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Transfert horizontal de gènes et toxine botulique


Est-il théoriquement possible qu'une bactérie aérobie devienne capable de produire de la toxine botulique à la suite d'un transfert horizontal de gènes de Clostridium botulinum à cette bactérie ?


Exploitation du génome botulique

C'est une spore de Clostridium botulinum. Crédit : IFR

(Norwich BioScience Institutes) Des scientifiques de l'Institute of Food Research ont exploité le génome de C. botulinum pour découvrir de nouvelles informations sur les gènes de la toxine qui produisent la puissante toxine à l'origine du botulisme.

La toxine qui cause le botulisme est la plus puissante que nous connaissions. Manger une quantité de toxine à peine 1000 e le poids d'un grain de sel peut être fatal, c'est pourquoi tant d'efforts ont été mis en Clostridium botulinum, qui produit la toxine de notre alimentation.

L'Institute of Food Research du Norwich Research Park a participé à cet effort en étudiant les bactéries et la façon dont elles survivent, se multiplient et causent de tels dommages. Dans le cadre de nouvelles recherches, les scientifiques de l'IFR ont exploité le génome de C. botulinum pour découvrir de nouvelles informations sur les gènes de la toxine.

Il existe sept types distincts, mais similaires, de neurotoxine botulique, produits par différentes souches de C. botulinum bactéries. Différents sous-types de la neurotoxine semblent être associés à différentes souches de la bactérie. L'analyse génétique de ces gènes nous renseignera sur leur évolution.

Le Dr Andy Carter, travaillant dans le groupe de recherche du professeur Mike Peck, a utilisé les données générées par les efforts de séquençage du Genome Analysis Centre, sur le Norwich Research Park. Andy a comparé la séquence du génome de cinq C. botulinum souches, toutes du même groupe et toutes produisant le même sous-type de neurotoxine.

Comparaison de deux souches étroitement apparentées de C. botulinum. Les gènes partagés par les deux génomes sont en vert. L'ADN nouvellement introduit est représenté par l'espace entre les barres rouges qui relient les deux espèces d'ADN. Les gènes en rouge sont des clusters de neurotoxines associés, dont deux supplémentaires, numérotés 33 et 35, qui sont des vestiges des clusters de gènes de neurotoxines précédents qui ont été perturbés au cours de l'évolution du cluster actuel. Le gène numéro 12 (en noir) est la nouvelle copie du gène de réplication de l'ADN.

Une première découverte était que les cinq souches étaient remarquablement similaires dans la zone du génome contenant le gène de la neurotoxine. Cela suggère que la bactérie a récupéré le groupe de gènes en un seul événement, parfois dans le passé. Les bactéries acquièrent généralement des gènes, ou des groupes de gènes, d'autres bactéries grâce à ce transfert horizontal de gènes. C'est une façon dont les bactéries ont évolué pour partager des « armes », telles que l'activité antibiotique ou la capacité de produire des toxines. Pour en savoir plus sur comment C. botulinum a acquis sa propre arme mortelle, Andy a approfondi la séquence du génome.

Comme des fossiles d'organismes perdus depuis longtemps, Andy a trouvé, dans la même région du génome, la preuve de deux autres gènes pour produire deux des autres types de neurotoxine. Bien que ces fragments de gènes soient complètement non fonctionnels, les trouver au même endroit dans le génome que le groupe de gènes fonctionnels de neurotoxines est important car cela suggère que cette région du génome pourrait être un « point chaud » pour le transfert de gènes.

En regardant de chaque côté du groupe de gènes de neurotoxine, on a découvert plus de preuves à l'appui de l'idée du hotspot. Lorsque le groupe de gènes inséré dans le C. botulinum génome, il a coupé en deux un autre gène. Ce gène est essentiel pour que la bactérie réplique son ADN, alors pourquoi le détruire ne s'avère-t-il pas fatal ? C. botulinum n'a pas été affecté par cela car contenu dans le segment d'ADN importé était une autre version du gène haché.

Peut-être que cela nous indique la voie C. botulinum ramasse d'abord son arme mortelle. Cela devrait nous aider à nous préparer contre l'émergence de nouvelles souches, et peut même nous aider un jour à désarmer cet ennemi mortel.


Introduction

La neurotoxine botulique est responsable du botulisme, une maladie neuroparalytique grave et mortelle. C'est la toxine la plus puissante connue, avec aussi peu que 30� ng potentiellement mortelle pour un humain adulte (Peck 2009). Il existe sept types de neurotoxine botulique (types A&# x02013G), qui sont formés par l'anaérobie Gram-positif Clostridium botulinum et certaines souches de C. butyricum et C. baratii. Les neurotoxines de types A, B, E et F ont été associées à la pathologie humaine (Austin et Dodds 2000 Peck 2006). Clostridium botulinum est une espèce hétérogène qui comprend quatre bactéries phylogénétiquement et physiologiquement distinctes (C. botulinum Groupes I–IV), avec les Groupes I et II associés au botulisme humain (Austin et Dodds 2000 Peck 2009). Souches du groupe I (protéolytiques) C. botulinum forment une neurotoxine de type A, B ou F, avec de nombreuses souches portant les gènes de deux neurotoxines et, dans certains cas, formant également deux neurotoxines. Souches du groupe II (non protéolytiques) C. botulinum forment des neurotoxines de type B, E ou F, mais il n'y a actuellement aucun rapport de souches portant plus d'un gène de neurotoxine (Macdonald et al. 2011 Peck et al. 2011). Une interprétation de cette observation serait que le transfert horizontal des gènes de la neurotoxine se produit moins fréquemment dans le groupe II C. botulinum que dans le groupe I C. botulinum. Une analyse génétique récente a identifié un certain nombre de sous-types de neurotoxines, des sous-types particuliers ne se trouvant souvent que dans un seul groupe de C. botulinum (Smith et al. 2005 Hill et al. 2007 Macdonald et al. 2011 Peck et al. 2011). Par exemple, les souches du groupe II C. botulinum de type F, qui font l'objet de cette étude, portent exclusivement le gène de la neurotoxine de type F6, alors que les souches du groupe I C. botulinum le type F porte un gène de neurotoxine, qui peut être de type F1&# x02013F5, et des souches de C. baratii tous portent le gène de la neurotoxine de type F7 (Raphael et al. 2010).

La neurotoxine possède plusieurs protéines accessoires, dont les gènes sont adjacents et forment ce que l'on appelle le groupe de gènes de la neurotoxine. Il existe deux classes les Ha-cluster code pour la neurotoxine, une protéine non toxique non hémagglutinine, et trois hémagglutinines et le orf-x-cluster code pour la neurotoxine, une protéine non toxique non hémagglutinine, et quatre autres protéines (Orf-X1, Orf-X2, Orf-X3 et P47) de fonction inconnue (Hill et al. 2009 Peck 2009 Peck et al. 2011). De plus, les clusters contiennent souvent le gène d'un facteur sigma régulateur, botR. Lorsqu'ils sont localisés dans les chromosomes, les groupes de gènes de neurotoxine botulinique sont généralement flanqués de fragments d'éléments mobiles, une observation qui a soulevé la possibilité qu'ils aient pu être acquis par transfert horizontal de gènes (Sebaihia et al. 2007). Des amas de gènes de neurotoxines peuvent également être localisés sur des bactériophages (Groupe III C. botulinum) et des plasmides (groupes I, II et IV). L'acquisition horizontale de groupes de gènes de neurotoxines doit se produire relativement rarement sur une échelle de temps évolutive, étant donné que dans le groupe I, C. botulinum les groupes de gènes de neurotoxines ne se trouvent qu'à trois emplacements chromosomiques différents, et plus considérablement dans les deux groupes II C. botulinum type E et en C. butyricum type E, le groupe de gènes de neurotoxine a été inséré directement dans rarA, un gène associé à la recombinaison (Hill et al. 2009).

Des travaux récents dans notre laboratoire ont étudié la relation génétique entre les membres du groupe II C. botulinum à l'aide d'une puce à ADN du génome entier. Cette étude a étendu les observations d'autres que les souches du groupe II C. botulinum le type B et le type F sont étroitement liés mais que le groupe II C. botulinum les souches de type E forment un clade distinct (Stringer et al. 2013). Les séquences du génome de référence étaient déjà disponibles pour le groupe II C. botulinum de type B (Eklund17B) et de type E (souches Beluga et Alaska), nous avons donc décidé de séquencer le génome de chaque souche de type F de notre étude sur microarray pour expliquer cette relation étroite avec les souches de type B.


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Le gène de la neurotoxine de C. botulinum peut-il être transféré à des non-clostridies ?

Ma compréhension du transfert horizontal de gènes est qu'une partie de l'ADN d'un groupe de bactéries peut être transférée à un autre groupe. Un exemple est E. coli O104:H4 qui acquiert le gène producteur de toxine de type shiga (probablement de Shigella dysenteriae ou quelque chose comme O157 avec l'aide d'un virus [prophage]) et le gène ESBL (qui devient de plus en plus courant).

Maintenant, alors que la shigatoxine est assez dangereuse, la toxine Clostridium botulinum est encore plus dangereuse - mais c'est une bactérie anaérobie. Cependant, si un E. coli devait acquérir le gène producteur de neurotoxine, nous aurions un gros problème, n'est-ce pas ?

Est-ce possible? Si oui, dans quelles conditions cela peut-il se produire ?

La neurotoxine botulique (BoNT) peut subir un transfert horizontal de gènes, et il existe des preuves qu'elle l'a fait dans le passé - du moins chez les Clostridia. Voici un article à ce sujet, disponible gratuitement via la base de données PubMed Central.

Je suppose que, techniquement parlant, il est possible que BoNT puisse un jour être transféré à une autre espèce bactérienne. Mais vous devez vous rendre compte que, dans la nature, le transfert horizontal de gènes n'est pas aussi facile qu'on a pu le croire. La plupart des bactéries ont des moyens de détecter et de dégrader l'ADN « étranger » dont vous avez peut-être entendu parler des systèmes de modification de restriction (ce qui peut être un énorme problème en laboratoire si vous essayez de faire la navette de l'ADN entre différentes espèces bactériennes) ou de cette chose totalement géniale appelée CRISPR (dont je ne connais que très peu). Le principal avantage évolutif de ces systèmes réside probablement dans la protection des bactéries contre les infections virales et peut-être contre le transfert horizontal de gènes « dangereux » (par exemple, des produits de gène codant qui pourraient être toxiques pour la bactérie). Mais l'effet pertinent ici est que le transfert horizontal de gènes finit par être rare, en particulier entre espèces divergentes.

Pour être honnête avec vous, le moyen le plus probable pour que cela se produise serait que quelqu'un crée intentionnellement une souche productrice de BoNT non clostridienne. Ce serait TRÈS TRÈS ILLÉGAL et serait considéré comme un acte potentiel de bioterrorisme à moins que la personne effectuant cela n'ait une autorisation très spécifique du gouvernement (aux États-Unis, cela est réglementé par le ministère de la Justice et les Centers for Disease Control).


Diversité génétique parmi les souches clostridiennes productrices de neurotoxine botulinique

FIGUE. 1 . dendrogramme phylogénétique de Clostridium espèces basées sur les gènes de l'ARNr 16S. Un arbre voisin-joignant de 54 séquences rapportées dans GenBank et 36 séquences représentatives des souches de cette collection est montré. Cela illustre la diversité génétique au sein des clostridies. C. botulinum les souches se regroupent en quatre groupes distincts qui suivent la désignation du groupe I au groupe IV historiquement en fonction des caractéristiques physiologiques. Ces groupes sont dispersés parmi les 27 autres espèces clostridiennes de l'arbre. L'arbre a été construit à l'aide d'un alignement de séquences de gènes d'ARNr 16S qui contenaient 1 329 bases après élimination des colonnes contenant plus de 80 % de caractères de brèche et comprend des séquences de souches productrices de toxines bivalentes, non protéolytiques et protéolytiques. FIGUE. 2 . dendrogramme AFLP de 174 C. botulinum souches. Des fragments d'ADN générés à partir de la digestion par des endonucléases de restriction de chacun des ADN de souche ont été ligaturés dans des lieurs et amplifiés sélectivement. Quarante fragments d'ADN générés par les expériences AFLP ont été utilisés comme empreinte digitale pour représenter chacune des souches. Si 40 fragments n'existaient pas, moins de fragments ont été utilisés, comme indiqué entre parenthèses. La comparaison des empreintes digitales des 174 souches montre une grande séparation entre les souches protéolytiques (groupe I) et non protéolytiques (groupes II, III et IV) et des branches distinctes représentant les groupes I à IV. Les groupes AFLP contiennent également des sérotypes de toxines généralement distincts. La mesure de distance ou distance génétique est la proportion de fragments que deux échantillons n'ont pas en commun. FIGUE. 3 . Comparaison des séquences du gène BoNT/A. La région codante pleine longueur du gène BoNT/A dans 60 souches et six séquences GenBank ont ​​été alignées. Quatre sous-types distincts sont apparents. La plupart des souches (54 souches) sont du sous-type BoNT/A1 et quatre souches appartiennent au sous-type BoNT/A2. Deux sous-types nouvellement identifiés, BoNT/A3 et BoNT/A4, contiennent chacun un membre : la souche A254 (Loch Maree) et la souche bivalente Ba207, respectivement. Ces souches présentent des variations de séquence significatives par rapport aux sous-types BoNT/A1 et A2. FIGUE. 4 . Graphique de similarité comparant les séquences de sous-type BoNT au sous-type BoNT/A2. Séquences BoNT des sous-types BoNT/A1, A3 et A4 et BoNT/B1 et chinois C. butyricum Les BoNT/E ont été comparées à la séquence BoNT du sous-type BoNT/A2 Kyoto-F (numéro d'accès GenBank X73423). Ce graphique montre que le sous-type BoNT/A2 est à environ 99 % identique au sous-type BoNT/A1 (A142) jusqu'aux nucléotides 1 à 1146 et à environ 99 % identique au sous-type BoNT/A3 (A254) jusqu'aux nucléotides 1147 à 3450. Cela suggère que le sous-type BoNT/A2 est le résultat d'un événement de recombinaison entre les lignées BoNT/A1 et BoNT/A3 de séquences génétiques. FIGUE. 5 . Comparaison des séquences des gènes BoNT/B. Les régions codantes pleine longueur du gène BoNT/B dans 53 souches et sept séquences GenBank ont ​​été alignées. Quatre groupes distincts qui incluent les sous-types BoNT/B1 et BoNT/B2 et bivalents (Ab149, Ba207, Bf258 et Bf698) et non protéolytiques BoNT/B sont apparents. La plupart des souches sont du sous-type BoNT/B2, 16 souches étant du sous-type BoNT/B1. La souche B506 est distincte des autres souches BoNT/B2 et représente une variation nouvellement identifiée dans ce sérotype. FIGUE. 6 . Comparaison des séquences des gènes BoNT/E. Les régions codantes pleine longueur du gène BoNT/E dans 21 souches et 15 séquences GenBank ont ​​été alignées, ce qui a donné cinq grappes étiquetées E1 à E5. Deux clusters contiennent des séquences de C. butyricum Souches BoNT/E collectées en Italie (E It. butyr.) ou en Chine (E Ch. butyr.). Les autres sous-types comprennent BoNT/E1 et E2 et un sous-type nouvellement identifié, étiqueté BoNT/E3, contenant quatre membres (E185, E540, E545 et E549). FIGUE. 7 . Comparaison des sept sérotypes différents des séquences du gène BoNT. Est montré un alignement voisin-joignant des régions codant des nucléotides des sept gènes BoNT (A à G), y compris la toxine tétanique. La comparaison des gènes BoNT montre une relation des sérotypes différente de celle trouvée sur la base des gènes de l'ARNr 16S ou de l'analyse AFLP. Des souches non protéolytiques et bivalentes (Ba207 et Ab149) et des représentants des différents sous-types sont inclus.

Caractérisation génétique de la résistance thermique exceptionnellement élevée du substitut non toxique Clostridium sporogènes PA 3679

Clostridium sporogènes Le PA 3679 est un formateur d'endospores non toxique qui est largement utilisé comme substitut pour Clostridium botulinum par l'industrie agroalimentaire pour valider les stratégies de traitement thermique. Le PA 3679 produit des spores d'une résistance à la chaleur exceptionnellement élevée sans neurotoxines botuliniques, ce qui permet l'utilisation du PA 3679 dans les études d'emballages inoculés tout en garantissant la sécurité des installations de transformation des aliments. Pour identifier les gènes associés à cette résistance à la chaleur, les génomes de C. sporogènes Les isolats PA 3679 ont été comparés à plusieurs autres C. sporogènes souches. La différence la plus significative a été l'acquisition d'un deuxième spoVA opéron, spoVA2, qui est responsable du transport de l'acide dipicolinique dans le noyau de la spore pendant la sporulation. De façon intéressante, spoVA2 a également été trouvé dans certains C. botulinum espèces qui se regroupent phylogénétiquement avec PA 3679. La plupart des autres C. sporogènes les souches examinées n'ont pas toutes les deux spoVA2 locus et sont phylogénétiquement distants au sein du groupe I Clostridium, ajoutant à la compréhension que C. sporogènes sont dispersés C. botulinum souches dépourvues de gènes de toxine. C. sporogènes les souches sont donc un groupe très éclectique, et peu de souches possèdent la résistance thermique caractéristique du PA 3679.

Mots clés: Clostridium botulinum Clostridium sporogenes PA 3679 SpoVA acide dipicolinique stérilisation alimentaire transfert horizontal de gènes spores résistance à la chaleur.


Résultats

Nous présentons d'abord le sous-modèle de croissance de la population qui a été précédemment introduit dans [44], puis montrons comment celui-ci est couplé au sous-modèle de régulation génique. Le modèle final résultant de l'union des deux sous-modèles est codé dans COPASI et des simulations sont utilisées pour illustrer la capacité à reproduire un ensemble sélectionné de résultats expérimentaux supplémentaires.

Un modèle de croissance de la population régulé en fonction des nutriments et du quorum

Détails d'un modèle de calcul pour la croissance d'une population de C. botulique Des cellules du groupe I de type A1 en culture ont été rapportées par [44]. Comme expliqué en détail dans [44], la justification de la nécessité de modéliser la dynamique des populations est enracinée dans la corrélation observée expérimentalement entre la phase de croissance bactérienne et le processus de production de toxines. D'autres preuves soutenant cette corrélation au niveau de la régulation génétique sont décrites dans la section sur le modèle moléculaire de la régulation de la synthèse de BoNT.

La modélisation mathématique de C. botulique cultures repose sur une compartimentation de la population croissante de cellules en trois groupes distincts :

Cellules adaptatives, notées AC, qui comprend les cellules bactériennes après leur ajout au milieu de croissance botulinique. Bien que les processus métaboliques impliqués restent à établir, ils peuvent être similaires à ceux rapportés dans Salmonelle [63]

Cellules reproductrices, désignées par RC, formées par les cellules qui se reproduisent activement

Cellules sporulantes, désignées par SC, qui se composent des cellules engagées dans la sporulation (bien que non mesurées dans [59]).

La population initiale de C. botulique Les cellules sont entièrement composées de cellules AC, qui évoluent plus tard en RC et peuvent s'engager dans la sporulation et devenir des SC. Ces processus sont influencés par certaines espèces biochimiques appelées génériquement “Signal”, comme le montre la figure 1 . Un développement futur, non inclus actuellement, est d'étendre la présente analyse pour commencer avec les spores bactériennes et donc d'incorporer des étapes pour la germination et l'excroissance des spores [64].

Représentation schématique du meilleur modèle d'ajustement déterminé dans [44]. La reproduction des cellules est contrôlée par l'abondance des nutriments N, et la sporulation est régulée par la concentration d'un signal de détection de quorum S.

Différentes hypothèses relatives à la nature du ou des “signal(s)” (précédemment décrites dans [44]) ont conduit à discriminer des scénarios de modélisation plausibles et ont été utilisées pour générer des modèles correspondants qui ont ensuite été évalués sur leur capacité à reproduire les modèle de croissance observé pour C. botulique type A1 souche ATCC 19397.

Nous avons constaté qu'un modèle dans lequel deux sources de signaux distinctes étaient considérées, la première étant déterminée par l'abondance des nutriments essentiels à C. botulique la croissance cellulaire, que nous avons désignée par l'espèce abstraite N, et un second produit de manière endogène par les cellules bactériennes et utilisé comme signal de détection de quorum, noté par S–a mieux réussi à expliquer le modèle de croissance observé pour C. botulique souche de type A1 ATCC 19397. Une représentation schématique de cette option de modélisation est incluse dans la figure 1 . Dans ce modèle, le taux de reproduction cellulaire augmente avec la concentration en nutriments, N, tandis que le taux de sporulation augmente avec la concentration du signal chimique S. Le modèle proposé dans [44] a été codé à l'aide de huit réactions. Nous considérons ici une version mise à jour, toujours basée sur la même logique, qui est encodée par les six réactions répertoriées dans le tableau A du fichier d'informations à l'appui 1 (tableau A dans le texte S1). Comme indiqué précédemment dans la figure 6 de [44], ce modèle produit un bon ajustement pour les données expérimentales de croissance générées pour la souche ATCC 19397.

Modèle moléculaire de la régulation de la synthèse de BoNT

Plusieurs stimuli environnementaux ont été identifiés avec une régulation positive et négative de la production de toxines dans C. botulique Groupe I type A1. Il a été rapporté que la production de neurotoxines est associée à la transition de cultures en phase exponentielle tardive à des cultures en phase stationnaire précoce. Ceci est indiqué par un pic du niveau d'expression des groupes de gènes de neurotoxines qui est clairement observable dans la phase tardive exponentielle à stationnaire précoce des cultures et qui diminue considérablement au cours de la phase stationnaire ultérieure (comme le montre la figure 2). De plus, les profils d'expression de tous les gènes, à la fois dans le ntnh/bon et le Ha opéron, montrent une corrélation équivalente avec la dynamique des populations (données disponibles dans [26], [21], [22] and [23]). Cela indique des éléments régulateurs qui lient la croissance démographique à la toxigénèse dans C. botulique tapez A1.

Données issues des résultats expérimentaux publiés dans [26], [21], [22] and [23] pour C. botulique souches de type A1 ATCC3502, Hall A-hyper, Hall A et Hall A respectivement. Notez que les loci de toxines de ces trois souches sont génétiquement identiques les uns aux autres [9]. Comparaison des évolutions temporelles mesurées en densités optiques pour les cultures (à gauche) et la comparaison des bonté cours du temps d'expression des gènes (à droite). Données normalisées à la DO maximale (à gauche) et au niveau d'expression maximal (à droite) du cours temporel d'origine unique.

BotR comme régulateur positif de la synthèse de BoNT

Les neurotoxines botuliques sont produites sous la forme d'un complexe contenant la neurotoxine elle-même et une ou plusieurs protéines auxiliaires non toxiques qui protègent la neurotoxine du stress environnemental et facilitent son absorption [65]. Une majorité de toxines de type A1 sont complexées avec la protéine non toxique non hémagglutinante (NTNH) et trois hémagglutinines (HA17, HA33 et HA70) [26,40]. Les gènes codant pour ces protéines sont organisés en deux opérons, à savoir le ntnh-bon et Ha opérons [21], et le botR gène peut être trouvé entre les deux.

Les botR gène code pour une protéine de 21-22 kDa (BotR), un facteur sigma alternatif avec les caractéristiques d'une protéine de liaison à l'ADN (c'est-à-dire un point isoélectrique hautement basique et un motif hélice-tour-hélice [17]). BotR apparaît comme un régulateur positif clé pour la ntnh-bon et Ha opérons. En effet, les deux opérons ont des séquences promotrices de base consensus -10 et �, qui sont reconnues par BotR, qui se lie spécifiquement à la région promotrice du ntnh-bon et Ha opérons et dirige l'ARN polymérase (RNAP) pour transcrire les deux opérons [66]. Les botR gène est transcrit dans la même orientation que bonté, et BotR a été caractérisé comme un activateur transcriptionnel de ntnh-bon et Ha gènes basés sur botR surexpression ou inhibition partielle par l'ARNm antisens dans C. botulique Groupe I type A1 [17,30,66]. BotR peut également cibler son propre promoteur, mais l'initiation de la transcription n'a pas pu être observée in vitro [67].

Sur la base de ces preuves, BotR est inclus dans le modèle couplé en tant que régulateur positif direct de la toxigénèse ainsi qu'en tant que régulateur positif de lui-même.

Les TCS comme régulateurs positifs et négatifs de la synthèse de BoNT

Les expériences rapportées par [30] se sont concentrées sur les éléments régulateurs de la toxine dans le génome de C. botulique Groupe I type A1 souche Hall. Dans cette étude, les auteurs ont d'abord identifié un nombre considérable (30 au total) de paires de gènes codant pour des systèmes à deux composants (TCS) qui affectaient la régulation des toxines. Les TCS sont largement utilisés dans le couplage stimulus-réponse bactérien pour détecter et relayer une variété d'indices environnementaux et de développement qui affectent l'activation des gènes. Un TCS se compose d'une histidine kinase liée à la membrane, qui détecte un stimulus spécifique, et d'un régulateur de réponse qui a généralement les caractéristiques d'une protéine de liaison à l'ADN pour médier l'expression d'un ensemble de gènes cibles [68]. Le signal est relayé du composant capteur au régulateur de réponse via une transphosphorylation. Le rôle des candidats TCS a été exploré par [30] en utilisant le silençage de l'ARNm antisens pour déterminer lesquels agissaient principalement sur les opérons de la toxine. La recherche a conduit à l'identification de trois TCS qui se sont avérés réguler positivement la production de toxines. Ces résultats indiquent (veuillez noter que nous utiliserons les numéros équivalents CBO identifiés pour la souche ATCC3502) :

Les trois TCS qui régulent positivement la production de toxines sont codés par les paires de gènes cbo_1042/cbo_1041, cbo_1967/cbo_1968, et cbo_0608/cbo_0607

Les effets des trois TCS sont indépendants de celui du BotR, puisque l'expression de botR n'est pas significativement affecté par le silençage de l'ARNm

Il a été suggéré que le TCS CBO0608/CBO0607 est homologue aux TCS de la famille PhoP/PhoR impliqués, mais sans s'y limiter, dans la détection et la réaction à la privation de phosphate.

Ces résultats expérimentaux nous ont conduit à inclure deux mécanismes de régulation positifs distincts dans notre modèle : un premier qui modélise l'effet du CBO0608/CBO0607 TCS, que nous supposons détecter et réagir au manque de nutriments, et un second (constitué de les deux espèces CBO_SHK/CBO_RR) qui représentent de manière abstraite les deux TCS CBO_1042/CBO_1041 et CBO_1967/CBO_1968, que nous avons supposés être activés par l'augmentation de la concentration des molécules quorum-sensing.

De plus, la première preuve rapportée d'une régulation négative de C. botulique La synthèse de la toxine du groupe I de type A1 a été fournie par Zhang et al. [31], qui ont montré que le TCS CBO_0787/CBO_0786 régule négativement la production de toxines dans la souche ATCC 3502. Les résultats expérimentaux [31] les plus pertinents pour le modèle couplé sont :

L'expression des composants TCS CBO_0787 et CBO_0786 dépend de la phase de croissance avec un niveau d'expression constant précédant l'entrée dans la phase exponentielle tardive suivie d'une réduction ultérieure d'environ 80 %

Les cbo0787 et cbo0786 les gènes sont transcrits polycistroniquement

Le CBO_0786 phosphorylé régule négativement la production de toxines, en se liant directement au site -10 conservé des régions promotrices centrales de ntnh-bon et Ha opérons bloquant ainsi la transcription dirigée par BotR.

Sur la base de ces preuves expérimentales, nous pouvons déduire, et inclure dans le modèle couplé, un rôle pour le CBO_0787/CBO_0786 TCS en tant que régulateur négatif direct de la toxigénèse, le CBO_0786 phosphorylé agissant comme l'espèce exerçant la répression par liaison directe aux promoteurs du gène de la toxine .

Voies métaboliques et de détection du quorum liées à la nutrition en tant que régulateurs de la BoNT

Jusqu'à présent, nous avons identifié des éléments pour la construction du modèle sans identifier les mécanismes spécifiques de couplage, c'est-à-dire l'initiation de la réponse. Des preuves expérimentales indiquent que la production de neurotoxine botulinique est affectée par la disponibilité de diverses sources de carbone et d'azote. De nombreux travaux de recherche [21�,26,59] ont quantifié l'effet des nutriments sur la production de toxines. La disponibilité des éléments nutritifs est déjà incluse dans l'élément de dynamique de population du modèle couplé et, en outre, nous émettons l'hypothèse que l'abondance des éléments nutritifs régule également directement la toxigénèse.

Un rapport récent de Zhang et ses collègues [29] a démontré le rôle de la protéine régulatrice globale CodY dans la synthèse des toxines et des éléments de cette observation soutiennent une image plausible des effets liés à la nutrition sur la toxigénèse chez C. botulique Groupe I type A1 :

CodY est capable de se lier à la région promotrice de la ntnh/bon opéron

L'affinité de liaison de CodY pour les régions promotrices de ntnh/bon l'opéron augmente dans les conditions riches en GTP

codY les souches mutantes présentent des niveaux d'expression réduits de bonté (environ 50 % de moins) par rapport au type sauvage

Le modèle temporel d'expression de bonté est le même dans codY souches mutantes et type sauvage

Deux régions de liaison putatives, chacune avec trois mésappariements avec le motif de liaison CodY consensus, se trouvent en amont de l'opéron CBO_0787/CBO_0786.

Les points 3 à 5 impliquent que le rôle global de CodY est d'activer la production de toxines. Cependant, les points 1 et 2 impliquent tous deux que l'effet de CodY est maximal sur l'opéron lorsque la disponibilité des nutriments est élevée, c'est-à-dire lorsqu'aucune toxine n'est produite. Par conséquent, la liaison de CodY aux promoteurs de ntnh/bon l'opéron doit exercer un effet de répression sur la transcription. C'est-à-dire que l'effet d'activation de CodY doit être le résultat d'une régulation supplémentaire exercée par CodY. Ensemble, cela signifie que CodY peut réprimer le répresseur TCS CBO_0787/CBO_0786 en se liant directement au promoteur TCS. Pour cette raison, chez un mutant CodY, l'effet de répression de CBO_0787/CBO_0786 ne serait pas libéré et l'expression des gènes de la toxine est réduite. Le point 4 de la sous-section sur les TCS en tant que régulateurs positifs et négatifs de la synthèse de BoNT indique que cet effet de répression de CodY doit être exercé après la phase exponentielle tardive.

Nous avons effectué une analyse séquentielle des botR région promotrice et a trouvé une région de liaison putative supplémentaire pour CodY, avec quelques similitudes notables avec les motifs de séquence et une séquence de liaison à CodY associée précédemment identifiée dans le promoteur régulé par CodY d'un autre C. botulique Gène ATCC 3502 [69]. Ceci est donc cohérent avec l'hypothèse selon laquelle CodY régule l'expression du facteur sigma alternatif BotR (voir également Supporting Information File 3 pour plus de détails (texte S3)). Puisque nous savons que botR l'expression est également dépendante de la phase, nous faisons l'hypothèse que CodY régule positivement BotR, de sorte que lorsque le ou les nutriments disponibles diminuent, CodY commence à exercer un effet d'activation sur le botR transcription des gènes. En conséquence, nous supposons dans notre modélisation que CodY régule la toxigénèse via deux voies, activation et répression, dans des phases distinctes de la croissance de la population.

Pour la modélisation, nous supposons l'existence de deux formes/comportements distincts de CodY, l'une que nous avons nommée CodY1, qui prévaut lorsque les nutriments disponibles sont élevés, et l'autre que nous avons nommée CodY2, qui s'accumule lorsque les nutriments sont rares. La transition entre les deux formes est régulée par la quantité de nutriment(s). Dans le modèle, CodY1 réprime le ntnh/bon l'opéron, tandis que CodY2 réprime l'opéron CBO_0787/CBO_0786 et régule à la hausse le botR transcription des gènes. Nous ne modélisons pas le mécanisme sous-jacent aux deux comportements proposés de CodY, mais cela pourrait impliquer la présence/l'absence d'un cofacteur lié ou des interactions avec, ou le recrutement de différents composants activateurs/répresseurs.

Le TCS CBO_0787/CBO_0786, dont l'expression est régulée par CodY2, est activé par phosphorylation de l'histidine kinase CBO_0787 en réponse à un signal inconnu. On suppose dans le modèle que le signal est relayé indirectement par le(s) nutriment(s), et donc par les espèces modélisées N. De plus, étant donné que le TCS CBO0608/CBO0607 est supposé être impliqué, mais sans s'y limiter, dans la détection et la réaction à la privation de phosphate [30], nous avons placé sa régulation sous le contrôle du ou des nutriments, en supposant que la phosphorylation de l'histidine kinase CBO0608 est réprimée par des espèces modélisées N.

Les détails moléculaires de la voie de détection du quorum régulant la production de toxines dans C. botulique Les souches du groupe I de type A1 n'ont pas encore été clarifiées. Ce que l'on sait des travaux rapportés dans [28] est que le génome comprend deux régions, agrD1 et agrD, qui code pour les homologues du Staphylococcus aureus système de détection de quorum de type agr. De plus, les auteurs [28] ont démontré que dans l'organisme étroitement apparenté C. sporogènes, le schéma d'expression des gènes dans les régions correspondantes est fortement corrélé à la phase de croissance : c'est-à-dire qu'il augmente tout au long de la croissance exponentielle, culminant à la fin de la phase exponentielle, et chute considérablement une fois la phase stationnaire atteinte. Les auteurs ont montré que, l'inactivation insertionnelle des gènes dans le agrD1 et agrD2 régions dans C. botulique Le groupe I type A1 (souche ATCC 3502) a entraîné une réduction des quantités de toxine produites. Plus précisément, l'inactivation d'agrD1 a conduit à une réduction marquée de la production précoce de toxine, avec un retour à des niveaux de type sauvage pendant la phase stationnaire tardive, tandis que l'inactivation d'agrD1 a conduit à une restriction plus sévère de la production de toxine qui persiste dans toute la population. croissance.

Bien que ces preuves expérimentales indiquent clairement un rôle du quorum-sensing dans la toxigénèse, les informations disponibles ne sont pas suffisantes pour faire des hypothèses sur les options de modélisation possibles concernant les voies qui relient le quorum-sensing à l'expression des gènes. Nous avons cependant décidé d'inclure l'action du quorum-sensing dans le sous-modèle d'expression génique de manière abstraite. Nous faisons l'hypothèse que les TCS CBO_1042/CBO_1041 et CBO_1967/CBO_1968 régulent positivement la synthèse des toxines, détectent et réagissent aux changements de concentration d'un quorum-sensing. signal, représentées comme espèces modélisées S dans le sous-modèle de population de la section sur les éléments nutritifs et le modèle de croissance démographique régulé par détection de quorum.

Modèle informatique

Dans le modèle intégré, nous incluons les mécanismes de régulation connus contrôlant la production de toxines, mais pas les détails de l'assemblage ou de la sécrétion de la toxine, ni d'autres processus encore à déchiffrer complètement. De plus, nous limitons la portée du modèle à la synthèse des neurotoxines (c'est-à-dire la protéine BoNT), et non à un complexe (sans les protéines associées, NTNH, les HA et leurs interactions). Même si ces simplifications ont été faites afin d'éviter l'introduction d'un grand nombre de paramètres cinétiques inconnus, il est important de noter que NTNH, qui est transcrit polycistroniquement à partir du ntnh-bon opéron, est soumis à la même réglementation que BoNT. En ce qui concerne la Ha opéron, il est également régulé transcriptionnellement par BotR, ainsi que par les trois TCS régulateurs positifs comme indiqué dans [30], et le TCS régulateur négatif, comme indiqué dans [31]. Ainsi, nous supposons que les ANTP présenteraient le même schéma d'expression que BoNT.

Le modèle intégré inclut la synthèse et l'exportation de BoNT en tant que processus unique, et suppose un délai d'exportation vers le surnageant de culture.

Le modèle comprend la transcription de chaque espèce pour laquelle le processus de synthèse est connu pour être régulé, c'est-à-dire les protéines CBO_0787/CBO_0786, le facteur sigma alternatif BotR et le bonté gène. Pour ces espèces, la transcription et la traduction sont modélisées ensemble, pour éviter d'introduire trop de paramètres cinétiques inconnus dans le modèle. Tous les processus de synthèse sont régulés par l'abondance de nutriment(s) (espèces modélisées N). En l'absence d'informations disponibles sur la régulation de l'expression des protéines des TCS, CBO_1042/CBO_1041 et CBO_1967/CBO_1968, nous n'incluons pas leurs processus de synthèse dans le modèle. Au lieu de cela, nous supposons une concentration constante des protéines constitutives qui changent entre leurs formes non phosphorylées et phosphorylées en fonction de l'abondance des régulateurs. De même, le modèle n'inclut pas le processus de synthèse pour CodY.

Enfin, nous incluons dans le modèle intégré une réaction de dégradation pour chaque espèce synthétisée, c'est-à-dire pour CBO_0786, CBO_0787 (et leurs formes phospho), BotR et BoNT. Le modèle informatique intégré pour le réseau d'expression génique qui régule la production de BoNT est illustré à la figure 3 . Par souci de clarté, les réactions de dégradation ne sont pas représentées. Le modèle d'expression génique représente la machinerie moléculaire qui régule la toxigénèse à l'intérieur de chaque cellule bactérienne. La partie intérieure de la cellule est enfermée dans la forme en forme de tige de la figure 3 , et le N (nutriments) et S (quorum-signal) les espèces modélisées sont partagées avec le sous-modèle de population.Nous utilisons la même notation de lignes pointillées et pleines que précédemment pour distinguer les réactions de régulation et de transfert de masse.

(En haut à gauche) montrent le rôle du facteur sigma BotR et des trois TCS censés réguler positivement la toxigénèse dans C. botulique Souche de type A1 du groupe I, avec le régulateur TCS négatif. (En haut à droite) notre hypothèse sur la façon dont la disponibilité des nutriments (espèce N) régule directement et indirectement (via CodY) la production de toxines, et comment le signal de détection de quorum (espèce S) ainsi que les deux régulateurs TCS positifs, reconnaissent le quorum-sensing voie dont l'effet sur la production de toxines a été observé expérimentalement dans les travaux de Cooksely et ses collègues [28]. (En bas), les flèches en pointillés représentent les mécanismes de régulation, tandis que les lignes pleines modélisent les réactions de transfert de masse. Les espèces N (nutriments) et S (signal de détection de quorum) sont partagées avec le sous-modèle de population. L'état de chaque cellule bactérienne est supposé être le même. Les espèces CBO_0786, CBO_0787 (et leurs formes phospho), BotR et BoNT sont sujettes à dégradation (réactions non représentées graphiquement).

Pour compléter la définition du modèle il est nécessaire de préciser, en termes d'interactions moléculaires, les effets de répression et d'activation sur les processus de synthèse du régulateur négatif CBO0787/CBO0786 TCS et du facteur sigma alternatif BotR ainsi que l'impact sur le ntnh/bon opéron.

Nous abordons cette tâche de modélisation en représentant explicitement comme variables du modèle l'état des promoteurs. Le promoteur du TCS régulateur négatif (nommé prCBOi) est supposé être dans l'un des deux états suivants : inhibé par l'espèce CodY2, ou actif, comme illustré sur la figure 4A . Le promoteur de BotR, appelé prBR dans le modèle, a trois états d'activation différents : un état initial, (qui peut exprimer un niveau basal de synthèse où prBR n'est activé par aucun facteur de transcription), un deuxième état dans lequel BotR est lié à prBR et agit comme un auto-activateur, et un troisième état dans lequel CodY2 se lie à prBR à côté du BotR déjà lié. En modélisant l'activité du promoteur, nous avons supposé que les protéines régulatrices positives, c'est-à-dire CodY2 et les formes actives de CBO_0607 et CBO_RR, agissent comme des cofacteurs de la transcription, augmentant la stabilité de la machinerie de transcription et donc le taux de synthèse. La figure 4B illustre les différents niveaux d'activation du prBR promoteur, chacun associé à une vitesse de synthèse distincte.

La synthèse du TCS régulateur négatif, du facteur sigma alternatif BotR et de la protéine BoNT est régulée par des espèces inhibitrices et activatrices. (UNE) montre les deux états possibles de prCBOi, le promoteur de la transcription polycistronique des protéines CBO0787/CBO0786 (B) illustre les trois états actifs possibles de prBR, le promoteur de BotR (C) détaille les états possibles du ntnh-bon promoteur d'opéron prBA: inactif, lorsqu'il n'est pas lié, inhibé par CodY1 et/ou phosphorylé CBO_0786 inhibe la transcription, et activé, par BotR et subséquemment par CBO_RR phosphorylé et/ou phosphorylé CBO_0607 pour augmenter les niveaux d'activation.

L'activité des promoteurs de la ntnh/bon opéron (prBA) est modélisé de manière similaire, mais les multiples régulateurs positifs et négatifs qui affectent la synthèse de BoNT donnent lieu à beaucoup plus d'états, comme le montre la figure 4C. prBA est modélisé comme étant inactif, c'est-à-dire incapable d'initier la synthèse, si un régulateur positif n'y est pas lié. C'est-à-dire que si l'espèce régulatrice négative CodY1 et CBO0786 phosphorylé se lient à prBA, la synthèse est inhibée (formes complexes de gauche illustrées sur la figure 4C). Le modèle suppose également que le CBO0786 phosphorylé est un inhibiteur plus puissant que CodY1, et que la force d'inhibition est maximale lorsque les deux inhibiteurs sont liés à prBA. Les formes actives du prBA sont représentés dans la partie droite de la figure 4C. Ici, nous supposons que prBA peut être activé de trois manières : par la liaison de BotR seul, par la liaison combinée de BotR, d'un CBO_RR phosphorylé et d'un CBO_0607 phosphorylé ou par la liaison simultanée de BotR et à la fois de CBO_RR phosphorylé et de CBO_0607 phosphorylé, les plus grands complexes étant plus actifs que les petits complexes. La logique sous-jacente à cette modélisation est que le CBO_RR phosphorylé et le CBO_0607 phosphorylé jouent le rôle de facteurs de co-transcription, stabilisant la machinerie de transcription et augmentant le taux de transcription du prBA qui nécessite également le facteur sigma alternatif BotR pour l'initiation de la transcription.

Le modèle global d'expression génique correspond à un ensemble de 49 réactions qui sont répertoriées dans le tableau B du fichier d'informations à l'appui 1 (tableau B dans le texte S1). L'état initial de l'ensemble du modèle, ainsi que les détails des taux cinétiques du réseau de régulation génique et des sous-modèles de population, sont fournis dans le fichier d'informations à l'appui 2 (texte S2).

Le modèle informatique est capable de reproduire des résultats expérimentaux supplémentaires

Dans cette section, nous exposons la procédure utilisée pour calibrer les paramètres du modèle, puis procédons à la validation du modèle en vérifiant les caractéristiques de la toxigénèse qui ont été rapportées précédemment dans les sections sur le modèle de croissance de population régulé par les nutriments et le quorum et le modèle moléculaire de la synthèse de BoNT. régulation.

Pour trouver des valeurs appropriées pour les paramètres du modèle, nous avons utilisé les données expérimentales de [59] pour la souche de type A1 ATCC 19397, que nous avons considérée comme l'organisme de « type sauvage » aux fins de notre modélisation (WT, ci-après). L'évolution temporelle expérimentale de la taille de la population (mesurée en UFC/ml au cours du temps dans [59]) fournit les paramètres du sous-modèle de population, c'est-à-dire les paramètres cinétiques des réactions (1) à (6) fournis dans le tableau A de Fichier d'information 1 (tableau A dans le texte S1). La quantité de toxine dans le surnageant mesurée dans la même expérience dans [59] (mesurée en MLD50/ml au fil du temps) fournit les données pour ajuster le sous-modèle d'expression génique, c'est-à-dire la cinétique des réactions (1) à (49) répertoriées dans le tableau B du fichier d'informations à l'appui 1 (tableau B dans le texte S1). Les paramètres du modèle sont indiqués dans le fichier d'informations à l'appui 2 (texte S2).

Le modèle ajusté est comparé aux données expérimentales WT sur les figures 5A et 5B. Les points de données expérimentales sont représentés sous forme de cercles vides, tandis que le modèle informatique est présenté sous forme de lignes continues. Il existe une correspondance inévitable entre les résultats du modèle et les données expérimentales de « formation du modèle », qui est confirmée par l'analyse de la corrélation. Pour la population, une mesure de R 2 est de 0,975 tandis que pour la production de toxines, elle est de 0,95.

(A) montre la dynamique de la population, où les mesures des données sont en UFC/ml au fil du temps, tandis que (B) illustre la quantité de toxine dans le surnageant. Dans les deux graphiques, les points de données expérimentales sont dessinés sous forme de cercles, tandis que les données prédites par le modèle sont présentées sous forme de lignes continues.

Après avoir ajusté les paramètres du modèle pour s'adapter au comportement observé WT, nous avons procédé à la validation du modèle, en évaluant sa capacité à reproduire les comportements observés expérimentalement dans les différents C. botulique souches mutantes que nous avions considérées dans l'étude. Nous avons examiné quatre mutations différentes, qui sont mises en œuvre dans le modèle WT exclusivement en changeant l'état initial du modèle, c'est-à-dire sans aucun changement dans la cinétique des réactions. Les mutants que nous avons considérés pour les besoins de notre validation sont les suivants :

Les cbo0786 mutant construit par inactivation insertionnelle dans Zhang et al., 2013 [31], est désigné comme modèle C786_M, et adressé en définissant la valeur initiale du prCBOi variable à zéro.

Les codY mutant construit par inactivation insertionnelle dans Zhang et al., 2014 [29], est désigné comme modèle CODY_M, et adressé en réglant les valeurs initiales des variables CodY1 et CodY2 à zéro.

Les mutants Hall/707 et Hall/714, construits par insertion de souches d'ARNm anti-sens d'ADN pour les deux TCS régulateurs positifs CBO_1042/CBO_1041 et CBO_1967/ CBO_1968 à Connan et al., 2012 [30], désigné comme modèle RR_M, et adressé en fixant la valeur initiale de la variable CRR à zéro.

Le mutant Hall/1146, construit par l'insertion de souches d'ARNm anti-sens d'ADN pour le TCS régulateur positif CBO_0608/CBO_0607 dans le Connan et al., 2012 [30], est désigné comme modèle C607_M, et adressé en réglant la valeur initiale attribuée à la variable CBO_0607 à zéro.

Pour chaque mutant, nous obtenons et rapportons les prédictions de la toxigénèse (modèle et quantité de BoNT) à la fois du modèle WT et du modèle mutant. Ensuite, nous examinons la relation entre les prédictions du modèle et les résultats expérimentaux pour déterminer la capacité des modèles à reproduire des preuves en laboratoire humide.

Comparaison avec le mutant cbo0786

Nous résumons dans le tableau 1 les résultats rapportés dans la figure 4 (panneau supérieur) et 5A de Zhang et al., 2013 [31] pour C. botulique souche ATCC 3502, que nous appelons de type sauvage (poids), et pour le cbo0786 mutant, que nous appelons muet. Dans les expériences de Zhang et al., l'expression relative de la bonté et la quantité de neurotoxine dans le surnageant sont quantifiés à trois moments : phase de croissance mi-exponentielle (ME, environ 4 heures), croissance exponentielle tardive (LE, environ 7 heures) et au début de la phase stationnaire (ES , environ 10 heures).

Tableau 1

Données pour bonté expression génique et concentration de toxine surnageante de C. botulique ATCC 3502 (poids) et cbo0786 mutant (muet), mesurée aux phases mi-exponentielle (ME), tardive-exponentielle (LE) et précoce-stationnaire (ES).

Expression relative de bonté (ELISA, normalisé à 16S rn)Neurotoxine dans le surnageant (DO à 405 nm)
poidsmuetpoidsmuet
MOI0.851.600.650.88
LE2.607.700.380.90
ES2.104.500.391.50

Nous comparons les prédictions de nos modèles avec les résultats expérimentaux en montrant, sur la figure 6A, une représentation graphique des données recueillies par Zhang et al., 2013 [31] pour la quantité de toxine dans le surnageant (c'est-à-dire les données dans les colonnes de droite du tableau 1) et sur la figure 6B les mesures équivalentes obtenues à partir des prédictions de nos modèles.

(A) : concentration normalisée de toxine dans le surnageant pour C. botulique ATCC 3502 (poids) et le cbo0786 mutant (muet) comme indiqué dans [31] (B) : modèle de prédiction de la concentration de toxine dans le surnageant (normalisé) pour poids et pour le mutant C786_M (muet).

Pour faire le Zhang et al. données (qui rapportent des concentrations comme A à 405 nm) comparables aux résultats de notre modèle (qui prédit les concentrations comme MLD50/ml), nous avons normalisé à la fois le poids et muet données à la concentration maximale de toxine mesurée, qui à la fois dans les figures 6A et 6B correspond à la quantité de toxine mesurée au point de données ES pour muet. De plus, nous avons défini les points de temps ME, LE et ES pour les cultures simulées par modèle à 14, 16 et 18 heures, respectivement.

La comparaison de la figure 6A avec la figure 6B indique que les mesures expérimentalement mesurées et modélisées poids sont assez différents en termes de modèle de production de toxines. Pour poids le pic expérimental de concentration de neurotoxine apparaît dans la culture au moment de la mesure ME un comportement qui est remarquablement distinct de celui de la C. botulique souche ATCC 19397 que nous avons considérée comme la base de notre modélisation dans ce travail. Notre modèle est cependant capable de reproduire l'augmentation de la toxigénèse induite par le silençage de la cbo0786 gène. En effet, comme on peut le constater à partir de la figure 6B, le modèle du mutant (mut) produit systématiquement des quantités plus élevées de toxine dans le surnageant.

Comparaison avec le mutant codY

Zhang et al., 2014 [29] ont mesuré la quantité de toxine dans le surnageant dans une culture de C. botulique souche ATCC 3502, que nous considérerons comme de type sauvage (poids) dans cette section, et pour un codY mutant construit par inactivation insertionnelle (muet, dans cette section). Données pour la concentration mesurée de toxine dans le surnageant des cultures de poids et muet en fonction du temps sont résumés dans le tableau 2 . Ces données ont été extraites de la Figure 3, page 7654 de [29].

Tableau 2

Données pour la concentration de toxine surnageante de C. botulique ATCC 3502 (poids) et codY mutant (muet), mesuré en μg/ml à divers moments au cours de la croissance de la culture.

Temps (heures)
56912244896
Concentration de toxines dans le surnageant (μg/ml)poids0.120.220.386.9541.560.550.5
muet0.060.110.142.9517.530.529.5

Pour comparer les résultats de notre modèle avec les données expérimentales rapportées dans le tableau 2, nous avons défini une séquence de points dans le temps qui correspondrait aux temps d'observation de la phase de croissance de la culture de Zhang. et al., 2014 [29]. Dans leur rapport, le pic de concentration de neurotoxine dans le poids la culture est réalisée au temps 48 heures et la transition entre les phases de croissance exponentielle tardive et stationnaire précoce se produit au temps 9 heures. Par conséquent, nous définissons les points de temps d'observation pour les cultures modélisées pour correspondre à ces événements distinctifs (temps 17,5 heures pour la transition des phases exponentielles tardives aux phases stationnaires précoces, et temps 22 heures pour le pic de concentration de toxine dans le surnageant) et nous montrent la comparaison entre les données expérimentales et les prédictions des modèles sur la figure 7 . Pour faciliter la comparaison, nous désignons les deux séquences de points dans le temps par t1,t2,…t7. La figure 7A montre le log de la concentration de toxine dans le surnageant, tel qu'obtenu dans le travail expérimental de Zhang et al., 2014 [29], et la figure 7B montre les résultats analogues obtenus à partir de nos modèles. Comme on peut le constater, il existe un bon accord entre les expériences et les prédictions du modèle (en particulier les valeurs relatives pour le type sauvage et le mutant).

(A) : concentration observée normalisée de toxine dans le surnageant pour C. botulique ATCC 3502 (poids) et le codY mutant (muet), comme rapporté dans [29]. (B) : modèle de prédiction de la concentration de toxine dans le surnageant (normalisé) pour poids et pour le mutant CODY_M (muet).

Comparaison avec les mutants Hall/707, Hall/714 et Hall/1146

Connan et ses co-auteurs rapportent dans [30] les résultats de travaux expérimentaux étudiant le rôle de divers systèmes à deux composants dans la régulation de la toxigénèse. Ils comparent la quantité de toxine dans le surnageant d'un C. botulique culture de souche Hall de type A contre la toxine dans le surnageant pour différents mutants dans lesquels les systèmes à deux composants ont été réduits au silence. D'intérêt pour nos fins sont les Salle/707 et Salle/714 mutants, pour lesquels nous avons construit un modèle nommé CRR_M, et le Salle/1146 mutant, pour lequel nous avons construit un modèle appelé C607_M. Depuis le Salle/707 et Salle/714 les mutants fournissent des résultats pratiquement identiques en termes de quantité de toxine produite dans le surnageant, nous ne considérons que Hall/707 dans la suite. Nous désignons par type sauvage (poids) l'original C. botulique souche Hall de type A, et par CRR_M et C607_M les deux souches mutantes Salle/707 et Salle/1146.

Dans [30], à la page 8, figure 3D, les auteurs ont rapporté les quantités mesurées de concentration de toxine dans le surnageant (A à 405 nm), pour 3 moments différents à 8 heures qui correspond à un point de la phase de croissance exponentielle, à 12 heures, au début de la phase stationnaire, et à 24 heures, bien à l'intérieur de la phase stationnaire.

Pour comparer les prédictions du modèle avec les données expérimentales rapportées dans le tableau 3, nous choisissons trois moments dans les évolutions temporelles prévues de la concentration de surnageant de toxine : temps 14,5 heures pour la phase de croissance exponentielle, temps 18,5 heures pour la phase stationnaire et temps 24 heures pour la phase stationnaire. Sur la figure 8, nous montrons les quantités de toxine dans le surnageant (normalisées par rapport à la quantité maximale, qui correspond dans tous les cas aux données pour poids en phase stationnaire) provenant des expériences de Connan et. Al [30] ( Fig 8A ) et à partir des prédictions de notre modèle ( Fig 8B ). On peut voir que les modèles peuvent reproduire la toxigénèse réduite des deux phénotypes mutants et peuvent également identifier que le mutant C607_M (c'est-à-dire le Salle/1146 souche) présente une réduction plus importante de la concentration de toxine.

Tableau 3

Données pour la concentration de toxine surnageante de C. botulique salle de type A (poids) et les mutants Hall/707 (CRR_M) et Hall/1146 (C607_M), mesurée pendant la phase de croissance exponentielle (temps 8 heures), la phase stationnaire précoce (temps 12 heures) et la phase stationnaire (temps 24 heures).

Neurotoxine dans le surnageant (A à 405 nm)
poidsCRR_MC607_M
Exponentiel124.81.5
Stationnaire précoce504.73
Stationnaire25075

(A), quantités mesurées expérimentalement de concentration de toxine dans le surnageant, normalisées par la concentration maximale mesurée (pour poids, en phase stationnaire) et rapportés sur une échelle logarithmique. (B), les concentrations de toxines prédites à partir de notre poids, les modèles mutants CRR_M et C607_M, normalisés par la concentration maximale prédite (pour poids, en phase stationnaire), échelle logarithmique sur l'axe vertical.


Résumé

Séquences du génome de cinq groupes II différents (non protéolytiques) Clostridium botulinum les souches de type F6 ont été comparées à un locus de 50 kb contenant le groupe de gènes de neurotoxine. Une origine clonale pour ces souches est indiquée par le fait que les séquences étaient identiques à l'exception de la souche Eklund 202F, avec 10 polymorphismes mononucléotidiques et une délétion de 15 pb. L'essentiel hautB gène codant pour la topoisomérase III s'est avéré avoir été divisé par l'insertion apparente de 34,4 kb d'ADN étranger (d'une manière similaire à celle du groupe II C. botulinum type E où le rarA gène a été perturbé par un groupe de gènes de neurotoxine). L'ADN étranger, qui comprend le groupe de gènes intacts de 13,6 kb de neurotoxine de type F6, porte non seulement un hautB mais aussi deux restes du gène de la neurotoxine botulique non fonctionnels, un type B et un type E.Cette observation combinée à la découverte de gènes d'intégrase de bactériophage et d'éléments IS4 suggèrent que plusieurs cycles de recombinaison/transfert horizontal de gènes ont eu lieu à ce locus. L'explication la plus simple du génotype actuel est que la bactérie ancestrale, un groupe II C. botulinum souche de type B, a reçu de l'ADN d'abord d'une souche contenant un cluster de gènes de neurotoxine de type E, puis d'une souche contenant un cluster de gènes de neurotoxine de type F6. Chaque événement a perturbé le gène de neurotoxine précédemment fonctionnel. Ce degré de recombinaison successive en un point chaud est sans précédent dans C. botulinum, et c'est aussi la première description d'un groupe II C. botulinum génome contenant plus d'une séquence de gènes de neurotoxine.


Le travail a été soutenu par le Norwegian Defence Research Establishment (FFI) et l'Université d'Oslo. Nous remercions Jaran Strand Olsen et Janet Blatny pour la lecture critique du manuscrit.

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Mots clés : Clostridium botulinum, botulisme, sérotype, spore, anaérobie, lacs, zones humides, sol

Citation : Espelund M et Klaveness D (2014) Épidémies de botulisme dans les environnements naturels – une mise à jour. Devant. Microbiole. 5:287. doi: 10.3389/fmicb.2014.00287

Reçu : 28 février 2014 Accepté : 24 mai 2014
Mise en ligne : 11 juin 2014.

Marie Archambault, Université de Montréal, Canada
John W. Austin, Bureau des dangers microbiens – Santé Canada, Canada

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*Correspondance : Mari Espelund, Division de la protection et de la sécurité sociétale, Norwegian Defence Research Establishment, P.O. Box 25, N-2027 Kjeller, Norvège e-mail : [email protected]

† Mari Espelund et Dag Klaveness ont contribué à parts égales à ce travail.


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