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Un programme d'évaluation de la motilité cellulaire avec une fonction de traitement par lots ?


L'évaluation de la motilité cellulaire est une branche de la biologie expérimentale ou de la science médicale. Un exemple pourrait être une évaluation des effets d'un traitement sur la motilité des spermatozoïdes d'un animal. La procédure standard consiste à prendre des extraits de film de sperme (ou tout autre objet en mouvement) au microscope et à mesurer la vitesse linéaire moyenne des particules sur ces extraits de film. Le programme utilisé pour mesurer ces vitesses linéaires est important, et il n'y a pas trop de choix à ma connaissance. Cependant, mes connaissances peuvent être limitées.

J'ai déjà utilisé CellTrak pour mesurer la vitesse de nage des spermatozoïdes. Le programme fonctionne bien, mais il manque une fonction de traitement par lots. Comme l'évaluation repose sur un nombre considérable de répliques, je me retrouve avec 1 000 à 2 000 extraits de film à analyser et cliquer sur mon chemin dans CellTrak est un processus fastidieux et irritant. De plus, la licence CellTrak coûte beaucoup d'argent pour un programme aussi mal écrit.

Par conséquent, ma question est la suivante : est-ce que quelqu'un connaît un programme similaire à CellTrak, qui inclut une option de traitement par lots, ou encore mieux, qui fonctionne via la ligne de commande et peut être bouclé ? Existe-t-il des options ou extensions open source pour les programmes open source largement utilisés (ImageJ, Bioconductor, etc.) ? Veuillez donner un court tutoriel/expérience personnelle sur l'utilisation du programme suggéré (le cas échéant).


ImageJ a plusieurs plugins de suivi, un bon étant TrackMate. La plupart de ses fonctions peuvent être scriptées dans différentes langues et la distribution Fiji peut également fonctionner en mode sans tête. C'est open source et ne vous coûtera pas d'argent pour un beaucoup ensemble de feture lager.

J'ai personnellement utilisé ImageJ en mode sans tête scripté avec son propre langage macro car il est relativement facile à apprendre. TrackMate devrait également afficher les vitesses moyennes des pistes, si je me souviens bien. Sinon, vous devrez écrire un script pour mesurer ceux à partir des données de suivi. Vous pouvez utiliser le langage macro IJ, Python, Java ou l'un des autres langages pris en charge.

En combinaison avec un wrapper de script bash pour son mode sans tête, je l'utilise même dans Makefiles pour convertir mes piles tiff en avi et mettre des barres d'échelle et des horodatages sur tout.

J'espère que cela t'aides.


Une référence des méthodes de correction d'effet de lot pour les données de séquençage d'ARN unicellulaire

Les ensembles de données transcriptomiques unicellulaires à grande échelle générés à l'aide de différentes technologies contiennent des variations systématiques spécifiques aux lots qui présentent un défi pour l'élimination des effets de lot et l'intégration des données. Avec une croissance continue attendue des données scRNA-seq, il est crucial de parvenir à une intégration par lots efficace avec les ressources de calcul disponibles. Ici, nous effectuons une étude de référence approfondie sur les méthodes de correction de lot disponibles pour déterminer la méthode la plus appropriée pour la suppression de l'effet de lot.

Résultats

Nous comparons 14 méthodes en termes de temps d'exécution de calcul, de capacité à gérer de grands ensembles de données et d'efficacité de correction d'effet de lot tout en préservant la pureté du type de cellule. Cinq scénarios sont conçus pour l'étude : des types de cellules identiques avec des technologies différentes, des types de cellules non identiques, des lots multiples, des données volumineuses et des données simulées. Les performances sont évaluées à l'aide de quatre métriques d'analyse comparative, notamment kBET, LISI, ASW et ARI. Nous étudions également l'utilisation de données corrigées par lot pour étudier l'expression différentielle des gènes.

Conclusion

Sur la base de nos résultats, Harmony, LIGER et Seurat 3 sont les méthodes recommandées pour l'intégration par lots. En raison de sa durée d'exécution considérablement plus courte, Harmony est recommandée comme première méthode à essayer, les autres méthodes étant des alternatives viables.


Introduction

La migration cellulaire joue un rôle essentiel dans de nombreux processus biologiques : par ex. la cicatrisation des plaies, l'embryogenèse, l'inflammation et les métastases où la migration cellulaire incontrôlée peut conduire à la propagation de la tumeur et donc à la progression du cancer. L'étude de ces processus nécessite fréquemment un suivi des cellules, et la plupart des études de motilité des cultures monocouches impliquent un marquage fluorescent des cellules, ce qui permet des études de microscopie à fluorescence [1][2]. Cette technique nécessite soit une mutagenèse poussée pour que la protéine fluorescente soit exprimée par le type cellulaire à l'étude, soit elle est limitée par le fait que les médicaments fluorescents fixés à la membrane ou perméables modifient souvent le comportement cellulaire [3]. Dans les cultures clairsemées, les cellules peuvent avoir un contraste suffisamment bon par rapport à l'arrière-plan pour que leurs limites puissent être identifiées par microscopie à fond clair sans marquage [4a][4b]. Cela peut être fait manuellement avec des méthodes pointer-cliquer à grands frais de temps et de travail [5][6][7][8][9][10]. Lorsque les cellules de quelques images seulement doivent être suivies, ce n'est pas un défi. Cependant, lorsque de longues séquences accélérées de cellules mobiles doivent être analysées, cette approche est peu pratique, ce qui augmente la nécessité d'un programme de suivi cellulaire automatisé fiable et d'une évaluation de la robustesse de la méthode d'analyse.

Des programmes représentatifs pour l' analyse de cultures cellulaires éparses sont répertoriés dans le tableau 1 . La majorité de ces programmes (non inclus dans le tableau 1) sont conçus pour suivre les cellules marquées par fluorescence [1][2] [15][16][17][18]. Les programmes conçus pour être utilisés avec des images de microscopie optique suivent soit le noyau cellulaire [19][20], soit la cellule entière [21][11][22][12]. La position de la cellule peut être définie comme : (i) le centre du noyau [6] (ii) le centroïde du périmètre de la cellule comme vu au microscope optique [23] (iii) le centroïde de l'empreinte de la cellule comme vu dans le microscope optique [4] et (iv) le centroïde du cytosquelette d'actine de cellules marquées par fluorescence [24]. La plupart de ces programmes ne sont pas open source et peuvent être difficiles à adapter aux objectifs spécifiques d'une expérience donnée. Dans d'autres cas, la complexité des procédures mathématiques utilisées pour l'identification des limites peut être un obstacle à l'adaptation du code à un objectif spécifique [2][20][17]).

Tableau 1

Vue d'ensemble des programmes représentatifs pour le suivi des cellules par microscopie optique time-lapse.

ProgrammeÉditeur/VendeurCommercialOpen sourceFormat de sortie des coordonnées
VolocitéImprovisationOuiNonTexte
ImarisBitplaneOuiNonExceller
Autozell [11] Université de BrêmeOuiNonTexte
TLA [12] Université d'UlmNonOuiExcel/Texte
CellTrack [13] Université d'État de l'OhioNonOuiTexte
Plugins ImageJ [14] ETH & UCSFNonOuiTexte

Il existe deux approches principales du suivi des cellules dans l'état de l'art actuel [25][21][16][20][26][18]. Une approche est la segmentation et le suivi des images image par image [15][27]. Dans une première étape, les objets candidats sont détectés dans une trame donnée sur la base de leurs propriétés spécifiques (bordure, texture, couleur). Cette approche est efficace lorsque les bordures des objets sont nettes, et elle est couramment utilisée avec des cellules marquées par fluorescence et d'autres images à contraste élevé. L'autre approche consiste à optimiser une forme de modèle paramétrée pour adapter le modèle aux cellules d'un cadre. Au lieu de suivre tous les objets dans le cadre, cette méthode se concentre sur les candidats qui correspondent à la forme de modèle choisie [28][29]. Comme avec la première approche, les objets détectés sont appariés entre des trames consécutives afin de produire des pistes.

Afin de résoudre le problème de la suppression de l'arrière-plan et de comparer les performances de différents programmes sur des données réelles par rapport à une base de référence que nous comprenons et contrôlons parfaitement, nous introduisons ici un nouveau programme de suivi des cellules, que nous appelons PACT (programme pour Āutomated ell rayonnage). PACT est adapté au suivi des cellules mobiles sur des surfaces planes et nanostructurées, et est suffisamment simple pour que les utilisateurs puissent le modifier librement en fonction de leurs besoins expérimentaux. Étant donné que les surfaces nanostructurées présentent actuellement un grand intérêt en tant que substrats de culture cellulaire et peuvent apparaître comme un arrière-plan hautement non uniforme dans l'image, nous insistons sur l'utilisation d'un filtre d'image spatial fiable ici – voir les détails dans la section matériaux et méthodes, et Fichier SuppInfo.zip pour le code Matlab.

Les résultats des tests sont présentés pour les performances de PACT, qui sont également comparées aux performances d'autres programmes (TLA [12] et Autozell [11]) : efficacité en matière de détection d'objets, précision de positionnement centroïde et performances de segmentation dans le cadre de l'analyse time-lapse. Une analyse statistique est ensuite effectuée sur l'ensemble des pistes individuelles de cellules pour déterminer les statistiques globales de motilité de la population cellulaire dans un film de fibroblastes NIH 3T3 sur verre. A partir des traces, la fonction d'auto-covariance de la vitesse est estimée (Equation S1 en info supp.). Il est bien décrit par une fonction exponentielle simple avec un temps caractéristique, P, les persistance temps de la motilité (données présentées dans l'info supp. sect. 4). Nous déterminons également l'amplitude de la fonction d'auto-covariance de la vitesse, φ0, qui est approximativement égale à la vitesse quadratique moyenne des cellules. Les résultats de cette analyse obtenus avec PACT, TLA et Autozell sont comparés.

Malgré le besoin de programmes et d'algorithmes de suivi des cellules, nous avons trouvé peu d'études évaluant leurs performances [11][12][26]. À notre connaissance, cet article est la première analyse comparative des programmes de suivi dans le but de fournir des routines d'acquisition de données fiables pour développer des modèles de motilité. Nous trouvons une sensibilité considérable des résultats à l'algorithme/logiciel spécifique utilisé. Ainsi, l'algorithme de suivi et son effet sur les résultats devraient être bien documentés dans les études futures, par exemple comme décrit dans cette étude.


2. Mise en œuvre

L'approche globale pour l'analyse intégrative de la motilité par TIAM est résumée dans la Fig.ਁ. Des algorithmes de détection, de suivi, d'extraction de caractéristiques et d'édition de piste ont été implémentés dans MATLAB (de MathWorks). L'interface utilisateur pour faciliter les entrées utilisateur a été implémentée en Java. Une deuxième interface utilisateur pour la visualisation dynamique d'individus ou de paires de pistes a été implémentée dans MATLAB. Le projet de logiciel TIAM a été déposé dans GitHub pour un accès gratuit au code source (https://github.com/willieneis/TIAM). Un guide d'utilisation détaillé, une démo et le lien URL pour les ensembles de données de référence sont fournis dans le référentiel Github. Une description supplémentaire des algorithmes peut être trouvée dans la section Méthodes supplémentaires.

Présentation du schéma d'intégration des données dans TIAM. Les images en lumière transmise sont utilisées pour détecter et suivre les cellules. Plusieurs paramètres quantifiant les caractéristiques de motilité sont calculés et stockés dans les matrices MATLAB  �ll’. Des pistes individuelles sont prises en compte pour extraire des informations à partir d'images de réflexion et de fluorescence qui font partie de données time-lapse multicanaux. Les centroïdes des positions des pistes sont utilisés pour la segmentation locale et les contours qui correspondraient à la cellule considérée. Les caractéristiques sont calculées à partir des régions décrites et stockées avec le reste des informations relatives à la piste.

2.1. Détection de cellules

TIAM est équipé pour détecter et suivre les cellules dans des séries d'images en lumière transmise, telles que celles acquises par microscopie à fond clair, à contraste d'interférence différentiel (DIC) ou à contraste de phase. Nous avons choisi cette approche pour plusieurs raisons : a) Les limites cellulaires peuvent être difficiles à discerner à partir des informations de fluorescence lorsque les cellules sont dans un environnement surpeuplé, la nature inhérente de l'imagerie par lumière transmise garantit que les limites cellulaires offrent un certain contraste même dans un environnement surpeuplé. b) L'utilisation de l'imagerie par lumière transmise pour le suivi des cellules libère un canal de fluorescence pour acquérir des informations supplémentaires sur le comportement des cellules. c) L'utilisation de la microscopie à lumière transmise au lieu de la microscopie à fluorescence permet une imagerie de cellules vivantes à long terme car la phototoxicité est minimisée.

La stratégie de détection de cellules de TIAM consiste à trouver des motifs en forme de cellules dans l'ensemble des bords détectés dans une image. Un filtre de contour de Canny (Canny, 1986) est utilisé pour produire une image binaire représentant tous les contours d'une image vidéo donnée, et une transformée de Hough circulaire (CHT) (Duda et Hart, 1972) opère sur cette image binaire pour détecter des cellules individuelles ( Fig.ਂ a𠄽). Cette stratégie en deux étapes a déjà été appliquée pour détecter des noyaux dans des embryons de poisson zèbre (Melani et al., 2007). La transformée de Hough est une méthode robuste pour détecter des courbes paramétrées dans les images, où la tâche de détecter des motifs complexes de pixels (un problème de recherche global coûteux) est transformée en tâche de construire des pics dans un espace de paramètres. La transformée de Hough effectue un processus de vote, où chaque pixel de bord vote sur les paramètres de courbe avec lesquels il est cohérent par la suite, les emplacements dans l'espace des paramètres qui ont gagné un nombre suffisant de votes sont renvoyés. Les maxima locaux dans cet espace de paramètres peuvent être considérés comme des centroïdes de cellules. Cette stratégie est bénéfique pour détecter les cellules avec des limites à faible contraste en raison de la capacité du CHT à détecter des formes basées sur un ensemble de bords non contigus et partiels. En outre, il contourne le besoin de segmentation des cellules individuelles et contribue ainsi à la précision de la détection dans les environnements à haute densité (Fig. S1 par exemple). Nous avons utilisé l'implémentation de Tao Peng du CHT (CircularHough_Grd du référentiel MATLAB File Exchange) car il considère une plage de rayons pendant le processus de vote et inclut un paramètre supplémentaire pour rechercher des maxima sur des formes circulaires imparfaites. En conséquence, nous avons trouvé notre implémentation pour détecter les cellules T polarisées ainsi que les cellules de différents types, morphologies et à différentes densités cellulaires dans les images acquises par les trois techniques de microscopie à lumière transmise susmentionnées (Fig.ਂ, Fig. S1, Fig. S2 et vidéos S1𠄳). Les paramètres individuels impliqués dans l'étape de détection sont décrits plus en détail dans la section Méthodes supplémentaires. Les valeurs des paramètres généralement utilisées dans nos expériences d'imagerie des cellules T sont également fournies.

Détection et suivi des cellules par TIAM. TIAM utilise des images de lumière transmise pour détecter et suivre les cellules. L'illustration de la détection par TIAM est fournie avec un exemple (a𠄽). Une image DIC de cellules T CD8 primaires humaines est utilisée (a). Les panneaux, b à d, représentent les étapes séquentielles lors de la détection des cellules. Dans la première étape, le filtre de bord de Canny est appliqué pour générer une image binaire des limites des cellules (b). Ensuite, une transformée de Hough circulaire (CHT) est appliquée à cette image binaire. Cette opération mappe les contours des cellules à des points dans un espace de paramètres sur la base d'un schéma de vote (c). Les maxima locaux dans l'espace des paramètres sont utilisés pour sélectionner les centroïdes des cellules (d). TIAM a une interface utilisateur graphique qui guide l'utilisateur à travers le choix des paramètres pour le filtrage de bord et CHT pour permettre une détection précise des cellules.

Une détection réussie est essentielle pour toutes les étapes de calcul qui s'ensuivent. Par conséquent, nous avons développé une interface utilisateur graphique en Java pour modifier de manière interactive les paramètres du filtre Canny-edge et du CHT afin d'obtenir une détection réussie des cellules dans les images en lumière transmise. Le guide de l'utilisateur fournit un exemple de ce processus pour aider à la sélection intuitive des valeurs des paramètres. L'utilisateur est invité à ajuster l'échelle de l'image de telle sorte que la taille de la cellule soit similaire à l'exemple fourni dans le guide de l'utilisateur. Cela tente de s'assurer que la plage de rayon par défaut utilisée pendant le processus de vote CHT fonctionne bien. De même, la détection des contours et des paramètres CHT supplémentaires peuvent être choisis par comparaison avec les exemples d'images de ces étages. Les positions centroïdes sont retransformées à l'échelle d'origine à la fin de l'étape de détection, avant de procéder au suivi des cellules.

2.2. Suivi

Le suivi dans TIAM s'effectue en deux étapes. Dans la première étape, un algorithme d'association de voisin le plus proche modifié est appliqué aux sorties de l'étape de détection de cellule pour produire des segments de courte piste ‘’ (Fig. S3a). A chaque pas de temps t, chaque cellule est liée à la cellule détectée spatialement la plus proche du pas de temps précédent t −ਁ, à condition que la cellule détectée la plus proche se trouve à une distance maximale autorisée r. Ce processus se déroule de cette manière uniquement lorsque les cellules sont suffisamment séparées et qu'il n'y a pas d'ambiguïté de suivi. S'il y a plus d'une cellule dans r, l'algorithme renvoie le segment de piste qui a été produit jusqu'à cette trame et initie de nouvelles pistes avec les cellules voisines qui ont causé l'ambiguïté. Cela se produit généralement dans les cas où les cellules se croisent ou lorsqu'elles sont présentes à une densité locale élevée. Ainsi, ces segments de piste représentent des séquences sur lesquelles l'algorithme peut fournir en toute confiance des résultats de suivi. Nous avons préféré l'algorithme du plus proche voisin pour sa simplicité et son intuitivité, à la fois dans sa mise en œuvre et ses performances, par rapport aux approches de suivi basées sur des modèles de pointe. De plus, nous préférons utiliser des intervalles de temps plus longs pour réduire la phototoxicité pendant l'imagerie time-lapse multicanal à long terme (plus d'une heure). Les cellules T étant très mobiles, des intervalles de temps plus longs peuvent ne pas fournir de cellules qui se chevauchent dans les images suivantes, ce qui est une exigence restrictive des techniques basées sur l'évolution des contours (Padfield et al., 2011). Bien que l'algorithme du voisin le plus proche ne fonctionne pas bien à des densités de cellules élevées, comme nous le verrons plus loin, nous avons obtenu un suivi précis avec une cinquantaine de cellules dans le champ de vision.

Dans la deuxième étape, un algorithme d'affectation est utilisé pour joindre de bout en bout des segments plus courts en pistes de cellules plus longues (Fig. S3b). Afin d'effectuer la jonction de segments, une similitude est d'abord définie entre chaque paire de segments en fonction de facteurs de compatibilité tels que leur trame de début/fin, leur emplacement et leur vitesse. Ensuite, l'algorithme hongrois (Munkres, 1957) est utilisé pour trouver une cartographie globalement optimale entre les segments basée sur la matrice de similarité (Bise et al., 2011 Jaqaman et al., 2008 Perera et al., 2006). Parmi ces affectations mappées, les segments ne sont joints que si leur similarité dépasse un certain seuil. L'approche à deux niveaux du suivi vise à être efficace sur le plan informatique en mettant en œuvre un algorithme de voisin le plus proche non sophistiqué et gourmand lorsque le scénario de suivi est simple, et un ensemble de calculs plus complexe utilisant les résultats du voisin le plus proche lorsque le scénario de suivi est ambigu.

Les algorithmes de suivi sont expliqués en détail dans la section des méthodes supplémentaires avec les valeurs des paramètres utilisés. Les paramètres des algorithmes de suivi sont codés en dur dans TIAM. Mais nous avons fourni des informations dans le guide de l'utilisateur indiquant où dans le code les valeurs des paramètres peuvent être modifiées si vous le souhaitez. Des informations spécifiques à la série d'images peuvent être précisées via l'interface utilisateur graphique afin de calculer les caractéristiques de motilité des cellules (voir notice d'utilisation).

2.3. Extraction de fonctionnalités et intégration de données

TIAM est conçu pour utiliser la série d'images multicanaux afin d'extraire des informations supplémentaires sur les cellules suivies afin de faciliter l'analyse intégrative et de fournir des informations sur la motilité des cellules T. Les algorithmes d'extraction de caractéristiques mis en œuvre dans TIAM visent à récupérer des caractéristiques physiques telles que la zone de fixation à un substrat sous-jacent (à partir du canal de réflexion), la polarité (à partir du canal de lumière transmise) et l'intensité de fluorescence (à partir de deux canaux de fluorescence maximum), et stockez/rapportez-les avec les caractéristiques de motilité telles que la vitesse de la cellule, l'angle de virage, le coefficient d'arrêt et l'indice de confinement (voir Méthodes supplémentaires pour la description). L'interface utilisateur propose des options pour spécifier les canaux et les caractéristiques à extraire (voir le guide utilisateur TIAM). En raison de la perspective cohérente pour tous les canaux d'image, les résultats de suivi du canal d'image en lumière transmise peuvent être directement associés aux canaux secondaires. Le centroïde des cellules déduit à l'étape de détection est utilisé pour relier les informations de pixel local de ces canaux secondaires aux pistes (Fig.ਁ).

Discerner le contour de la limite d'une cellule donnée est une routine commune qui est appliquée à n'importe lequel des canaux d'image, qui peut être défini comme la région d'intérêt (ROI) pour calculer les caractéristiques souhaitées à partir de ce canal d'image. Étant donné une position de centroïde, une boîte carrée d'une taille prédéterminée autour du centroïde est utilisée pour isoler et sélectionner l'image locale. Cette image locale ne contient idéalement que la cellule d'intérêt. Pour les canaux de réflexion et de fluorescence, l'image locale est segmentée via la méthode d'Otsu (Otsu, 1979) pour donner la limite cellulaire dans ce canal. Afin d'éliminer les pixels associés à des portions de cellules voisines en contact, l'algorithme Watershed (Meyer, 1994) est utilisé sur la transformée de distance de l'image segmentée initiale. Pour le canal de lumière transmise, la détection des contours de Canny (Canny, 1986) est d'abord utilisée pour discerner les limites des cellules dans l'image locale. Afin d'éliminer les pixels associés à des portions de cellules voisines en contact, l'algorithme Watershed est utilisé sur le CHT de l'image de bord. La plus grande région définie par l'algorithme Watershed dont le centroïde est à une distance donnée du centre de la boîte est considérée comme la cellule d'intérêt.

L'approche de segmentation locale a été principalement mise en œuvre pour gérer des séries d'images de réflexion qui ont tendance à avoir des valeurs d'intensité de pixels de premier plan et d'arrière-plan variant dans l'espace et dans le temps, ce qui exclut l'utilisation du seuillage global. De plus, nous avons constaté au cours du processus d'implémentation que l'algorithme Watershed était plus fiable sur les images locales que sur les images globales.

2.4. Fonctionnalités supplémentaires dans TIAM

TIAM permet le traitement par lots d'ensembles de données expérimentales et peut automatiquement distinguer les types de cellules sur la base de marqueurs vitaux fluorescents différentiels (voir Méthodes supplémentaires et guide de l'utilisateur). TIAM offre également la possibilité d'avoir le canal d'image sélectionné avec les contours des cellules superposés dans une série d'images tiff. Cela peut fournir une évaluation visuelle de la qualité de la segmentation des cellules individuelles dans ce canal. Une interface utilisateur autonome basée sur MATLAB est fournie pour visualiser des pistes individuelles ou des paires de pistes en mode vidéo (voir le guide de l'utilisateur). Cela permet une inspection manuelle des résultats de suivi de TIAM. Cette interface utilisateur est également destinée à aider à enregistrer manuellement les numéros de piste et d'image des corrections souhaitées dans les affectations de piste. TIAM fournit également une fonction d'édition de piste autonome qui utilise les listes compilées manuellement des corrections souhaitées dans les affectations de piste (voir le guide de l'utilisateur). L'algorithme d'édition de piste est un processus en deux étapes, où les pistes sont d'abord divisées à des images spécifiées (Fig. S4). Ensuite, les pistes et/ou sous-pistes spécifiées, résultant soit de ruptures lors de la première étape, soit de celles qui ont été manquées par l'algorithme, sont réunies. Icy, plateforme d'analyse d'images open source, propose également un plug-in de visualisation et d'édition des pistes (de Chaumont et al., 2012).

2.5. Évaluation des performances de détection et de suivi

L'évaluation des performances, également appelée analyse des performances, dans l'analyse d'images compare les résultats obtenus à partir d'une procédure automatisée avec la vérité sur le terrain établie manuellement. Ici, une piste de vérité terrain représente les positions ‘true’ d'une cellule sous la forme d'une séquence de cadres de délimitation. Nous avons utilisé le logiciel Video Performance Evaluation Resource (ViPER) (Doermann et Mihalcik, 2000) pour dessiner manuellement des cadres de délimitation autour des cellules dans chaque image vidéo et indexer les séquences de cadres de délimitation correspondant à chaque cellule individuelle pour désigner les pistes.

Des mesures d'évaluation des performances ont été utilisées pour évaluer de manière quantitative et complète les performances de détection et de suivi de TIAM et des outils tiers. Nous avons utilisé les métriques Sequence Frame Detection Accuracy (SFDA) et Average Tracking Accuracy (ATA) (Kasturi et al., 2009) car elles peuvent être calculées de manière entièrement automatisée et permettent ainsi une quantification reproductible du succès de la détection et du suivi des objets. De plus, ils ne souffrent pas du risque d'erreur humaine ou de biais. Ces métriques ont été adoptées comme métriques standardisées par le programme Video Analysis and Content Extraction (VACE) (http://marathon.csee.usf.edu/vace-links.html) et la Classification of Events, Activities, and Relationships (CLEAR ) consortium (www.clear-evaluation.org) qui sont deux efforts à grande échelle et à l'échelle de la communauté concernés par le suivi vidéo et l'analyse des interactions. Les métriques sont basées sur la similarité Jaccard (Fig. S5 pour une illustration intuitive et des méthodes supplémentaires pour une description mathématique). Afin de calculer SFDA et ATA, une correspondance biunivoque entre la vérité terrain et le résultat doit être établie. Pour établir ce mappage, nous avons utilisé l'algorithme hongrois (Munkres, 1957) avec des métriques basées sur la similarité de Jaccard utilisées pour construire la matrice de similarité (voir Méthodes supplémentaires pour plus de détails).

Nous avons consolidé les routines logicielles pour effectuer l'analyse des performances dans une suite distincte basée sur MATLAB que nous appelons PACT (Analyse des performances du suivi cellulaire). Le code PACT, son guide de l'utilisateur et les ensembles de données de vérité terrain pertinents sont disponibles à l'adresse https://github.com/willieneis/TIAM/tree/master/PACT/. Le guide de l'utilisateur comprend également des instructions spécifiques sur l'utilisation de ViPER pour l'annotation de la vérité terrain.

2.6. Évaluation des performances de l'extraction de caractéristiques

Les performances de l'extraction de caractéristiques ont également été évaluées par rapport à la vérité terrain. Les contours dessinés manuellement ou par des procédures semi-automatisées dans ImageJ (Schneider et al., 2012) ont été répertoriés comme ROI et utilisés comme vérité terrain (voir Méthodes supplémentaires pour plus de détails). Une correspondance biunivoque entre les cellules individuelles dans la vérité terrain et le résultat TIAM a été obtenue en utilisant l'algorithme hongrois (Munkres, 1957). La matrice de similarité pour l'algorithme hongrois a été construite pour chaque trame en utilisant la distance entre les centroïdes de chaque appariement possible de cellules dans le résultat TIAM avec celles de la vérité terrain. Une fois la correspondance un à un obtenue, les caractéristiques quantifiées obtenues à partir de la vérité terrain ont été comparées à celles de TIAM.


MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Présentation d'ICAnet

ICAnet est un outil d'analyse d'ARN-seq à cellule unique basé sur un module, conçu pour l'intégration, le regroupement et l'analyse de réseau. Cet outil intègre des informations sur l'expression génique et un réseau PPI de haute qualité d'une nouvelle manière pour récupérer avec précision le paysage de l'atlas d'expression unicellulaire. ICAnet se compose de trois étapes principales : (i) le prétraitement et la décomposition de la matrice d'expression génique (ii) le regroupement des programmes d'expression par lots croisés et (iii) l'identification du «sous-réseau» (module) activé par piège à pied. Les détails de ces principales étapes sont décrits ci-dessous.

Prétraitement et décomposition de la matrice d'expression génique

Normalisation de l'expression génique

ICAnet requiert des matrices d'expression génique à cellule unique en entrée, qui sont ensuite normalisées via une étape de prétraitement standard (normalisation logarithmique pour toutes les matrices d'expression génique en utilisant le facteur de taille 10 000 par cellule, log2CP10K). Les utilisateurs peuvent également spécifier d'autres types de quantification de l'expression génique (par exemple, TPM ou RSEM) et des méthodes de normalisation (par exemple, SCTransfrom) avant d'exécuter les étapes principales suivantes d'ICAnet.

Matrice d'expression génique de débruitage

Dans chaque ensemble de données utilisé pour l'intégration ou le regroupement, ICAnet visait à identifier des signaux biologiques à partir de matrices d'expression génique et à identifier des modèles d'expression partagés. Pour différents lots d'ensembles de données avec différents niveaux de rareté des données, la variabilité de la rareté des données affectera négativement les comparaisons de programmes d'expression entre différents ensembles de données, car une partie de la variation des données (signal) est entraînée par la rareté des données, pas le signal biologique réel ( 30). Pour diminuer les interférences dues à la rareté des données, ICAnet a mis en œuvre deux stratégies alternatives : (i) Informatique top K gènes variables pour chaque lot en fonction du coefficient de variation pour chaque gène, en prenant l'ensemble d'intersection de tous les ensembles de gènes variables comme ensemble de gènes filtré, et en utilisant leur profil d'expression correspondant pour exécuter ICAnet (ii) À l'aide d'un module Python récemment développé ( nommé au hasard) basé sur la théorie des matrices aléatoires pour débruiter l'ensemble de données (30), ce qui fonctionne très efficacement pour éliminer les signaux pilotés par la densité à cellule unique (30). Nous l'avons utilisé dans un premier temps pour débruiter l'ensemble de données afin d'éviter l'influence de la rareté des données sur la décomposition matricielle d'ICAnet. Dans cette étude, nous avons uniquement appliqué l'étape de prétraitement de débruitage aux ensembles de données scRNA-seq des îlots pancréatiques pour améliorer les performances de correction de l'effet de lot d'ICAnet, car ces ensembles de données ont été générés à partir de différents types de bibliothèques et chaque ensemble de données présentait différents degrés de rareté des données.

Extraction de signaux biologiques via une analyse de composants indépendante

Pour identifier les signaux biologiques (programmes d'expression) dans l'ensemble de données, nous avons utilisé l'ICA pour décomposer les matrices d'expression génique en programmes d'expression génique. Le nombre de programmes d'expression est un paramètre très important dans ICAnet, c'est pourquoi nous avons proposé une méthode non supervisée basée sur la théorie des matrices aléatoires ( 31, 32) pour déterminer ce paramètre (voir les notes supplémentaires, section 1 dans les documents supplémentaires). Chaque jeu de données a été centré avant d'effectuer l'ICA pour la décomposition matricielle. Deux implémentations différentes d'ICA peuvent être utilisées par ICAnet. La première implémentation est la dialnalisation conjointe approchée des matrices propres (JADE) (33). Le principal avantage de JADE par rapport aux autres solutions d'implémentation est qu'il est basé sur des calculs matriciels impliquant une diagonalisation matricielle, ce qui entraîne des composants non stochastiques. D'autres algorithmes (par exemple FastICA) reposent sur une procédure d'optimisation (par exemple, des points de départ et des chemins d'optimisation) ( 34), par conséquent, peuvent produire des résultats variables. La deuxième implémentation est basée sur le package R MineICA (25), qui utilise la même stratégie que Icasso, pour atténuer le problème stochastique lors de l'exécution de FastICA (35) via le clustering itératif de composants. Dans cette étude, nous avons utilisé l'ICA basé sur JADE pour décomposer les matrices d'expression génique en composants indépendants (matrice source), et les poids des gènes (importance) de chaque composant ont une variance unitaire et des moyennes nulles.

Regroupement de programmes d'expression par lots

Regroupement des programmes d'expression sur plusieurs lots pour trouver des signaux biologiques partagés

Une caractéristique clé d'ICAnet est le regroupement de composants indépendants (ou programmes d'expression) à travers différents ensembles de données/lots. Tout d'abord, l'ICA a été réalisée indépendamment sur chaque ensemble de données/lot. Ensuite, les composants indépendants calculés à partir de deux (ou plus) ensembles de données à cellule unique ont été comparés en calculant le coefficient de corrélation de Pearson entre les poids des gènes correspondants des gènes sélectionnés (valeur de projection > 2,5 écarts types dans le composant identifié). Après le regroupement des composants de différents ensembles de données/lots, l'algorithme Partitioning Around Medoids (PAM) (36) avec la largeur moyenne de la silhouette a été utilisé pour estimer le nombre optimal de modèles d'expression. Enfin, les medoids ont été choisis comme « programmes basaux » partagés entre les lots pour une pondération supplémentaire du réseau.

Identification du « sous-réseau » (module) activée

Construction de réseaux PPI pondérés avec des programmes basaux partagés entre les lots

Dans l'étape suivante, nous avons combiné des réseaux PPI et des programmes d'expression pour intégrer leurs informations. The PPI networks were obtained from the STRING database, a common and widely used PPI database ( 37). In this analysis, we used a threshold of a combined interaction score >600 to filter interactions, which is also a commonly used criterion for obtaining credible PPI networks ( 12, 38).

Those genes that significantly contribute to each expression program have been defined previously as the ‘activated genes’, which are identified using a weight threshold of three or four standard deviations from the mean. Here, we constructed weighted PPI network to produce activated sub-networks (or modules), wherein the edge-weight density is significantly greater than the rest of the network. We used the same weight scheme that used previously in computational epigenome model research ( 39). Specifically, for each component, the absolute weight value of each gene was determined and defined as ICA statistic |$(IC)$|⁠ . Assuming genes g et h are connected in the PPI, we assigned the edge weight as the average of the individual node (or gene) statistics, i.e. |$<>> = frac<1><2> ( <>+ IC> )$|⁠ . To avoid prohibitive computational expenditures, we only assigned the edge weights to the edges with endpoint ICA statistics that passed the weight threshold and zero was assigned to other edges. The weight threshold can be manually adjusted, and in this analysis, we set it as 2.5 standard deviations from the mean.

Random walk trapping to identify sub-networks in weighted PPIs

To rapidly and robustly identify dense connected and activated sub-networks, we used the random walk approach ( 40) to decipher all the possible sub-networks (modules). We performed random walks of different lengths using our ICA statistics-weighted PPI networks and detected modules by applying walk-trap algorithm on each random walk-based distance matrix. All the detected modules greater than three were saved and pooled together as module sets. We then applied the AUCell algorithm to the raw single-cell datasets to construct activated module–cell matrix that calculates the enrichment of each module in each cell as an area under the recovery curve (AUC) across the expression value-based rankings of all or some of the genes. The cell–module activity is summarized in a matrix (termed as module activity matrix) wherein columns represent single cells and rows represent the predicted modules.

Evaluation of clustering performance

Adjusted Rand Index (ARI)

When cell labels and batch information are available, the ARI can be used to calculate the similarity between the ICAnet clustering result and the known cell or batch labels (see Supplementary Notes, Section 2 in the Supplementary Materials).

Inverse Simpson's Index (LISI)

We used a score metric, named as LISI, to measure local diversity based on local neighborhood distribution (See Supplementary Notes, Section 2 in the Supplementary Materials). This index represents the expected number of cells that need to be sampled before neighboring cells are drawn from the same batch. The greater the score, the stronger the local batch_ID (iLISI) or cell_type (cLISI) heterogeneity is.

Clustering methods for cell states identification

For the cell states identification benchmark task, several methods were systemically compared. Before running clustering methods, we used count per million to derive a normalized count matrix. For t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE)+k-means, pcaReduce and SC3, we used a log-transformed dataset and adjusted the number of clusters to optimize the clustering performance, which was evaluated by the ARItype de cellule. For SINCERA, we used z-score normalized data for the clustering analysis, and we also adjusted the number of expected clusters to optimize the ARItype de cellule valeurs. For Seurat, we used the Seurat packages and processed related datasets in accordance with the tutorial (https://satijalab.org/seurat/v3.2/pbmc3k_tutorial.html). We then performed cell clustering multiple times using Louvain clustering with multi-level refinement algorithms on a shared-nearest-neighbor-based cell graph, during which we adjusted the parameter resolution for the maximal ARItype de cellule. Three module-based clustering methods, SCENIC, SCORE and ICAnet, were compared in this study. All these methods quantified module activity based on AUCell. We ran each method and used the same aucMaxRank parameters to derive a module-based activity matrix.

For each clustering method, we used two variable gene selection criteria: the Top 5000 genes with the largest coefficient of variation, and the whole gene set. We then performed the above variable gene selection steps separately to select the criterion that produced the best clustering performance. For each test dataset, we re-analyzed the identifying novel rare cell types using Louvain clustering with a multilevel refinement algorithm ( 7) on a shared-nearest-neighbor-based cell graph derived from the module activity matrix to infer cell expression state.

Clustering methods for multi-batch datasets integration

In benchmarking different multi-batch integration methods, we used Louvain clustering with multilevel refinement algorithms on a shared-nearest-neighbor-based cell graph for each method, and adjusted the resolution parameter to obtain the optimal ARItype de cellule valeur. We then calculated corresponding LISI, iLISI and ARIgrouper valeurs. Additionally, for methods that correct batch effects on the Uniform Manifold Approximation (UMAP) space but not on the gene expression or PCA space in our study [e.g. BBKNN(41)], we applied Hierarchical DBSCAN + UMAP to cluster cells, and adjusted the parameters minPts to optimize the cell-clustering performance for comparisons.

Identification of cell type-specific activated modules

To identify activated modules for each cell type, we first identified cell type-associated modules using a receiver operating characteristic (ROC) curve analysis ( 7). For each gene, we evaluated a classifier that was built on that module alone, to distinguish a specific group of cells from other cells. An AUC value close to 1 indicates that this module is more specifically expressed in a specific cell group. We implemented the above analysis using the FindMarker function provided by Seurat ( 7), with AUC > 0.75 as a threshold to call cell type-associated modules. Then, among the cell type-associated modules, continuous module activity was converted into binary values using AUCell ( 11) and the Spearman's correlation coefficient between each cell type and the binarized module were calculated. The modules with Spearman's coefficient < 0.3 were filtered out. Finally, the resulting modules with statistical significances greater than the threshold (P-value < 0.05, see Supplementary Notes, Section 5 in the Supplementary Materials) were selected and defined as cell type-specific activated modules.

Stability and robustness evaluation of three module-based clustering algorithms

To test the stability of three module-based clustering algorithms [ICAnet, SCENIC ( 11) and SCORE ( 12)], we performed two different tests: (i) down-sampling the datasets with varied cell numbers (2000, 1000, 500 and 100) and (ii) simulation of low-sequencing depth by reducing the expression level to one-fifth of the original. We used the same down-sampling and gene expression simulation procedures for all the three tested methods, and the tSNE+DBSCAN clustering algorithm was performed to evaluate the newly predicted clusters. Finally, we calculated the ARI between the labels of identified clusters and previously annotated cell-type labels. In the clustering step, we ran DBSCAN multiple times, during which we altered the parameter epsilon in the range of 1.0–4.0 and minPts in the range of 1–50 to determine a maximal ARI.

Module recovery analysis

For the ICAnet-weighted PPI network, a K number of different weighted PPI networks were determined. An over estimation of the number of weighted PPI networks results in some false positives during module recovery therefore, we only computed the first independent component and created corresponding weighted PPI networks for the downstream analysis.

Label-association analysis using graph signal processing

To identify which is the novel cell type (or state) among our cell-type labeling results, the intrinsic ‘label association’ between our cell-type annotations and those defined by the original author need to be determined. Inspired by a recently proposed signal-enhancing model ( 44), we used graph signal smoothing to transform the binary ‘cell-type label signal’ into a continuous ‘cell-type label signal’ to enhance label association.

Par conséquent, la oui is the reconstructed continuous signal vector for cell type je. We applied graph smoothing to each cell type to derive their continuous signal vector, and calculated the Pearson's correlation matrix between our annotated cell types and those in the raw cell-type annotations. ?? was assigned a value of 0.8 in this step. Furthermore, we used cor’ = (1+cor)/2 to transform the correlation matrix, and used 0.6 (Pearson's correlation coefficient > 0.2) and the FDR (false discovery rate) < 0.05 as thresholds to identify significant associations.

Analyse d'enrichissement du jeu de gènes

We used the software GSEA (version 4.1.0), a Java desktop application to assess potential enrichment of specific gene sets in a ranked list of differentially expressed genes for each cell type. The curated gene sets are consistent of cancer stemness/risk associated gene-sets ( 45) and AML risk-gene BAALC expression associated gene-set ( 46).

Survival analysis of acute myeloid leukemia (AML) patient based on module activity

To measure the activity levels of modules inferred from the scRNA-seq datasets in bulk RNA expression datasets, we first used gene set variation analysis (GSVA) ( 47) to calculate the module activity in each bulk sample. After converting the gene expression matrix into a module activity matrix, we selected the best subset of modules to predict survival in the training cohort. We used a linear regression model named Least Absolute Shrinkage and Selection Operator (LASSO) implemented by the glmnet R package ( 48). By enabling a 10-fold cross-validation to fit a Cox regression model, we were able to identify an optimized set of modules to predict survival. Owing to the randomness of the LASSO model, we applied a bootstrapping strategy to score each module. This procedure generated 100 resampled datasets from the complete sample sets, with a sample size equal to 80% of the whole samples. LASSO was performed with 10-fold cross validation to optimize the parameters for module selection in each resampled dataset. Finally, we scored each module based on how frequent this module was selected by the regression model during bootstrapping. On the basis of the resulting scores, we selected the top-K modules and performed PAM clustering on the samples guided by the selected feature modules to predict patient survival. We used the Top30 modules as AML patient-associated modules, because they yielded the most significant patient survival difference in the training dataset.


Matériaux et méthodes

Fermentation analysis

Two cultures of C. acetobutylicum ATCC 824 were grown in pH controlled (pH >5) bioreactors (Bioflow II and 110, New Brunswick Scientific, Edison, NJ, USA) [7]. Cell density, substrate and product concentrations were analyzed as described [56].

RNA isolation and cDNA labeling

Samples were collected by centrifuging 3-10 ml of culture at 5,000×g for 10 minutes, 4°C and storing the cell pellets at -85°C. Prior to RNA isolation, cells were washed in 1 ml SET buffer (25% sucrose, 50 mM EDTA [pH 8.0], and 50 mM Tris-HCl [pH 8.0]) and centrifuged at 5,000×g for 10 minutes, 4°C. Pellets were processed similarly to [7] but with the noted modifications. Cells were lysed by resuspending in 220 μl SET buffer with 20 mg/ml lysozyme (Sigma, St. Louis, MO, USA) and 4.55 U/ml proteinase K (Roche, Indianapolis, IN, USA) and incubated at room temperature for 6 minutes. Following incubation, 40 mg of acid-washed glass beads (≤106 μm Sigma) were added to the solution, and the mixture was continuously vortexed for 4 minutes at room temperature. Immediately afterwards, 1 ml of ice cold TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) was added 500 μl of sample was diluted with an equal volume of ice cold TRIzol and purified. Following dilution, 200 μl of ice cold chloroform was added to each sample, mixed vigorously for 15 s, and incubated at room temperature for 3 minutes. Samples were then centrifuged at 12,000 rpm in a tabletop microcentrifuge for 15 minutes at 4°C. The upper phase was saved and diluted by adding 500 μl of 70% ethanol. Samples were then applied to the RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA), following the manufacturer's instructions. To minimize genomic DNA contamination, samples were incubated with the RW1 buffer at room temperature for 4 minutes. The method disrupted all cell types equally, as evidenced by microscopy (data not shown). cDNA was generated and labeled as described [7]. The reference RNA pool contained 25 μg of RNA from samples taken from the same culture at 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 44, 48, 54, 58, and 66 h.

Analyse de puces à ADN

Agilent technology 22k arrays, (GEO accession number GPL4412) as described in [63], were hybridized, washed, and scanned per Agilent's recommendations. Spot quantification employed Agilent's eXtended Dynamic Range technique with gains of 100% and 10% (Agilent's Feature Extraction software (v. 9.1)). Normalization and slide averaging was carried out as described [7, 63]. A minimum intensity of 50 intensity units was used as described [63]. Microarray data have been deposited in the Gene Expression Omnibus database under accession number GSE6094. To gain a qualitative measure of the abundance of an mRNA transcript, the averaged normalized log mean intensity values were ranked on a scale of 1 (lowest intensity value) to 100 (highest intensity value). Genes were clustered using TIGR's MEV program [64].

Quantitative RT-PCR

Q-RT-PCR was performed as described [48]. Specific primer sequences are included in Additional data file 9 CAC3571 was used as the housekeeping gene.

Microscopy

For light microscopy, samples were stored at -85°C after 15% glycerol was added to the sampled culture. Samples were then pelleted, washed twice with 1% w/v NaCl and fixed using 50 μl of 0.05% HCl/0.5% NaCl solution to a final count of 10 6 cells/μl. Slides were imaged using a Leica widefield microscope with either phase contrast or Syto-9 and PI dyes (Invitrogen LIVE/DEAD BacLight Kit) to distinguish cell morphology.

For electron microscopy, samples were fixed by addition of 16% paraformaldehyde and 8% glutaraldehyde to the culture medium for a final concentration of 2% paraformaldehyde and 2% glutaraldehyde. For cultures grown on plates, colonies were scraped from the agar and suspended in 2% paraformaldehyde and 2% glutaraldehyde in 0.1 M sodium cacodylate buffer (pH 7.4). Cultures were fixed for 1 h at room temperature, pelleted and resuspended in buffer.

For transmission electron microscopy, bacteria were pelleted, embedded in 4% agar and cut into 1 mm × 1 mm cubes. The samples were washed three times for 15 minutes in 0.1 M sodium cacodylate buffer (pH 7.4), fixed in 1% osmium tetroxide in buffer for 2 h, and then washed extensively with buffer and double de-ionized water. Following dehydration in an ascending series of ethanol (25, 50, 75, 95, 100, 100% 15 minutes each), the samples were infiltrated with Embed-812 resin in 100% ethanol (1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1 1 h each) and then several changes in 100% resin. After an overnight infiltration in 100% resin, the samples were embedded in BEEM capsules and polymerized at 65°C for 48 h. Blocks were sectioned on a Reichert-Jung UltracutE ultramicrotome and ultrathin sections were collected onto formvar-carbon coated copper grids. Sections were stained with methanolic uranyl acetate and Reynolds' lead citrate [65] and viewed on a Zeiss CEM 902 transmission electron microscope at 80 kV. Images were recorded with an Olympus Soft Imaging System GmbH Megaview II digital camera. Brightness levels were adjusted in the images so that the background between images appeared similar.

For scanning electron microscopy, fixed samples were incubated on poly-L-lysine coated silica wafers for 1 h and then rinsed three times for 15 minutes in 0.1 M sodium cacodylate buffer (pH 7.4). The samples were fixed with 1% osmium tetroxide in buffer for 2 h, washed in buffer and double de-ionized water, and then dehydrated in ethanol (25, 50, 75, 95, 100, 100% 15 minutes each). The wafers were critical point dried in an Autosamdri 815B critical point drier and mounted onto aluminum stubs with silver paint. The samples were coated with Au/Pd with a Denton Bench Top Turbo III sputter-coater and viewed with a Hitachi 4700 FESEM at 3.0 kV.

Phylogenetic tree generation

Based on the genome annotations available at NCBI, we considered any sigma factor that was annotated as σ 70 or unannotated. A second filter was applied by requiring that all the sequences should contain a Region 2, the most conserved region of the σ 70 protein. All members of this class of sigma factor contain Region 2, and it was modeled with the HMM pfam04542. This criterion removed CAC0550, CAC1766 and CAP0157, but they were added to the list again despite their lack of a Region 2. The alignment was made using ClustalW 1.83 using the default settings and visualized as a radial tree as created by Phylodraw v. 0.8 from Pusan National University.

Generation and characterization of antisense strains

Oligonucleotides were designed to produce asRNA complementary to the upstream 20 bp and first 30-40 bp of the targeted genes' transcripts (Additional data file 7). The constructs were cloned into pSOS95del under the control of a thiolase (thl) promoter and confirmed by restriction digest. Plasmids were then methylated and transformed into C. acetobutylicum ATCC 824, as previously described [33, 55, 56]. Strains were grown in 10 ml cultures and characterized using microscopy and HPLC to analyze final product concentrations [56].


Objectifs

By doing this course well, students will develop basic knowledge and skills in cell and molecular biology and become aware of the complexity and harmony of the cell. As students proceed through the modules, they will be able to apply this knowledge, skill, and awareness to topics like the following:

  • Basic properties of cells
  • Prokaryotic and eukaryotic cells
  • Virus
  • Biological molecules: carbohydrates, lipids, proteins, and nucleic acids
  • Techniques used in cell and molecular biology
  • Enzymes
  • Métabolisme
  • Mitochondrion structure and function
  • Chloroplast structure and function
  • Plasma membrane composition, structure, and function
  • The movement of substances across cell membranes
  • The endomembrane system
  • The extracellular matrix
  • The structure and function of the nucleus
  • Genes and chromosomes
  • Réplication de l'ADN
  • Transcription
  • Traduction
  • Cytoskeleton and cell motility
  • Cellular reproduction
  • Cell signaling
  • Cancer

Résumé

Semen cryopreservation is a well-established procedure used in veterinary assisted reproduction technology applications. We investigated damaging effects of cryopreservation on the structural and ultrastructural characteristics of bull sperm induced at different temperatures and steps during standard cryopreservation procedure using transmission (TEM) and scanning electron microscopy. We also examined the effect of cryopreservation on sperm DNA and chromatin integrity. Five healthy, fertile Friesian bulls were used, and the ejaculates were obtained using an artificial vagina method. The semen samples were pooled and diluted in a tris-yolk fructose (TYF) for a final concentration of 80 × 10 6 spermatozoa/ml. The semen samples were packed in straws (0.25 ml), and stored in liquid nitrogen (−196°C). Samples were evaluated before dilution, just after dilution (at 37°C), at 2 h and 4 h during equilibration, and after thawing (37°C for 30 s in water bath). In association with step-wise decline in motility and viability, our results showed that the plasma membrane surrounding the sperm head was the most vulnerable structure to cryo-damage with various degrees of swelling, undulation, or loss affecting about 50% of the total sperm population after equilibration and freezing. Typical acrosome reaction was limited to 10% of the spermatozoa after freezing. We also observed increased number of mitochondria with distorted cristae (15%). Chromatin damage was significantly increased by cryopreservation as evident by TEM (9%). This was mainly due to DNA breaks as confirmed by Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA) (8.4%) whereas the chromatin structure was less affected as evaluated microscopically by toluidine blue staining. We concluded that, using standard cryopreservation protocol, the most pronounced damage induced by cryopreservation is observed in the plasma membrane. Further improvement of cryopreservation protocols should thus be targeted at reducing plasma membrane damage. Acrosomal, mitochondrial and chromatin damage are also evident but appear to be within acceptable limits as discussed.


La faculté

Michael Ailion | Neuromodulator release and signaling at the cellular and organismal levels.

Chip Asbury | Molecular basis of mitosis.

Jihong Bai | How synapses are assembled into functional circuits using a combination of genetic, biochemical, imaging, and electrophysiological methods..

Wyeth Bair | Computer modeling and electrophysiology of the visual system.

Sandra Bajjalieh | Cell biology of neurons with emphases on membrane trafficking and lipid signaling pathways.

Melissa Barker-Haliski | Preclinical models of epilepsy and mechanisms of epileptogenesis in the elderly.

Andres Barria | Molecular mechanisms controlling synaptic function and plasticity. Role of NMDA receptors.

Michael Beecher | Auditory communication in birds

Olivia Bermingham-McDonogh | Mechanisms of development and regeneration of the mammalian auditory system.

Marc Binder | Properties of voltage-gated membrane channels.

Martha Bosma | Development of central nervous system neurons using physiological and molecular techniques.

Mark Bothwell | Growth factor mechanisms in neural development and degenerative disease.

Geoffrey Boynton | Functional organization of human visual perception.

Eliot Brenowitz | Neural basis of biologically relevant behavior in animals, and the cellular and molecular mechanisms of plasticity in adult brains.

Michael Bruchas | Dr. Bruchas’ laboratory focuses on understanding how brain circuits are wired, how they communicate with one another, and dissecting the neural basis of stress, emotion and reward.

Bingni Brunton | Data-driven low-dimensional dynamic models of neuronal networks.

Linda Buck | Odors, tastes, pheromones, stimulating specific behaviors or physiological effects in conspecifics.

Steven Buck | Focuses on human color vision and linking perceptual visual experience and the underlying neural/genetic substrate.

Elizabeth Buffalo | Our research is aimed at understanding the neural mechanisms that support learning and memory.

Clemens Cabernard | The Cabernard lab is studying asymmetric cell division (ACD), a process that generates cellular diversity.

Erik Carlson | The study of cerebro-cerebellar circuits in mice relevant to neuropsychiatric and neurodegenerative disease.

Steven Carlson | Synapse formation – focusing on the formation of the active zone, the site of neurotransmitter release in the nerve terminal.

William Catterall | Molecular basis of electrical excitability molecular and cellular biology of ion channels function of calcium channels in neurotransmission.

Charles Chavkin | Using mouse genetic and optical stimulation of CNS pathways, we study how stress exposure affects depression, drug addiction risk, and cognition by affecting neural circuits and molecular signaling.

Daniel Chiu | The development of new tools, based on nanmaterials, optics, and microfluidics, for interfacing and interrogating neuronal systems and synaptic function at the nanometer scale.

Howard Chizeck | Biorobotics, telerobotics and neural engineering.

Eric Chudler | Cortical and basal ganglia mechanisms of nociception and pain, the neuroactive properties of medicinal plants and herbs, and translating basic neuroscientific research into language and activities for the general public.

John Clark | Characterizing the functional mechanism for the protective actions of the stress protein, human alphaB crystallin, a lens protein that is upregulated in aging diseases and protects against protein unfolding/misfolding and aggregation in Alzheimer’s, Huntington’s, Parkinson’s disease and cataracts.

David G. Cook | Molecular mechanisms of neurodegenerative disorders.

Mark Cooper | Gastrulation and neurulation in zebrafish embryos cell motility.

Ellen Covey | Structure and function of the central auditory system and the neural basis of echolocation neural mechanisms for processing temporal patterns of sound.

Dennis Dacey | Structure and function of the primate retina.

Valerie Daggett | Molecular modeling of proteins implicated in disease. Design and testing of diagnostic and therapeutic agents for neurodegenerative diseases.

Raimondo D’Ambrosio | Pathophysiology of glial cells and basic mechanisms of epilepsy. Specific current interest include glial extracellular ion homeostasis in traumatic brain injury, stroke and posttraumatic epilepsy membrane potassium channels edema.

Thomas Daniel | Sensorimotor control of animal movement.

Marie Y. Davis | The goal of my research is to understand mechanisms causing neurodegeneration in human movement disorders.

Horacio de la Iglesia | Neural basis of circadian behavior.

Nikolai C. H. Dembrow | How dendritic integration and the neuromodulation of intrinsic neuronal properties in distinct neuron types shapes neocortical function.

Peter Detwiler | Signal transduction in retinal photoreceptors.

Ajay Dhaka | Biology of somatosensation via molecular, cellular, developmental and behavioral investigation.

Jaime Diaz | Disruptions of the growth program affecting adult brain function and how other metabolic systems function.

Adrienne Fairhall | Computational approaches in neuroscience: adaptive and multimodal sensory processing, biophysics of computation by single neurons and small circuits, algorithms of computation in diverse systems .

Angela Fang | neurobiological correlates of maladaptive social cognition in anxiety and obsessive-compulsive related disorders to inform personalized treatment prediction role of oxytocin in the pathophysiology of these disorders.

Susan Ferguson | Using novel viral vector methods to unravel the role of cortico-basal ganglia circuitry in the development of behaviors that contribute to drug addiction, as well as in the processes that regulate decision-making, motivation and impulsivity.

Eberhard Fetz | Properties of cortical and spinal neurons controlling limb movement in primates dynamic neural network modeling implanted recurrent brain-computer interfaces.

Ione Fine | Effects of long-term visual deprivation, perceptual learning and plasticity, psychophysics, fMRI and computational vision.

Albert Folch | Neurobiology on a chip (Neuro-MEMS): Microengineered systems to study synaptogenesis, axon guidance, ion channel activity, and olfaction, among other neuroscience topics

Stanley Froehner | Molecular basis of synapse formation and function.

Jose M. Garcia | My research focuses on neuroendocrinologic aspects of traumatic brain injury and on hormonal pathways in wasting conditions.

David Gire | How neural circuits process natural spatiotemporal olfactory sensory cues to guide flexible, ethologically relevant behaviors.

Sam A. Golden | Neurobiology and circuitry of affective social behaviors and neuropychiatric disease.

Sharona Gordon | Ion channel biophysics & trafficking and regulation of neuronal plasticity in sensory transduction.

Thomas Grabowski | Functional magnetic resonance imaging studies of the neural systems basis of language and cognition in health and disease.

Brock Grill | Proteomic and genetic interrogation of neuronal signaling.

Chris Hague | Functional characterization of adrenergic receptors.

Julie Harris | Understanding the relationship between anatomical and functional neural circuitry between brain areas in normal and disease states.

Jeffrey Herron | Developing new research tools and systems to explore the applications of bi-directional neural interfaces to enable or improve the treatment of neurological diseases, disorders, and injuries.

Bertil Hille | Modulation of ion channels by G protein coupled receptors and membrane phosphoinositide lipids.

Greg Horwitz | Visual perception and viral vector-mediated gene transfer in primates.

Clifford Hume | Mammalian inner ear development, gene therapy of inner ear disorders, and imaging analysis of the inner ear.

James Hurley | Mechanisms of phototransduction light and dark adaptation.

Sandra Juul | Developing neuroprotective strategies for infants at high risk for neurodevelopmental impairment using in vivo and in vitro models of preterm and term brain injury.

Brian Kalmbach | Neurophysiology of primate neocortical cell types. Ion channels, neuromodulators and related genes.

Franck Kalume | Investigations of mechanisms and treatments of genetic epilepsies in animal models.

Jeansok Kim | Neurocognitive effects of stress basic mechanisms of fear.

Natalia Kleinhans | Multimodal imaging and neuropsychological assessment of neuropsychiatric disorders.

Andrew Ko |My research focuses on human electrophysiological and imaging correlates of behavior, disease, and interventions for epilepsy, movement disorders and pain.

Brian Kraemer |Molecular causes of neurodegeneration in Alzheimer’s disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), and related disorders of the nervous system.

Patricia Kuhl | Speech perception throughout the lifespan with an emphasis on early development behavioral as well as ERP, fMRI, and MEG studies on language processing.

Adrian KC Lee | Auditory brain sciences and neuroengineering.

Ed Lein | Molecular, cellular and circuit organization of the developing and adult human neocortex.

Nicole Liachko | Seeks to understand the biology underlying neurodegenerative diseases of aging including Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Alzheimer’s disease.

Michael Manookin | Neural circuits, cells, and synapses that mediate early visual processing.

Ludo Max | The role of sensorimotor integration in human motor learning and motor control, with an emphasis on auditory-motor learning in speech production and visuo-motor integration in limb movements.

G. Stanley McKnight | The role of intracellular signaling systems in the neuronal circuits that affect feeding and energy metabolism.

Kathleen Millen | The Millen laboratory uses molecular genetic approaches to explore the pathogenesis of congenital birth defects of the human and mouse brain and to study genes essential for normal neurodevelopment.

Dana Miller | We use C. elegans to understand how changes in environmental conditions are integrated into organism physiology, and how these responses modulate cellular processes involved in neurodegeneration.

Sheri J.Y. Mizumori | Neurobiology of learning and memory.

Cecilia Moens | Developmental genetics of brain patterning in the zebrafish.

William Moody | The role of spontaneous activity in cortical development, with some emphasis on the basic mechanisms underlying pediatric epilepsy.

Randall Moon | Functions and mechanisms of action of the wnt signaling pathways in embryonic development, regeneration, and diseases, and development of therapies to treat these diseases based on high throughput small molecule screens and genome-wide RNAi screens.

Claudia Moreno | Molecular mechanisms of aging.

Chet Moritz | We are developing neuroprosthetic technology for the treatment of paralysis and other movement disorders.

Gabe J. Murphy | We determine how particular synapses, cells, and circuits organize and extract the information that enables visually-guided behavior.

Scott O. Murray | Understand the brain mechanisms and cognitive process by combining behavioral and functional (fMRI) measurements of neural activity.

Neil M. Nathanson | Regulation of expression and function of muscarinic and neurokine receptors.

Jay Neitz | Biology of vision and vision disorders.

Maureen Neitz | Biology of vision and vision disorders.

John Neumaier | Molecular, cellular, and circuitry aspects of stress and addiction.

Jeffrey Ojemann | Electrocorticography studies of cognition and brain-computer interface.

Jaime Olavarria | Structure, function, and development of topographically organized circuits in the mammalian visual system.

Shawn Olsen | Cortical mechanisms of visual behavior and cognition.

Amy Orsborn | Engineering and understanding learning to develop neural interfaces

Lee Osterhout | Psychological and neural underpinnings of human language psychophysiological studies of human language and memory.

Leo Pallanck | Genetic analysis of neurotransmitter release mechanisms in Drosophile.

Richard Palmiter | Our laboratory uses mouse genetic models and viral gene transfer to dissect neural circuits involved in innate behaviors.

Jay Parrish | We are broadly interested in understanding the form and function of somatosensory neurons in Drosophila.

Anitha Pasupathy | Neural basis of visual shape representation and recognition in the primate brain.

David Perkel | Neural mechanisms of learning, focusing on vocal learning in songbirds anatomical and electrophysiological techniques for study of neuronal processing related to behavior.

Steve I. Perlmutter | Understanding and manipulating neural plasticity in mammalian motor systems to develop new therapies that improve recovery after spinal cord injury and brain damage.

Paul Phillips | The role of rapid dopamine neurotransmission in motivated behavior and decision making, and its dysfunction in mental health disorders including addiction.

Nicholas Poolos | Mechanisms of ion channel dysregulation in epilepsy, and impact on dendritic excitability.

Chantel Prat | My research investigates the biological basis of individual differences in language and cognitive abilities.

Daniel Promislow | We use quantitive genetics and systems biology to identify naturally occurring modifiers of neurodegenerative disease in the fruit fly.

David Raible | Zebrafish mechanosensory hair cell development, damage and regeneration: models for hearing loss.

Akhila Rajan | Fat-brain communication: how fat signals to the brain.

Jan-Marino (Nino) Ramirez | Understanding the neuronal basis of a variety of brain functions to find novel ways to treat and cure neurological disorders in children, including epilepsy, Rett syndrome, brain tumors, and sudden infant death syndrome.

Rajesh P.N. Rao | Computational neuroscience, machine vision and robotics, and brain-computer interfaces.

Wendy Raskind | The genetic etiologies of Mendelian neurodegenerative disorders, including ataxias and parapareses, and the complex neurobehavioral disorder dyslexia.

Jeff Rasmussen | Molecular and cellular regulation of zebrafish somatosensory neuron development and repair

Tom Reh | Determination of the mechanisms that control neuronal proliferation and differentiation during neurogenesis of the vertebrate CNS.

R. Clay Reid | Deciphering how information is encoded and processed in neural networks of the visual system, using behavior, anatomy and physiology.

Fred Rieke | Visual signal processing and computation phototransduction.

Jeff Riffell | Olfactory neurobiology and chemical communication processes.

Farrel R. Robinson | Cerebellar control of movements using monkey eye movements as a model.

Ariel Rokem | Conducts research on the biological basis of brain function using computational tools that we develop and maintain.

Edwin Rubel | evelopment and habilitation of the inner ear and CNS auditory pathways.

Jay Rubinstein | Signal processing, physiology, and perception with inner ear implants using both computational modeling and experimental techniques.

Hannele Ruohola-Baker | Regulation of stem cell self renewal and regeneration.

Ramkumar Sabesan | Functional imaging of the human retina.

Abigail G. Schindler | Computational medicine, iterative translation, and systems biology to understand traumatic stress and its comorbidities.

John Scott | Specificity of synaptic signaling events that are controlled by kinase anchoring proteins.

Eric Shea-Brown | Computational and theoretical neuroscience.

Andy Shih | Our lab uses imaging approaches to better understand the regulation of brain microvascular health, and the factors that lead to its dysfunction during disease.

Joseph Sisneros | Understanding how the vertebrate auditory system processes species-specific vocalizations and the adaptive mechanisms that are used to optimize the receiver’s sensitivity to social communication signals.

Stephen Smith | The behavior of protein interaction networks at the neuronal synapse.

William Spain | Transformation of synaptic inputs into patterns of action potential output information flow within the network of neurons.

Kat Steele | Dynamics and control of human movement.

Nicholas A. Steinmetz | Distributed neural circuits underlying visually-guided behavior in mice.

Nephi Stella | Activation of immune cells in the CNS.

Jennifer Stone | Study of cellular and molecular mechanisms underlying generation of sensory hair cells in the inner ear during development, under normal conditions, and after injury.

Daniel Storm | Molecular and cellular basis of long-term memory and memory persistence using an interdisciplinary approach.

Garret Stuber | Research in the Stuber lab uses an interdisciplinary approach to study the neural circuit basis of motivated behavior.

Jane Sullivan | Cellular and molecular mechanisms controlling synaptic transmission and plasticity.

Billie Swalla | he evolution of chordates, especially the central nervous system. We are studying the gene networks that specify the central nervous system, in invertebrate deuterostomes and chordate embryos and adults.

Gregory W. Terman | Neurophysiology and pharmacology of synaptic plasticity in pain transmission pathways of the central nervous system as a model for the pathogenesis of chronic pain.

James Thomas | Molecular evolution, especially the evolution and function of gene families implicated in environmental interactions and other rapidly changing selective pressures. Work is mostly on nematode and mammalian gene families, with some comparative analyses to other groups.

Jonathan T. Ting | Biophysical, anatomical, and molecular features of human neocortical cell types and leverage this information to develop novel molecular genetic tools for accessing and perturbing brain cell types across diverse mammalian species.

Eric Turner | The mechanisms of brain development and neural gene regulation, and brain pathways affecting mood and anxiety. Using transgenic mouse models.

John Tuthill | Neural mechanisms of somatosensory processing and adaptive motor control.

Russell Van Gelder | Natural and synthetic inner retinal and extraocular photoreception.

Oscar Vivas | My lab uses electrophysiology and imaging to understand the changes in the autonomic nervous system during aging.

Jack Waters | Cells and circuits of the neocortex and their modulation with behavioral state, studied primarily with optical techniques.

Kurt Weaver | My research focuses on the dynamic interplay between large-scale neural systems and cognitive function, how this interaction can better inform contemporary models of neurological and psychiatric disorders.

Sara J. Webb | The use of physiological and neuroimaging methods to study attention, perception and social learning in children and adults with autism and other neurodevelopmental disorders

Jonathan Weinstein | The neuroimmune response in stroke and ischemic preconditioning (IPC) with emphasis on the role of type 1 interferon signaling in microglia in IPC-mediated endogenous neuroprotection.

John Welsh | Our work focuses on the role of neuronal oscillation in cognitive and motor function.

Rachel Wong | Circuit assembly and reassembly in the developing nervous system.

Zhengui Xia | The effect of genes and environmental exposure on adult neurogenesis, cognitive impairment, and neurodegeneration.

Libin Xu | The roles of lipid oxidation and metabolism in neurological diseases.

Smita Yadav | Elucidating the role of kinase signaling in neuronal development and disease using chemical-genetics, proteomics and stem cell techniques.

Azadeh Yazdan-Shahmorad | Developing novel neural technologies for neurorehabilitation.

Jason Yeatman | Quantitative neuroimaging of brain development and learning to read

Jessica Young | Building robust human models of Alzheimer’s disease.

Cyrus P. Zabetian | The genetics of neurodegenerative diseases with an emphasis on Lewy body disorders.

William N. Zagotta | Mechanisms of ion channel function.

Jing Zhang | Proteomics investigation of molecular mechanisms of Parkinson’s disease, and biomarker discovery for neurodegenerative diseases.

Larry Zweifel | Understanding the mechanisms of phasic dopamine-dependent modulation of reward and punishment, and the role of dopamine in generalized fear and anxiety.


Résumé

Mitochondrial quality is under surveillance by autophagy, the cell recycling process which degrades and removes damaged mitochondria. Inadequate autophagy results in deterioration in mitochondrial quality, bioenergetic dysfunction, and metabolic stress. Here we describe in an integrated work-flow to assess parameters of mitochondrial morphology, function, mtDNA and protein damage, metabolism and autophagy regulation to provide the framework for a practical assessment of mitochondrial quality. This protocol has been tested with cell cultures, is highly reproducible, and is adaptable to studies when cell numbers are limited, and thus will be of interest to researchers studying diverse physiological and pathological phenomena in which decreased mitochondrial quality is a contributory factor.


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