur importance dans la production de pp38 par ligature Ncad. Les cellules C2C12 ont été appauvries en Cdo, JLP et Bnip-2 par l'ARNi, et les cellules ont été étalées sur des cellules Ncad-Fc qui exprimaient une séquence d'ARNi de contrôle ont également été analysées. L'épuisement de chaque protéine a diminué la production de pp38 lors de la ligature de Ncad dans une mesure qui était à peu près proportionnelle à l'étendue de la précipitation (Fig. 2 UNE et B). En revanche, la phosphorylation d'autres MAP kinases, ERK et JNK, induite par la ligature Ncad n'était pas significativement affectée par l'épuisement de l'ARNi de Cdo, JLP ou Bnip-2, indiquant une exigence spécifique pour Cdo et ses protéines associées dans la signalisation p38 dépendante de Ncad (Fig. 2B et la figure S2). Cdo interagit également avec la M-cadhérine (11) et, conformément à la redondance potentielle de la cadhérine dans les myoblastes, la ligature de la M-cadhérine a activé p38 d'une manière dépendante de Cdo (Fig. S3). Myoblastes dérivés de cellules satellites de Cdo +/+ et Cdo −/− les souris ont également été étudiées. Similaire aux cellules C2C12, Cdo +/+ les myoblastes activaient pp38 lorsqu'ils étaient plaqués sur Ncad-Fc mais pas sur fibronectine ou PLL. En revanche, Cdo −/− les myoblastes n'ont affiché qu'une trace de production de pp38 lors de la ligature Ncad (Fig. 2C). Ensuite, nous avons demandé si la perturbation de l'association Ncad-Cdo interférait avec l'activation de p38. Un mutant de délétion Cdo dépourvu de la première répétition FnIII (désigné CdoΔFn1) ​​est déficient dans sa capacité à interagir avec Ncad mais s'associe normalement à d'autres protéines connues pour interagir avec l'ectodomaine Cdo (11-13) l'expression de cette protéine dans les cellules C2C12 inhibe la différenciation (11). L'expression de CdoΔFn1 dans ces cellules a également fortement diminué l'induction de pp38, mais pas de pERK, par ligature Ncad (Fig. 2).

Cdo, JLP et Bnip-2 sont impliqués dans l'activation de p38 induite par Ncad. (UNE) Western blots de cellules C2C12 exprimant de manière stable l'ARNsi contre Cdo, JLP, ou Bnip-2, ou un siRNA contrôle (Con), ont été sondés avec des anticorps contre la protéine indiquée ou contre la -tubuline comme contrôle. (B) Analyse par transfert Western de pp38, p38 total, pERK et ERK2 total dans des cellules C2C12 exprimant les constructions de siRNA indiquées et cultivées pendant 2 h sur des substrats Ncad ou PLL. (C) Analyse Western blot de la pp38 et de la p38 totale dans Cdo +/+ et Cdo −/− myoblastes cultivés pendant 2 h sur substrats Ncad, FN ou PLL. () Analyse Western blot de Cdo endogène et Cdo(ΔFn1) ​​exogène, pp38, p38 total, pERK et ERK2 total, dans des cellules C2C12 exprimant Cdo(ΔFn1) ​​et cultivées sur des substrats Ncad ou PLL pendant 2 h. Notez que bien que les transferts Con et Cdo(ΔFn1) ​​semblent séparés, ils proviennent des mêmes autoradiogrammes.

L'activation de p38 dépendante de Cdo dans la différenciation des myoblastes se produit par l'activité Cdc42 dépendante de Cdo/Bnip-2 (6). Les cellules C2C12 plaquées sur le substrat Ncad-Fc ont induit une activité Cdc42 significativement supérieure à celle observée dans les cellules sur PLL, comme évalué par les niveaux de Cdc42 lié au GTP (Fig. 3UNE). En outre, l'épuisement de Cdo médié par l'ARNi a fortement diminué les niveaux de Cdc42 lié au GTP dans les cellules plaquées sur l'un ou l'autre substrat, suggérant que Cdo est non seulement nécessaire pour l'activité Cdc42 initiée par Ncad, mais également impliquée dans l'activité Cdc42 basale sur PLL (Fig. 3UNE). Nous avons précédemment montré que la surexpression stable de Cdc42GAP dans les cellules C2C12 réduit les niveaux à l'état d'équilibre de Cdc42 lié au GTP, l'activation de p38 associée à la différenciation et la différenciation elle-même (6). La surexpression de Cdc42GAP a également réduit l'induction de pp38 par ligature Ncad (Fig. 3B). En prenant les résultats ensemble, la ligature de Ncad a induit pp38 dans un essai de signalisation à court terme d'une manière très similaire à l'activation de pp38 observée dans la différenciation des myoblastes (c. protéines de liaison JLP et Bnip-2, et réduction de l'activité Cdc42) (6, 7, 10).

Cdc42, mais pas RhoA, est impliqué dans l'activation de p38 induite par Ncad. (UNE) Quantification par G-LISA de Cdc42 lié au GTP (activé) dans des cellules C2C12 exprimant de manière stable le siRNA contre Cdo ou un siRNA témoin plaqué sur des substrats Ncad ou PLL. *, P < 0.01 **, P < 0,001 par étudiant t test. Voir Méthodes pour les détails. (B) Analyse par transfert Western de pp38, de p38 total et de l'épitope indicateur dans des cellules C2C12 transfectées de manière stable avec des vecteurs d'expression de contrôle (Con) ou Cdc42GAP(flag). (C) Microphotographies de cellules C2C12 cultivées avec ou sans inhibiteur C3 RhoA perméable aux cellules et plaquées sur un substrat Ncad-Fc pendant 2 h, puis colorées avec de la rhodamine phalloïdine (rouge), anti-pp38 (vert) et DAPI pour révéler les noyaux (bleu) . (Barre d'échelle, 10 m.) () Analyse par transfert Western de pp38 et de p38 total dans des cellules C2C12 cultivées avec ou sans inhibiteur C3 RhoA perméable aux cellules et plaquées sur des substrats Ncad-Fc ou PLL pendant 2 h.

La petite GTPase RhoA régule positivement la différenciation myogénique (15), et l'expression stable des formes constitutivement actives ou dominantes négatives de RhoA améliore ou réduit les niveaux de pp38, respectivement, dans les cellules C2C12 cultivées pendant 24 à 72 h dans un milieu de différenciation (20). De plus, RhoA est activé par ligature de cadhérine dans plusieurs systèmes cellulaires, y compris les myoblastes (15, 26). Pour évaluer si RhoA est directement impliqué dans pp38 induite par la ligature Ncad, les cellules C2C12 ont été traitées avec l'inhibiteur Rho spécifique, la transférase C3. C3 a diminué les niveaux de RhoA-GTP dans les cellules C2C12 de > 70% (Fig. S4), et les cellules traitées par C3 sur substrat Ncad-Fc ont affiché une perte pratiquement complète de fibres de stress, dont la production est connue pour nécessiter une activité RhoA (28) ( 3C). En revanche, l'induction de pp38 médiée par Ncad n'a pas été affectée par C3, ni la localisation nucléaire/périnucléaire de pp38 (Fig. 3 C et ). Par conséquent, RhoA n'est pas directement impliqué dans l'activation de p38 dépendante de Ncad. La capacité de RhoA à réguler positivement l'activité de p38 sur une plus longue durée dans la différenciation des myoblastes (19) peut être liée à ses effets sur l'expression de MyoD et à un effet conséquent sur la liaison de MyoD à l'activité de p38 par le biais de mécanismes d'anticipation (4, 29).

JLP, Bnip-2 et cluster Cdc42 actif sur les sites d'interaction Ncad-Ligation et Ncad-Cdo mais pas sur les sites d'interaction Shh-Cdo.

Les résultats décrits ci-dessus suggèrent fortement que les complexes de signalisation dépendants de Cdo qui activent p38 dans les myoblastes en différenciation se situent dans une voie initiée par la ligature Ncad. Une densité cellulaire élevée favorise à la fois la ligature Ncad et l'activité p38 dans les cellules C2C12 (15, 20). Ncad et Cdo s'associent dans les cultures à haute et basse densité (c'est-à-dire que la ligature Ncad n'est pas nécessaire pour l'interaction Ncad-Cdo) (11), mais Cdo et p38 co-immunoprécipitent uniquement dans les cultures à haute densitéUNE), suggérant que la ligature Ncad déclenche cette association. Il serait donc prédit que les composants du complexe Cdo se regrouperaient sur les sites de ligature Ncad active. Pour tester cette notion, des microsphères recouvertes d'ectodomaine Ncad ont été autorisées à se déposer sur des cellules NIH 3T3 adhérentes qui exprimaient de manière transitoire des formes marquées par fluorescence de Ncad, Cdo, JLP, Bnip-2 ou le domaine de liaison Cdc42 de N-Wasp (wGBD), qui interagit spécifiquement avec le Cdc42 (30) actif lié au GTP. Les billes recouvertes de cadhérine se fixent aux cellules via des cadhérines cellulaires apparentées, et des protéines cellulaires supplémentaires qui se regroupent sur ces sites d'adhésion peuvent être visualisées sous la forme d'un signal fluorescent entourant la bille (31-33). Lorsque des billes recouvertes de Ncad se sont attachées à des cellules qui coexprimaient Ncad et Cdo-GFP marqués par DsRed, chaque protéine fluorescente était concentrée sur ces billes. En revanche, la GFP elle-même s'est regroupée sur les billes Ncad beaucoup moins efficacement (Fig. 4 B et C). Le pourcentage de billes qui regroupaient une protéine fluorescente donnée dans ces tests a été quantifié. Quatre-vingt-cinq pour cent des billes Ncad regroupaient Ncad-DsRed et 77 % regroupaient Cdo, que la Ncad exogène ait été exprimée ou non (la Ncad exogène n'est pas nécessaire car les cellules NIH 3T3 expriment une Ncad endogène abondante) (34), alors que seulement 20 % des billes Ncad GFP en cluster (Fig. 4C). De plus, les billes recouvertes de PLL se sont également attachées aux cellules NIH 3T3, mais seulement 11% de ces billes regroupaient toute protéine fluorescente, quelle que soit son identité (Fig. 4C).

Clusters de ligature Ncad Cdo, JLP, Bnip-2 et wGBD. (UNE) Les cellules C2C12 ont été cultivées à une densité cellulaire élevée ou faible, comme indiqué. Les lysats ont été immunoprécipités avec des anticorps anti-Cdo et des immunoprécipités et des lysats droits ont été transférés avec des anticorps anti-Cdo, p38 et Ncad. (B) (Supérieur) Microphotographie de billes recouvertes de Ncad attachées à une cellule qui coexprime Ncad-DsRed et Cdo-GFP. Flèche, une perle notée positive pour le regroupement de Ncad et Cdo Pointe de flèche, une perle notée négative pour le regroupement de Ncad et Cdo. (Inférieur) Photomicrographie d'une bille recouverte de Ncad attachée à une cellule qui exprime la GFP. (C) Pourcentage de billes recouvertes de Ncad qui ont regroupé la protéine fluorescente indiquée. Les valeurs sont des moyennes ± SD, m > 100 perles. *, P < 0,001 par étudiant t test. () Microphotographies de billes recouvertes de Ncad attachées à des cellules qui co-expriment Cdo non fluorescent plus JLP-GFP, Bnip-2-GFP ou wGBD-GFP. Flèche, une perle notée positive pour le regroupement de la pointe de flèche Bnip-2-GFP, une perle notée négative. (E) Pourcentage de billes recouvertes de Ncad qui ont regroupé la protéine fluorescente indiquée. Les valeurs sont des moyennes ± SD, m > 100 perles. *, P < 0.01 **, P < 0,001 avec des différences se référant à la fois au contrôle -Cdo respectif et au contrôle +Cdo/+GFP. (Barres d'échelle, 10 m.)

Les cellules NIH 3T3 expriment de faibles niveaux de Cdo (35), et le regroupement de JLP-GFP, Bnip-2-GFP et wGBD-GFP au niveau des billes Ncad dépendait largement de la coexpression de Cdo non fluorescent [Fig. 4 et E notez que les niveaux d'expression exogène de Cdo-GFP et de Cdo non fluorescent étaient similaires (Fig. S5)]. Soixante-seize pour cent, 59 % et 43 % de ces billes étaient respectivement positives pour le regroupement JLP-GFP, Bnip-2-GFP et wGBD-GFP, toutes significativement supérieures aux 20 % observées avec la GFP. Le pourcentage de billes positives pour le regroupement de Ncad-DsRed, Cdo-GFP, JLP-GFP, Bnip-2-GFP et wGBD-GFP a progressivement diminué d'une manière cohérente avec le modèle dans lequel le Ncad cellulaire se lie directement à Cdo, Cdo se lie directement à JLP et Bnip2, et wGBD se lie indirectement à Bnip-2 via Cdc42 (6, 7, 11). Les pourcentages décroissants seraient attendus si l'efficacité de chaque interaction était <100% et la liaison était spécifique (c'est-à-dire que seules les billes qui regroupaient Ncad étaient capables de regrouper Cdo, et seules les billes qui regroupaient Cdo étaient capables de regrouper JLP et Bnip-2). Lorsque le pourcentage de billes « disponibles » pour une interaction donnée est pris en compte, l'efficacité à chaque étape variait de 77 à 99 %.

Cdo se lie directement à Shh, et la capacité des billes recouvertes d'un fragment de signalisation Shh amino-terminal (ShhN)-protéine de fusion Fc à regrouper les protéines de liaison Cdo et Cdo a également été évaluée. Cinquante-six pour cent des perles ShhN regroupées Cdo, moins que vu avec les perles Ncad mais nettement au-dessus du fond GFP de 20% (Fig. 5 UNE et B). En revanche, le pourcentage de billes ShhN qui regroupaient JLP-GFP ou Bnip-2-GFP (même en présence de Cdo non fluorescent) n'était pas différent de celui observé avec la GFP seule. Par conséquent, les billes Ncad ont regroupé Cdo et ses protéines associées qui sont impliquées dans l'activation de p38, mais les billes Shh ne regroupaient que Cdo. On rapporte que Shh active la signalisation p38 dans les cultures d'astrocytes primaires (36). Cependant, conformément à son incapacité à regrouper les protéines de liaison à Cdo, la pp38 n'a pas été induite dans les myoblastes C2C12 par ShhN recombinant, alors qu'elle a été induite en réponse à un activateur de voie connu, le stress hyperosmotique (0,7 M NaCl) (Fig. 5C). Malgré l'échec à induire pp38, les cellules étaient sensibles à ShhN, comme démontré par l'activation de Gli1 expression (fig. 5).

Les billes revêtues de Shh regroupent Cdo mais pas JLP ou Bnip-2. (UNE) Microphotographies de billes recouvertes de Shh attachées à des cellules qui expriment Cdo ou co-expriment Cdo non fluorescent plus JLP-GFP ou Bnip-2-GFP. (Barre d'échelle, 10 m.) (B) Pourcentage de billes recouvertes de Shh qui ont regroupé la protéine fluorescente indiquée. Les valeurs sont des moyennes ± SD, m > 100 perles. *, P < 0,001. (C) Analyse par transfert Western de pp38 et de p38 total dans des cultures C2C12 traitées avec du ShhN recombinant (0,5 g/mL) pendant les durées indiquées. En tant que contrôle positif, les cellules ont été traitées avec du NaCl (0,7 M) pendant 20 min. () Analyse qRT-PCR de Gli1 expression dans les cellules C2C12 traitées ± ShhN (0,5 µg/mL) pendant 24 h. (E) Modèle pour l'activation de p38 stimulée par Ncad dans les myoblastes et pour Cdo en tant que corécepteur multifonctionnel. Cdo lié en cis à ligaturé Ncad existe dans un état qui permet une interaction stable avec JLP/p38 et Bnip-2/Cdc42. En revanche, Cdo lié à Shh n'interagit pas de manière stable avec ces facteurs, bien qu'il permette de transmettre le signal Shh à Ptch1, activant la signalisation canonique de la voie Hedgehog. Notez que MKK6 activé sauve le programme de différenciation défectueux causé par la perte de Cdo ou de Bnip-2, mais le rôle de MKK3/6 ou d'autres activateurs de p38 n'a pas été établi, donc un point d'interrogation accompagne leur position. Notez également que Shh lie à la fois Cdo et Ptch1, mais le complexe ternaire montré est hypothétique.

Collectivement, ces résultats relient l'adhésion cellule-cellule à base de cadhérine à une voie de signalisation définie (c'est-à-dire Cdo → p38) qui régule directement l'activité d'un programme de différenciation spécifique au type de cellule et suggèrent le modèle suivant : cadhérines, sa région intracellulaire subit un changement de conformation et/ou une modification post-traductionnelle qui permet son association stable avec Bnip-2 et JLP et, par conséquent, l'activation de p38. En revanche, de tels changements ne se produisent pas dans Cdo lorsqu'il lie Shh (Fig. 5E). Les billes recouvertes de ShhN étaient un peu moins efficaces pour regrouper Cdo que les billes recouvertes de Ncad, même si Cdo était vraisemblablement lié directement à la bille ShhN et seulement indirectement à la bille Ncad (via cis interaction avec Ncad endogène, qui a lié directement la bille). La capacité des cadhérines à se regrouper en grands complexes adhésifs (37) peut augmenter l'avidité et/ou la stabilité de l'association de Cdo et de ses partenaires de liaison au niveau de ces sites d'adhésion.

Les résultats permettent également d'établir une distinction entre les actions de Cdo en tant que corécepteur putatif pour la cadhérine et pour les voies de signalisation Hedgehog. Dans la voie Hedgehog, Cdo semble sensibiliser les cellules à un niveau donné de ligand, la signalisation se produisant via la voie canonique dépendante de Smoothened, et aucune exigence pour la région intracellulaire de Cdo (13, 35). Cependant, dans la signalisation initiée par Ncad, Cdo confère à la cadhérine une capacité de signalisation (activation de la voie p38) qu'elle ne possède pas intrinsèquement et dont l'activité dépend de la région intracellulaire de Cdo. Par conséquent, Cdo joue des rôles mécaniquement distincts dans la modulation de la sortie de signalisation de deux voies différentes : la signalisation cytoplasmique dans la voie Ncad et la liaison au ligand dans la voie Shh. De plus, la notion de corécepteur partagé soulève la possibilité d'une régulation croisée entre ces voies, comme cela peut se produire dans le développement du cortex cérébral (38). Ce concept peut également s'étendre à d'autres voies de signalisation qui partagent des composants associés à la membrane.


La petite GTPase Cdc42 initie une voie de signalisation apoptotique dans les lymphocytes T Jurkat.

L'apoptose joue un rôle important dans la régulation du développement et de l'homéostasie du système immunitaire, mais les éléments des voies de signalisation qui contrôlent la mort cellulaire n'ont pas été bien définis. Lorsqu'elle est exprimée dans les cellules T Jurkat, une forme activée de la petite GTPase Cdc42 induit la mort cellulaire présentant les caractéristiques de l'apoptose. La réponse de mort induite par Cdc42 est médiée par l'activation d'une cascade de protéine kinase conduisant à la stimulation de la kinase amino-terminale c-Jun (JNK). L'apoptose initiée par Cdc42 est inhibée par les composants négatifs dominants de la cascade JNK et par des réactifs qui bloquent l'activité de la famille des protéases ICE (caspase), suggérant que la stimulation de la cascade JNK kinase peut conduire à l'activation de la caspase. La séquence des événements morphologiques observés typiquement dans les cellules apoptotiques est modifiée en présence de Cdc42 activé, suggérant que cette GTPase peut expliquer certains aspects de la régulation du cytosquelette au cours du programme apoptotique. Ces données suggèrent un moyen par lequel les événements biochimiques et morphologiques se produisant pendant l'apoptose peuvent être régulés de manière coordonnée.


Résultats

PI(3)P et RAB-7 sont enrichis séquentiellement sur les surfaces phagosomiques

Nous avons examiné le processus de maturation de phagosomes contenant des cellules apoptotiques chez C. elegans. Auparavant, nous avons signalé le recrutement transitoire de DYN-1 et l'incorporation d'endosomes précoces, qui sont marqués avec HGRS-1, l'homologue du ver de la protéine endosomale des mammifères Hrs, à la surface des phagosomes [1]. Ici, nous avons examiné deux événements moléculaires supplémentaires sur les surfaces phagosomiques : l'accumulation de PI(3)P [19,20] et le recrutement de petites GTPase Rab7 [8]. Nous avons surveillé les deux événements dans les embryons en développement en utilisant des versions modifiées d'un protocole établi (Matériels et méthodes) [1]. In all time-lapse experiments described below, we chose to follow the engulfment and degradation of three particular apoptotic somatic cells, C1, C2, and C3, which are located near each other on the ventral side of an embryo and die almost simultaneously during embryogenesis, at approximately 330 min past the first cell division (the first cleavage) (Figure 1C(l) and 1D(a)). ABplaapppa, ABpraapppa, and ABplaapppp, three ventral hypodermal cells, engulf C1, C2, and C3, respectively (Figure 1C(f) and 1D(a)), during their extension to the ventral midline [1]. In addition, all green fluorescent protein (GFP) or monomeric red fluorescence protein (mRFP1) [21] tagged reporters were expressed specifically in engulfing cells under the control of Pced-1, les ced-1 promoter [15].

The FYVE domain of C. elegans EEA-1, in a tandem repeat, specifically associates with PI(3)P [22]. The FYVE-FYVE::mRFP1 reporter was detected primarily in cytoplasm as bright puncta, consistent with its endosomal localization (Figure 1C) [1]. The 2xFYVE markers were also evenly distributed in nuclei (Figure 1D(d)). In engulfing cells, we observed bright mRFP1 circles surrounding cell corpses (Figure 1C and 1D). Consistent results have been obtained independently [23]. In embryos that coexpressed Pced-1 ced-1::gfp et Pced-1 2xFYVE::mrfp1, CED-1::GFP, but not 2xFYVE::mRFP1, was enriched on extending pseudopods (Figure 1C). Strikingly, bright mRFP1 circles appeared on phagosomal surfaces within 4.1 ± 1.0 min (m = 16) after the closure of pseudopods (Figure 1C(d), 1C(j), and 1E), indicating that PI(3)P is specifically presented on the surface of nascent phagosomes. Whereas the CED-1::GFP signal rapidly disappeared from phagosomal surface after the enclosure of the phagocytic cup (within 8.4 ± 2.0 min, m = 17) (Figure 1C and 1E), PI(3)P remained on a phagosome until its content was completely degraded (Figure 1D and 1E). PI(3)P thus labels the surface of phagosomes for almost their entire duration.

C. elegans rab-7 encodes RAB-7, a likely ortholog of human Rab7 (Figure S1A and Text S1). In wild-type animals expressing Pced-1 gfp::rab-7, a functional GFP::RAB-7 was detected in the cytoplasm, and a portion of it is enriched on cytoplasmic puncta (Figures S1B and S3D). This punctate localization pattern is consistent with previous reports indicating that RAB-7 is localized to late endosomes and lysosomes [24,25]. In both embryos and adult hermaphrodite gonads, we observed robust GFP::RAB-7 signals around cell corpses (Figure S1C). Quantitative measurements of time-lapse images (Materials and Methods) indicated that the intensity of the GFP signal on phagosomal surfaces could reach as high as 2.5 times that in the cytosol of the same engulfing cell (Figure 1D(o)). In a time-lapse recording of embryos that coexpress GFP::RAB-7 and 2xFYVE::mRFP1, RAB-7 was recruited to the surface of a phagosome approximately 3 min after PI(3)P appeared on the same phagosome (Figure 1D and 1E). After the completion of engulfment, yet prior to the recruitment of RAB-7, a nascent phagosome appeared as a dark hole surrounded by evenly distributed GFP::RAB-7 in the engulfing cell cytoplasm (Figure 1D(h) and 1D(i)). Like 2xFYVE::mRFP1, GFP::RAB-7 persisted on the surface of a phagosome until the phagosome disappeared (Figure 1D and 1E, and Video S1).

To determine whether the enrichment of RAB-7 and PI(3)P was restricted to phagosomes containing C1, C2, and C3, we examined wild-type 1.5-fold to 2-fold stage embryos, which were at 420–460 min after first cleavage [1]. We found that 91% and 73% of cell corpses distinguished under DIC optics are labeled with GFP::RAB-7 and 2xFYVE::GFP, respectively (Figures 2C). These results indicate that both PI(3)P and RAB-7 are enriched on the surface of all phagosomes, and suggest that they may play important roles during phagosome maturation.


Cell Signaling Ligands

Typically, cell signaling is either mechanical or biochemical and can occur locally. En outre, categories of cell signaling are determined by the distance a ligand must travel. Likewise, hydrophobic ligands have fatty properties and include steroid hormones and vitamin D3. These molecules are able to diffuse across the target cell’s plasma membrane to bind intracellular receptors inside.

On the other hand, hydrophilic ligands are often amino-acid derived. Instead, these molecules will bind to receptors on the surface de la cellule. Comparatively, these polar molecules allow the signal to travel through the aqueous environment of our bodies without assistance.


Résumé

Obesity is a global epidemic that causes morbidity and impaired quality of life. The melanocortin receptor 4 (MC4R) is at the crux of appetite, energy homeostasis, and body-weight control in the central nervous system and is a prime target for anti-obesity drugs. Here, we present the cryo–electron microscopy (cryo-EM) structure of the human MC4R-Gs signaling complex bound to the agonist setmelanotide, a cyclic peptide recently approved for the treatment of obesity. The work reveals the mechanism of MC4R activation, highlighting a molecular switch that initiates satiation signaling. In addition, our findings indicate that calcium (Ca 2+ ) is required for agonist, but not antagonist, efficacy. These results fill a gap in the understanding of MC4R activation and could guide the design of future weight-management drugs.

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Cellular Communication in Yeasts

The first life on our planet consisted of single-celled prokaryotic organisms that had limited interaction with each other. While some external signaling occurs between different species of single-celled organisms, the majority of signaling within bacteria and yeasts concerns only other members of the same species. The evolution of cellular communication is an absolute necessity for the development of multicellular organisms, and this innovation is thought to have required approximately 2.5 billion years to appear in early life forms.

Yeasts are single-celled eukaryotes, and therefore have a nucleus and organelles characteristic of more complex life forms. Comparisons of the genomes of yeasts, nematode worms, fruit flies, and humans illustrate the evolution of increasingly complex signaling systems that allow for the efficient inner workings that keep humans and other complex life forms functioning correctly.

Kinases are a major component of cellular communication, and studies of these enzymes illustrate the evolutionary connectivity of different species. Yeasts have 130 types of kinases. More complex organisms such as nematode worms and fruit flies have 454 and 239 kinases, respectively. Of the 130 kinase types in yeast, 97 belong to the 55 subfamilies of kinases that are found in other eukaryotic organisms. The only obvious deficiency seen in yeasts is the complete absence of tyrosine kinases. It is hypothesized that phosphorylation of tyrosine residues is needed to control the more sophisticated functions of development, differentiation, and cellular communication used in multicellular organisms.

Because yeasts contain many of the same classes of signaling proteins as humans, these organisms are ideal for studying signaling cascades. Yeasts multiply quickly and are much simpler organisms than humans or other multicellular animals. Therefore, the signaling cascades are also simpler and easier to study, although they contain similar counterparts to human signaling. [2]

Regarde ça collection(http://openstaxcollege.org/l/bacteria_biofilm) of interview clips with biofilm researchers in “What Are Bacterial Biofilms?”


Structure, Function and Regulation of Tor Complexes from Yeasts to Mammals Part B

Malene Hansen , Pankaj Kapahi , in The Enzymes , 2010

B Autophagy

A direct link between the cellular recycling process autophagy and organismal aging was first made in C. elegans (e.g., in long-lived daf-2 /insulin/IGF-1 receptor mutants) [83] . As in yeast, TOR regulates autophagy in C. elegans, since animals with reduced levels of TOR or daf-15/Raptor heterozygotes have increased levels of autophagy [34] . Consistent with this, rapamycin also induces autophagy in C. elegans (C. Kumsta and M. Hansen, unpublished observations). This induction in autophagy is critical for the life span extension observed in animals with reduced TOR activity. For example, inactivation during adulthood of genes with autophagy functions, for example, vps-34 et bec-1, are required for daf-15/Raptor heterozygotes to live long [34] , and tor RNAi fails to extend the life span of short-lived autophagy mutants, including atg-1/unc-51 et atg-18 mutants [41] . Consistent with an overlap in mechanisms between TOR and dietary restriction, dietary-restricted animals have increased autophagy [34, 41] and require autophagy genes during adulthood to live long [34, 41, 84] . Moreover, the induction of autophagy in dietary-restricted eat-2 mutants requires the transcription factor PHA-4/FOXA [ 34 ], suggesting that autophagy is transcriptionally regulated in response to nutrients. Taken together, these data strongly suggest that TOR, as well as dietary restriction, relies on the upregulation of the autophagy process to extend C. elegans durée de vie.


Mammalian TLRs play an important role in recognizing and removing pathogenic microorganisms, mediating the production of downstream cytokines, and linking innate and acquired immunity.

With deep research, TLR signaling pathways are separated into two groups: a MyD88-dependent pathway that leads to the production of pro-inflammatory cytokines with the quick activation of NF-kappa B and MAPK, and a MyD88-independent pathway associated with the induction of IFN-&beta & IFN-inducible genes and maturation of dendritic cells with slow activation of NF-kappa B & MAPK.

TLRs are mostly located on the cell membrane and mainly sense extracellular pathogen components. TLRs mediated signaling pathways exert functions through their TIR domains. The TIR domains of these receptors (except the TLR3 receptor) can interact with the adapter MyD88 protein. The MyD88 protein further recruits IRAK family proteins. IRAK4 protein recruited into the receptor complex can phosphorylate and activate IRAK1 protein and IRAK2 protein, which promotes the oligomerization of TRAF6 protein, activating the ubiquitin ligase activity of TRAF6. TRAF6 protein, together with the E2 binding enzyme complex UBC13-UEV1A, can catalyze the polyubiquitination, activating TAK1, IKK, and MAPK.

TLR3 and TLR4 interact with TRIF by binding to their respective ligands, double-stranded RNA and lipopolysaccharide, respectively. TRIF subsequently links to TRAF6 and RIP1 proteins, activating the NF-&kappaB signaling pathway. TRIF proteins also bind to IKK-like kinases TBK1 and IKK-ɛ, phosphorylating their substrate IRF3 protein. The phosphorylated IRF3 protein forms a dimer, which enters the nucleus and assembles into an enhancer complex, together with the NF-&kappaB protein and activated transcription factor 2 (ATF2) form. The enhancer complex can induce the expression of IFN-&beta. The TLR4 signaling pathway has been well studied.

Some other TLRs such as TLR7, TLR8, and TLR9 can also induce IFN-I expression. TLR7 and TLR8 bind to viral single-stranded RNA, while TLR9 binds to unmethylated CpG DNA. After binding to the ligands, they can recruit cytoplasmic signal complexes composed of MyD88, IRAKs, and TRAF6 in the cytoplasm.


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