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Produits PCR sans bande en gel


Je suis étudiant au doctorat et je suis coincé avec les résultats sans bande dans le gel.

j'utilise ce qui suit

  • 1 microlitre Primer R (20mM)
  • 1 microlitre Primer f (20mM)
  • 1 microlitre de dNTP (10mM)
  • 1 microlitre de matrice d'ADN (448 ng)
  • 1 microlitre de TAQ polymérase
  • Tampon de 5 microlitres (10x) ajouté MgCl2 par 1:1
  • 30 microlitres d'eau de qualité PCR

Programme:

  • 95 pendant 4 minutes
  • 95 pendant 45 secondes
  • 55-65 pour 1,20 minute
  • 72 pendant 1 minute
  • Dégradé 35 cycle
  • 72 pendant 4 minutes

Gel:

110 volts, 200 mPA pendant 30 à 45 minutes

Je reçois des produits PCR comme sur les images. Il n'y a pas de bandes alors qu'il y a des bandes intenses au fond et dans certains puits.

Ma question est, est-ce qu'il s'agit de produits en bas ?? que peut-on faire pour les rendre réels ? Sinon, pourquoi y a-t-il des différences entre les deux voies de puits. Chaque 12 puits représente un type de matrice d'ADN (j'ai utilisé l'ADN de trois organismes différents).


Utilisez des amorces de contrôle ciblant quelque chose qui donne à coup sûr un produit. Si vous n'en avez pas, demandez à vos collègues ou prenez-en dans la littérature. Assurez-vous que votre produit est suffisamment petit pour être amplifié dans le temps imparti et vérifiez la bande correcte avec une enzyme de restriction.


Je ne suis pas sûr de l'échelle de votre échelle, mais quel que soit l'ADN à l'origine du baguage, il est très petit. Ce sont très probablement des dimères d'amorces. Je vérifierais les séquences d'amorces pour m'assurer qu'il n'y a pas beaucoup de complémentarité. Vous pouvez également essayer de manipuler les conditions de réaction telles que la concentration de chlorure de magnésium ou les amorces elles-mêmes, etc. J'exécuterais un ensemble d'optimisation de PCR avec des conditions de réaction variables.


Ma première supposition serait que vous utilisez trop d'ADN modèle pour ces conditions. Vos puits s'éclairent un peu, 448 ng sont également élevés.

Essayez des concentrations plus faibles d'ADN matrice (1-100 ng), peut-être seulement avec une étape d'hybridation à 55 ° C. Pour le moment, vous n'avez aucun produit du tout, donc je ne m'inquiéterais pas encore de la non-spécificité (et 10 °C est également une plage assez petite pour résoudre ce problème).

D'autres choses qui ressortent :

  • Je suppose que c'est une amorce de 20 uM, pas mM
  • Vous ajoutez trop de tampon
  • Il semble que vous fassiez chaque réaction individuellement (en regardant les quantités de modèles dans les 12 premiers), je suggère de faire un master mix et de l'aliquoter.
  • Vous disposez de suffisamment d'espace pour faire fonctionner votre gel plus longtemps, ce qui pourrait être très utile si vous obtenez du produit.

Vous devriez aussi avoir un peu plus d'informations. Quelle est la taille des produits que vous attendez ? Utilisez-vous des organismes à GC élevé ? Ces amorces fonctionnaient-elles auparavant pour d'autres personnes ? L'ADN génomique fonctionnait-il auparavant pour d'autres personnes ?

NEB a beaucoup d'informations utiles sur la PCR et d'autres travaux sur l'ADN sur son site Web, consultez-le : https://www.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/guidelines-for-pcr-optimization-with -taq-ADN-polymérase


Ce que vous pouvez essayer, ce sont différentes solutions tampons (10 x), également avec ou sans MgCl2. Dans le laboratoire où je travaillais avec la PCR, nous avions un panel de différents tampons PCR dans le congélateur. Nous avons testé certains d'entre eux, pour voir lequel convenait le mieux (d'où celui qui donnait la bonne taille de bracelet). Tout comme votre gradient de température, pour voir lequel fonctionne le mieux.


Vous pouvez essayer une PCR touchdown. Il est souvent utile lorsqu'aucun groupe n'est présent.


7.4 : Exercice 2 - Prédire les tailles des produits PCR

  • Contribution de Clare M. O&rsquoConnor
  • Professeur agrégé émérite (biologie) au Boston College

Dans le prochain laboratoire, vous analyserez vos produits de réaction PCR sur un gel d'agarose qui sépare les molécules d'ADN en fonction de leur taille. Pour interpréter ces résultats, il sera important d'avoir calculé les tailles attendues des produits PCR à partir de vos réactions. Pour faciliter ces calculs, préparez une carte simple de la région génomique contenant votre gène avec les séquences d'amorces alignées contre la séquence du génome. Tous les produits PCR doivent contenir une partie du RENCONTRÉ région flanquante du gène 5 en raison de l'amorce A. Un produit PCR peut ou non contenir des parties de la RENCONTRÉ gene&rsquos CDS, selon que vous analysez une souche avec le natif ou perturbé RENCONTRÉ gène. Pour construire votre carte, vous pouvez profiter d'enregistrements spéciaux de séquences de génomes préparés par les conservateurs SGD. Ces enregistrements contiennent le CDS de votre RENCONTRÉ gène avec 1 kb de séquence amont et 1 kb de séquence aval. Les conservateurs de SGD ont généré ces enregistrements parce que les chercheurs sont souvent intéressés par l'étude des éléments régulateurs qui contrôlent la transcription d'un gène et le traitement des transcrits géniques. Dans S. cerevisiae, ces éléments de régulation sont généralement situés à moins de 1 kb du CDS.

A est 357 nucléotides en amont du SAM1codon d'initiation (nucléotide 1001). Les produits ancrés dans l'amorce B ajoutent 280 pb de CDS au produit PCR. La taille attendue du produit PCR est de 357 + 280 pb, soit 637 pb. Si la souche de délétion avait été utilisée pour la PCR, laSAM1 les amorces A et B ne généreraient pas de produit PCR. Au lieu, SAM1 amorce A etKAN R l'amorce B générerait un produit de 607 pb (357 + 250), car le KAN R l'amorce B se lie aux nucléotides 231-250 du KAN R CDS.

Vous aurez besoin de deux fenêtres de navigateur pour cet exercice. Chaque membre du groupe doit travailler avec un seul gène.

Trouvez la séquence génomique de votre gène.

&bull Accédez à la page de résumé de votre gène dans le SGD (yeastgenome.org)
&bull Cliquez sur l'onglet Séquence en haut de la page de résumé.
&bull Curseur jusqu'à la séquence du gène pour S288C. Sélectionnez &ldquoSéquence génomique +/- 1kb&rdquo dans la liste déroulante.
&bull Notez ci-dessous les coordonnées de début et de fin de la séquence et calculez la longueur de la séquence. (Vous devriez voir le codon de départ ATG aux nucléotides 1001-1003.)

Longueur de la séquence (pb) __________

Longueur de la séquence codante ___________

Alignez les séquences d'amorces avec la séquence génomique.

Pour trouver la position sur les amorces dans la séquence génomique, nous utiliserons l'outil NCBI&rsquos BLAST. BLAST signifie Basic Local Alignment Search Tool et peut être utilisé pour aligner des séquences de protéines ou d'acides nucléiques. Vous en apprendrez plus sur les algorithmes BLAST au chapitre 9.

  • Dirigez votre navigateur vers le site NCBI et sélectionnez BLAST dans la liste de ressources sur la droite.
  • Sélectionnez Nucleotide BLAST dans la liste des programmes Basic BLAST.
  • Cliquez sur la case &ldquoAlignez au moins deux séquences.&rdquo Copiez le &ldquoséquence génomique +/- 1kb&rdquo de

SGD et collez la séquence dans la zone de séquence du sujet inférieure.

ont une longueur de 25 nucléotides. C'est plus court que la valeur par défaut de 28 pour &ldquowords&rdquo dans BLASTN (l'algorithme de comparaison des séquences de nucléotides). BLAST n'alignera pas deux séquences si la correspondance est inférieure à 28 nucléotides. Développez les &ldquoalgorithm parameters&rdquo en bas de la page. Sélectionnez une &ldquoword size&rdquo inférieure à 28.

Dessinez une carte de vos sites de liaison de gènes et d'amorces dans l'espace ci-dessous. Incluez le codon de départ et les distances en pb.


La structure de l'agarose

L'agarose, produit à partir d'algues, est une gélose polysaccharidique. Au cours de la polymérisation, les polymères d'agarose se lient de manière non covalente et forment un réseau de faisceaux. Ce réseau est constitué de pores aux propriétés de filtrage moléculaire.

Rendu conceptuel du gel d'agarose à un niveau microscopique.

La séparation de l'ADN se produit en raison de la nature en forme de maille du gel d'agarose. Les fragments d'ADN plus petits peuvent se déplacer rapidement à travers les pores, tandis que les fragments plus gros attrapé et donc voyager lentement.

Regardons comment tout cela fonctionne. Sous un microscope puissant, un gel paraîtra poreux, mais à l'œil nu, il ressemble à une gélatine lisse et opaque en forme de carré avec puits près d'une extrémité de la surface. Un puits est une poche creuse dans le gel où l'ADN est chargé. En raison du squelette phosphate chargé négativement, l'ADN détient une légère charge négative qui permet à la molécule de migrer vers l'anode chargée positivement. La distance de déplacement des molécules d'ADN dans un gel d'agarose est proportionnelle au log de son poids moléculaire.


MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Tampons et solutions—

Les tampons Tris acétate-EDTA (TAE) et Tris-EDTA (TE) (10 × ) sont préparés comme décrit par Sambrook et Russell [ 4 ]. Le tampon Topoisomérase 1 (10 × ) contient du Tris-HCl (0,5 M ), pH 7,5 KCl (0,5 M ) MgCl2 (0,1 M ) EDTA (1,0 m M ) dithiothréitol (DTT) (5,0 m M ) et albumine de sérum bovin (300 ug/ml). Le tampon de stockage de topoisomérase (1 × ) contient du phosphate de potassium (30 m M , pH 7,0) DTT (5,0 m M ) EDTA (0,1 m M ) glycérol (50 % v/v) et Triton X-100 (0,1 % w/v) . Le tampon React™ 3 a été obtenu auprès d'Invitrogen (Carlsbad, CA). La solution d'échantillon de gel d'ADN contient 0,1 % (p/v) de bleu de bromophénol à 10 % (v/v) de glycérol dans du Tris 0,05 M, pH 7. La solution de coloration au bromure d'éthidium contient 10 l d'une solution à 10 mg/ml de bromure d'éthidium dans 100 ml d'eau déminéralisée.

ADN plasmidique—

L'ADN plasmidique (pUC118, numéro d'accession Genbank U07649.1, 3162 pb) [ 5 ] est préparé à partir de cultures de 250 ml de Escherichia coli qui ont été transformés avec pUC118 et cultivés comme décrit dans Sambrook et Russell [ 4 ]. Après récolte par centrifugation, l'ADN plasmidique est obtenu à partir du culot de bactéries par lyse alcaline au SDS et est purifié par centrifugation à l'équilibre dans des gradients continus de chlorure de césium-bromure d'éthidium. Le plasmide purifié est mis en suspension dans du tampon TE pour donner une concentration finale d'ADN de ∼1 mg/ml et stocké à –20 °C. Une culture de 250 ml donne généralement environ 0,5 à 1 mg d'ADN. L'ADN plasmidique préparé de cette manière donne systématiquement de meilleurs résultats pour cette pratique qui fait de l'ADN préparé par des méthodes chromatographiques à base de résine.

ADN M13—

Une culture de E. coli JM109 est infecté par le bactériophage M13mp18 [ 6 ] (numéro d'accès Genbank M77815.1, 7250 nt) comme décrit dans Sambrook et Russell [ 4 ]. Les cellules infectées sont ajoutées à des lots de 250 ml de milieu Luria Bertani dans des flacons de 2 litres et incubées à 37°C pendant 5 h avec une aération vigoureuse. Les cellules infectées et les particules de phage sont séparées par centrifugation. Les particules de phage sont précipitées par du polyéthylène glycol et sédimentées par centrifugation. L'ADN circulaire simple brin est isolé de ce culot par les procédures décrites dans Sambrook et Russell [ 4 ]. La forme circulaire fermée de manière covalente de l'ADN M13 est isolée du culot bactérien par la procédure de lyse alcaline également décrite dans Sambrook et Russell [ 4 ], et purifiée par centrifugation à l'équilibre dans du chlorure de césium-bromure d'éthidium comme décrit ci-dessus. Les deux formes d'ADN sont mises en suspension à une concentration appropriée (0,5 à 1 mg/ml) dans du tampon TE et conservées à –20 °C.

Enzymes—

L'endonucléase de restriction EcoRI et la topoisomérase I d'ADN de thymus de veau sont obtenues auprès d'Invitrogen. L'ADN Topoisomérase I est dilué dans un tampon de stockage de topoisomérase immédiatement avant l'expérience.

Solution de gel d'agarose—

Ceux-ci sont fabriqués à partir d'une solution à 0,7% d'agarose dans du tampon TAE.

Séances 1 et 2

Boîte de gel horizontale avec peigne (10 puits, session 1 20 puits, session 2). Alimentation adaptée.

100 ml d'agarose à 0,7% dans 1 x tampon TAE. (Fondu et maintenu à 55 °C dans un bain-marie. Ne pas ajouter de bromure d'éthidium à l'agarose.)

1 × tampon TAE suffisant pour l'appareil de gel utilisé.

100 ml de solution de coloration au bromure d'éthidium.

Microtubes à centrifuger de 1,5 ml.

Pipettes réglables (2–20 l, 20–200 l, 0,1–1,0 ml) avec embouts appropriés.

Session 1

70 l d'ADN plasmidique (∼0,5–1 mg/ml) dans du tampon TE.

Spectrophotomètre capable de lectures à 260 nm.

Cuves transparentes aux UV de 1 ml.

Séance 2

20 µl d'ADN plasmidique (200 µg/ml en tampon TE).

20 µl d'ADN M13 CCC (200 µg/ml en tampon TE).

20 µl d'ADN circulaire simple brin M13 (200 µg/ml en tampon TE).

10 l d'ADN de thymus de veau Topoisomérase I (Invitrogen) (1 unité/μl dilué dans du tampon de dilution de topoisomérase juste avant le début de la pratique).

15 µl de tampon de réaction topoisomérase (10 x ).

20 l d'un mélange d'étalons de taille d'ADN double brin de 1 kpb (échelle Invitrogen 1 kb).


Méthodes de laboratoire en enzymologie : ADN

1 Théorie

La séparation des acides nucléiques en fonction de leur taille est requise pour de nombreuses pratiques de laboratoire courantes (par exemple, sous-clonage, diagnostics génotypiques, RT-PCR). La séparation des acides nucléiques par électrophorèse sur gel d'agarose fonctionne en exploitant la charge négative du squelette phosphate des acides nucléiques. Les molécules d'ADN et d'ARN ont une charge négative nette répartie uniformément sur toute leur longueur afin qu'elles se déplacent à travers une matrice d'agarose dans un champ électrique vers le pôle positif. Les acides nucléiques plus courts pourront migrer à travers la matrice plus rapidement que les plus gros pendant une période de temps donnée. Selon le pourcentage d'agarose utilisé pour fabriquer le gel, la plage de séparation linéaire variera.


Pas d'amplification

1. Essayez à nouveau la réaction, vous avez peut-être oublié quelque chose.

2. Vérifiez que le tampon polymérase a été complètement décongelé et bien mélangé.

3. Vérifiez que les amorces ont été diluées à la bonne concentration.

4. Créez une nouvelle solution dNTP. Les dNTP peuvent être détruits par des cycles de gel-dégel répétés.

5. Recréez l'ADN matrice, surtout si vous travaillez avec de l'ADN génomique. Les vieux stocks peuvent être dégradés ou cisaillés.

6. Utilisez une polymérase différente. Si une amplification pose problème avec une polymérase de relecture, j'essaie souvent d'utiliser du bon vieux Taq et cela résout souvent le problème. N'oubliez pas de séquencer l'insert, mais si vous êtes chanceux, il n'y aura pas de mutations significatives et vous pouvez utiliser l'insert tel quel. Sinon, refaites la PCR avec un mélange de Taq et 1/10ème de concentration de votre enzyme de relecture et vous devriez toujours obtenir la même amplification avec un taux d'erreur inférieur.

7. Modifiez la température de recuit. Si la température de recuit est trop élevée, vous n'obtiendrez évidemment aucun amorçage à la séquence souhaitée. D'un autre côté, une température de recuit trop basse peut entraîner un tel amorçage non spécifique qui ne permet pas l'apparition de bandes spécifiques. La meilleure façon de trouver la température optimale est d'utiliser un cycleur à gradient et de tester une plage allant de la Tm d'amorce la plus basse à 10 °C en dessous par incréments de 1 °C.

8. Essayez des réactions avec différentes concentrations de matrice. La concentration de votre modèle peut être trop faible ou la concentration d'impuretés dans votre préparation peut être trop élevée. Essayez 5 à 10 réactions parallèles avec des concentrations de 10 à 200 ng dans une réaction de 50 microlitres.

9. Vérifiez le cycleur – les températures et les durées sont-elles conformes à vos attentes ?

10. Essayez la réaction dans un autre cycleur – l'étalonnage de celui que vous utilisez est peut-être éteint.

11. Essayez un additif. Je trouve que le DMSO est particulièrement utile dans les amplifications problématiques.

12. Redessiner les amorces – essayez de vous en tenir aux directives aussi étroitement que possible.


Dépannage de votre PCR

Que faire lorsque votre PCR tourne mal ? Les FAQ ci-dessous peuvent vous mettre sur la voie d'une PCR réussie.

Pour obtenir des conseils sur la façon de sauver vos expériences de la contamination par PCR, consultez cet article de blog.

Si aucun produit d'amplification n'est obtenu, quels paramètres doivent être considérés en premier lieu lors du dépannage ?

Considérer ce qui suit:

  • Tout d'abord, assurez-vous que tous les composants PCR ont été inclus dans les réactions. Un contrôle positif doit toujours être inclus pour s'assurer que chaque composant est présent et fonctionnel.
  • S'il n'y a eu aucun problème avec la configuration expérimentale, augmentez le nombre de cycles de PCR (3&ndash5 cycles à la fois), jusqu'à 40 cycles. L'augmentation du nombre de cycles peut résoudre les problèmes liés à un modèle en faible abondance ou à l'inaccessibilité du modèle en raison d'impuretés ou d'une faible efficacité d'amorçage des amorces.
  • Si l'augmentation du nombre de cycles n'améliore pas les résultats, les conditions de PCR peuvent être trop strictes pour l'ensemble d'amorces ou le modèle particulier. Envisagez de modifier les conditions PCR comme suit :
    • Abaissez la température de recuit par incréments de 2 degrés.
    • Augmentez le temps de prolongation.
    • Augmentez le montant du modèle. Reportez-vous aux directives fournies avec l'enzyme pour déterminer la quantité optimale de matrice.

    Considérez ces raisons supplémentaires possibles pour l'échec de la PCR :

    • Inhibiteurs de PCR dans l'échantillon de modèle
      Si des inhibiteurs de PCR sont présents, l'utilisation d'une matrice diluée peut augmenter l'efficacité de la PCR. Alternativement, le modèle peut avoir besoin d'être purifié à l'aide d'un kit tel que le kit NucleoSpin Gel et PCR Clean-up. Si la purification de la matrice n'est pas possible, une enzyme qui a une tolérance plus élevée aux impuretés, telle que la polymérase Terra PCR Direct, peut améliorer les résultats.
    • Le modèle a >65% de contenu GC
      Lors de l'amplification à partir de modèles à haute teneur en GC, utilisez une enzyme formulée pour cette condition. Consultez notre guide de sélection PCR pour trouver une enzyme appropriée.
    • Les amorces ne sont pas optimales
      Vérifiez soigneusement vos amorces, redessinez-les si nécessaire. Envisagez également de réamplifier le produit PCR primaire en utilisant des dilutions de 10 fois (1:100 à 1:10 000) à l'aide d'amorces imbriquées.

    Lors de l'utilisation de l'ADN polymérase PrimeSTAR HS, tenez compte de :

    • En utilisant une quantité appropriée de modèle. Si la matrice est de l'ADN génomique humain ou une banque d'ADNc, n'utilisez pas plus de

    Lorsque vous utilisez PrimeSTAR Max DNA Polymerase, tenez compte de :

    • Ajustement du temps d'extension si le mélange réactionnel contient un excès de matrice. Si la quantité de modèle dépasse 200 ng dans un mélange réactionnel de 50 et microlitres, réglez le temps d'extension entre 30 sec/kb et 1 min/kb.
    • Augmenter la concentration des amorces.

    Lorsque vous utilisez l'ADN polymérase SpeedSTAR HS, tenez compte des éléments suivants :

    • Augmenter le temps de prolongation. Bien que le temps d'extension standard soit de 10 sec/kb, le temps d'extension peut être augmenté jusqu'à

    S'il existe des bandes d'amplification non spécifiques, que peut-on faire pour améliorer la spécificité ?

    Toutes les polymérases Takara Bio PCR

    Problème:

    Solution:

    Utilisez l'alignement BLAST pour déterminer si les extrémités 3' des amorces sont complémentaires de sites autres que le ou les sites cibles. Reconcevoir les amorces si nécessaire ou modifier les conditions de PCR.

    Problème:

    Les conditions de PCR ne sont pas suffisamment strictes.

    Solutions:

    • Augmentez la température de recuit par incréments de 2 degrés.
    • Utilisez la PCR de toucher des roues.
    • Utilisez un protocole PCR en deux étapes.
    • Réduisez le nombre de cycles PCR.

    Problème:

    Trop de modèle a été utilisé.

    Solution:

    Réduisez la quantité de 2&ndash5 fois.

    ADN polymérases PrimeSTAR HS et PrimeSTAR Max

    Problème:

    Le temps de recuit est trop long.

    Solution:

    Pour obtenir une amplification spécifique, il est essentiel d'utiliser un temps de recuit court (5 & ndash15 sec) lors de l'exécution de la PCR en trois étapes.

    ADN polymérases PrimeSTAR GXL

    Problème:

    Les amorces ont un T sous-optimalm valeurs.

    Solution:

    Pour amplifier les cibles <1 kb, concevez des amorces avec Tm valeurs >55°C, et utilisez une température de recuit de 60°C. Si l'amorce Tm les valeurs sont <55°C, essayez un temps d'extension plus court entre 5 et 10 sec/kb.

    Takara Ex Taq et Takara LA Taq ADN polymérases

    Problème:

    Recuit d'amorce non spécifique à basse température.

    Solution:

    Les versions à démarrage à chaud de ces enzymes peuvent améliorer les résultats de certaines amorces.

    ADN polymérase SpeedSTAR HS

    Problème:

    Frottis des bandes de produit PCR sur un gel.

    Solution:

    Des temps d'extension excessivement longs peuvent entraîner des bavures. La recommandation générale pour le temps d'extension pour cette enzyme est de 10&ndash20 sec/kb. Si le rendement de la PCR est faible, essayez d'augmenter le nombre de cycles de 5.

    Si la PCR génère un frottis après avoir passé les produits sur un gel, que peut-on faire pour améliorer les résultats ?

    Tout d'abord, déterminez la source du frottis à l'aide de contrôles positifs et négatifs (pas de modèle). Cela peut déterminer si la cause du frottis est une contamination ou un surcyclage, ou si le frottis résulte d'amorces mal conçues ou de conditions PCR sous-optimales.

    Si le contrôle négatif est vierge, il n'y a pas de contamination. Au lieu de cela, les conditions PCR devront être optimisées, tenez compte des éléments suivants lors de l'ajustement des conditions PCR :

    • Réduisez la quantité de modèle.
    • Augmenter la température de recuit.
    • Utilisez la PCR de toucher des roues.
    • Réduisez le nombre de cycles PCR.
    • Redessiner les amorces.
    • Utilisez des amorces imbriquées.
    • Réamplifiez le produit. (Un petit bouchon du gel peut être retiré avec une pointe de micropipette, et l'ADN peut être récupéré en ajoutant le bouchon à 200 µl d'eau, puis en incubant à 37°C. 5 µl de cette solution peuvent être utilisés comme modèle PCR pour re- amplification.)

    Si le contrôle négatif est également étalé, il y a contamination. Vous devrez déterminer la source de cette contamination. Il peut être nécessaire de remplacer les réactifs PCR et de décontaminer les pipettes et votre poste de travail (voir les questions ci-dessous pour plus d'informations sur la contamination).

    Quelles sont les sources de contamination par PCR ?

    Il existe quatre sources principales de contamination par PCR :

    1. La source de contamination la plus courante est le produit de PCR provenant d'amplifications précédentes (appelée « contamination par transfert »). Lorsque de grandes quantités de produit PCR (10 à 12 molécules) sont générées à plusieurs reprises sur une période de temps, le potentiel de contamination augmente.
    2. Une autre source de contamination est l'ADN cloné préalablement manipulé en laboratoire.
    3. Une contamination d'échantillon à échantillon peut également se produire. Cette source de contamination est plus susceptible de se trouver dans les échantillons qui nécessitent un traitement approfondi avant l'amplification.
    4. Les réactions peuvent également être contaminées par de l'ADN exogène dans l'environnement, y compris l'ADN présent sur l'équipement de laboratoire et dans les réactifs utilisés pour l'extraction d'ADN et la PCR.

    Comment éviter la contamination ?

    La sensibilité de la PCR exige que les échantillons ne soient pas contaminés par de l'ADN exogène ou des produits préalablement amplifiés provenant de l'environnement du laboratoire. Nous recommandons que des zones distinctes soient utilisées pour la préparation des échantillons, la configuration PCR et l'analyse post-PCR.

    Une hotte à flux laminaire équipée d'une lampe UV est recommandée pour la préparation des mélanges réactionnels. Deux stations devraient être établies qui sont physiquement séparées l'une de l'autre.

    • Établissez une "zone pré-PCR" réservée à la configuration de la réaction PCR. Aucun élément de la « zone post-PCR » ne doit être introduit dans cette zone, ce qui inclut des éléments tels que des cahiers et des stylos.
    • Établissez une "zone post-PCR" qui est utilisée pour la PCR, la purification de l'ADN amplifié par PCR, la mesure de la concentration d'ADN, l'exécution de gels d'agarose et l'analyse des produits PCR.

    L'équipement doit également être limité à ces zones. La machine PCR et l'appareil d'électrophorèse doivent être situés dans la zone post-PCR. Il est fortement recommandé d'avoir des pipettes et des pointes de pipette avec des filtres aérosols dédiées à la préparation d'échantillons d'ADN et de mélanges réactionnels uniquement. Les recommandations supplémentaires incluent :

    • Disposer d'ensembles séparés de pipettes et d'embouts de pipettes, de blouses de laboratoire, de boîtes à gants et de corbeilles à déchets pour les zones pré-PCR et post-PCR.
    • Étiquetage des articles pré- et post-PCR, afin qu'ils ne soient pas retirés de leur zone de travail désignée.
    • Suivre la règle d'or de la PCR : NE JAMAIS ramener de réactifs, d'équipements ou de pipettes utilisés dans une zone post-PCR dans la zone pré-PCR.
    • Préparer et stocker séparément les réactifs pour la PCR et les utiliser uniquement aux fins prévues. Les réactifs doivent être aliquotés en petites portions et stockés dans des zones désignées selon qu'ils sont utilisés pour des applications pré-PCR ou post-PCR. Les aliquotes doivent être conservées séparément des autres échantillons d'ADN.

    Une réaction de contrôle qui omet l'ADN matrice doit toujours être effectuée pour confirmer l'absence de contamination. De plus, le nombre de cycles de PCR doit être réduit au minimum, car les tests très sensibles sont plus sujets aux effets de la contamination.

    Comment puis-je décontaminer si j'ai une contamination PCR ?

    1. Laissez les pipettes sous la lumière UV dans la hotte de culture cellulaire pendant la nuit. L'irradiation UV favorise la réticulation des résidus de thymidine, endommageant l'ADN résiduel.
    2. Vaporisez les postes de travail/équipements/pipettes avec de l'eau de Javel à 10 %, puis essuyez.
    3. Changer de poste de travail déplacez la zone pré-PCR vers un autre emplacement pré-nettoyé.
    4. N'utilisez pas d'instruments ou de pipettes que vous avez déjà utilisés.

    Que puis-je faire si la PCR génère des erreurs ?

    Pour éviter les erreurs lors de la PCR, nous vous recommandons d'utiliser une enzyme haute fidélité (voir guide de sélection). De plus, veillez à éviter les éléments suivants :

    1. Surcyclage
      Surcyclage des réactions PCR souvent :
      • Modifie le pH de la réaction d'une manière qui déstabilise l'ADN.
      • Augmente la quantité de produit PCR, réduisant ainsi l'efficacité de la polymérase et favorisant les erreurs.
      • Diminue la quantité de dNTP, augmentant ainsi la probabilité d'une mauvaise incorporation de la base en raison de la concentration de dNTP déséquilibrée. (Si vous utilisez les enzymes PCR de Takara Bio, la concentration de dNTP est optimisée à 200 nM, l'augmentation de la concentration de dNTP entraîne une mauvaise incorporation.)
      • Provoque l'accumulation d'ADN simple brin et double brin.
    2. Concentration élevée en Mg 2+
      La concentration de Mg 2+ varie de 1 à 5 mM. L'utilisation d'une concentration élevée en Mg 2+ peut augmenter le rendement, mais peut également avoir un impact sur l'activité de relecture des enzymes. Cependant, la concentration en Mg 2+ doit toujours être supérieure à la concentration en dNTP.
    3. Dommages à l'ADN modèle
      Limitez le temps d'exposition aux UV lors de l'analyse ou de l'excision des produits PCR des gels.

    Que sont les inhibiteurs de PCR ?

    Les impuretés qui interfèrent avec l'amplification par PCR sont appelées inhibiteurs de PCR. Les inhibiteurs de la PCR sont présents dans une grande variété de types d'échantillons et peuvent entraîner une diminution de la sensibilité de la PCR ou même des résultats PCR faussement négatifs. Les inhibiteurs de PCR peuvent avoir des origines inorganiques et organiques (Schrader 2012).

    Les inhibiteurs de PCR inorganiques comprennent :

    • Calcium ou autres ions métalliques qui concurrencent le magnésium
    • EDTA qui se lie au magnésium, réduisant sa concentration

    Certains inhibiteurs de PCR organiques comprennent :

    • Polysaccharides et glycolipides qui imitent la structure des acides nucléiques, interférant avec les amorces se liant à la matrice
    • Mélanine et collagène qui forment un complexe réversible avec l'ADN polymérase
    • Acides humiques qui interagissent avec l'ADN matrice et la polymérase, empêchant la réaction enzymatique, même à de faibles concentrations
    • Urée pouvant conduire à la dégradation de la polymérase

    D'autres composés organiques qui peuvent inhiber la PCR comprennent :

    • Hémoglobine, lactoferrine et IgG dans les échantillons de sang, de sérum ou de plasma
    • Anticoagulants tels que l'héparine
    • Polyphénols, pectine et xylane de plantes
    • Éthanol, alcool isopropylique, phénol ou détergents tels que SDS

    Si des inhibiteurs sont présents dans la préparation de matrice, une dilution de 100 fois de la matrice de départ peut suffisamment diluer l'inhibiteur et permettre l'amplification. Alternativement, la précipitation à l'éthanol de la matrice peut être nécessaire pour résoudre le problème.

    Les références

    Schrader, C., et al. Inhibiteurs de PCR et occurrence, propriétés et élimination. J Appl Microbiol. 113:1014&ndash1026 (2012).

    Qu'est-ce que le surcyclage PCR ? Comment savoir si mon produit est surcyclé ?

    Le surcyclage PCR se produit lorsque le cycle dépasse la phase exponentielle d'amplification. Le surcyclage se produit lorsque les événements suivants se produisent pendant la PCR :

    • Épuisement des substrats (dNTP ou amorces).
    • Les réactifs (dNTP ou enzymes) ne sont plus stables à la température de dénaturation.
    • La PCR polymérase est inhibée par le produit (pyrophosphate, ADN duplex).
    • Compétition pour les réactifs (dNTP et amorces) par des produits non spécifiques.
    • Abaissement du pH de la réaction.
    • Dénaturation incomplète/séparation des brins des produits à des concentrations élevées de produits.

    L'indicateur de surcyclage PCR est un frottis de fond intense avec des bandes indiscernables lorsque la réaction est résolue sur un gel d'agarose. Il est toujours recommandé d'effectuer un test préliminaire pour déterminer le nombre minimal de cycles PCR nécessaires pour obtenir un produit suffisant. Le produit PCR reste dans la phase linéaire d'amplification si le rendement en produit est sensiblement augmenté tous les 3&ndash5 cycles. On trouve que surcyclé L'ADNc ne produit pas de modèle approprié pour une application en aval.

    Quels types de mutations peuvent être causés par la PCR ?

    Les polymérases PCR peuvent introduire différents types de mutations, y compris des substitutions, des délétions et des insertions à base unique. Les substitutions de bases sont généralement causées par une mauvaise incorporation d'un dNTP incorrect lors de la synthèse d'ADN.

    Les polymérases peuvent générer des mutations à des emplacements où un ou plusieurs nucléotides sont perdus ou gagnés. La fréquence de ce type de mutation peut dépendre de la séquence et peut être plus élevée dans les séquences hautement répétitives. La mutation la plus courante est la perte d'un seul nucléotide, qui pourrait être le résultat d'un désalignement matrice-amorce au sein d'une séquence homopolymère répétitive. Des réarrangements d'ADN peuvent également se produire lorsque la polymérase termine la synthèse sur un brin d'ADN et continue la synthèse après que l'amorçage se soit produit sur un brin complémentaire (c'est-à-dire, une PCR à commutation de brin ou à saut). Ce type de mutation a lieu lorsqu'il existe une forte homologie entre différentes régions de l'ADN. Une matrice d'ADN excessive dans la réaction peut également favoriser ce type de mutation.

    Quels facteurs contribuent aux mutations introduites par PCR ?

    Les facteurs suivants peuvent contribuer aux mutations introduites par PCR :

    • Concentrations de dNTP déséquilibrées
      Des quantités inégales des quatre dNTP peuvent augmenter la substitution de base jusqu'à huit fois. L'utilisation de concentrations égales des quatre dNTP est essentielle pour réduire le taux d'erreur de la polymérase.
    • Concentration élevée en enzymes
    • Longs temps d'incubation
    • Absence d'activité exonucléase 3'&rarr5'
    • Concentration de magnésium
      La fidélité est maximale lorsque la concentration de Mg 2+ est équimolaire à la concentration totale des dNTP. La fidélité diminue lorsque la concentration de cations divalents libres augmente.
    • pH de la réaction
      L'abaissement du pH de la réaction de trois unités peut augmenter les substitutions de bases jusqu'à 60 fois. Un pH bas (<6.0) peut entraîner une perte spontanée de purine.
    • Dommages à l'ADN
      Des dommages à l'ADN peuvent se produire à des températures élevées, augmentant éventuellement le taux de mutation. Une mutation fréquente est la désamination de la cytosine pour produire de l'uracile.
    • La présence d'étirements A dans les séquences d'amorces
    • Surcyclage
      Le taux d'erreur est augmenté lorsque la concentration d'ADN est augmentée pendant les cycles de PCR finaux. Le nombre total de cycles doit être réduit au minimum pour produire le produit PCR souhaité sans erreurs.

    Que sont les artefacts PCR ?

    Les artefacts PCR courants sont les suivants :

    • Dimères d'amorces
      Les dimères d'amorces sont formés par auto-complémentarité à l'extrémité 3' des amorces d'amplification. Les dimères d'amorces sont suspectés si le produit est produit dans une réaction sans matrice (témoin négatif). Pour éviter les dimères d'amorces, les amorces ne devraient pas avoir de complémentarité à leurs extrémités 3'.
    • Produits PCR chimériques
      Les produits de PCR chimériques peuvent être causés par un modèle incomplètement étendu. En d'autres termes, une matrice simple brin qui n'a pas été complètement répliquée en raison d'une terminaison prématurée de la polymérase peut s'hybrider à une matrice partiellement homologue. Cela crée des produits PCR chimériques. Pour minimiser les chimères, utilisez le moins de cycles d'amplification PCR possible.
    • Biais PCR
      Le biais de PCR se produit lorsque certaines séquences sont amplifiées plus efficacement que d'autres en raison de la liaison préférentielle par les amorces de PCR. Si une séquence est amplifiée 10 % de plus qu'une autre dans un cycle, elle sera 17,4 fois plus abondante après 30 cycles. Pour réduire le biais de PCR, utilisez un taux de rampe élevé entre les étapes de dénaturation et de recuit et utilisez des températures de recuit basses. Les longues périodes d'extension (>180 sec) doivent être évitées.
    • dérive de la PCR
      La dérive de la PCR est due à la fluctuation stochastique des interactions des réactifs PCR, en particulier dans les premiers cycles lorsqu'une très faible concentration de matrice existe. Cet artefact est observé dans les dosages multiplex, où une perte de sensibilité est causée par les interactions entre différents ensembles d'amorces. Il est important de concevoir soigneusement des amorces pour ces types d'essais.
    • La PCR génère des produits de poids moléculaire élevé qui migrent à peine à travers le gel d'agarose
      Il n'y a pas de bonne explication pour cet artefact. La plupart des chercheurs supposent que cela est dû au surcyclage, car dans les derniers stades de la PCR, les molécules simple et double brin s'accumulent. L'accumulation de telles molécules simple brin peut créer des hétéroduplex en compétition avec les amorces. Une dénaturation incomplète dans les étapes ultérieures, lorsqu'il y a une forte concentration de produits PCR, empêche la séparation des brins d'ADN, et ainsi un amplicon nouvellement formé peut rester lié à la matrice précédemment faite. Ce processus pourrait se répéter, piégeant les produits PCR dans un réseau de molécules.

    Une autre explication de l'origine des frottis de poids moléculaire élevé est l'extension partielle des matrices au cours des cycles de PCR initiaux. Des extensions partielles pourraient être générées en sautant des artefacts lorsqu'une amorce ou un ADN simple brin s'hybride et s'étend à partir d'un site d'amorçage, puis s'hybride partiellement à un segment homologue ailleurs (voir Produits de PCR chimérique, ci-dessus). Les molécules partiellement étendues peuvent agir comme de nouvelles amorces, car elles contiennent un 3'-OH libre, et pourraient générer des molécules chimériques qui combinent le site d'amorçage initial et le site de "saut".

    Enfin, ce type d'artefact peut également être généré lorsqu'un modèle brut est utilisé pour la PCR. Les produits amplifiés directement à partir de tissus animaux ou végétaux peuvent se retrouver piégés dans les débris cellulaires, ce qui les empêche de migrer dans le gel. Ce problème peut être résolu par digestion à la protéinase K du produit de PCR amplifié :

    • Avant de charger vos échantillons sur un gel, ajoutez 1 µl du tampon de chargement contenant de la protéinase K à 4 µl de la réaction PCR.

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    Clonage moléculaire de produits PCR : Guide de digestion par restriction

    Le clonage est une technique multi-étapes omniprésente dans les laboratoires de biologie moléculaire et consiste à insérer un gène cible (insert) dans une épine dorsale de vecteur plasmidique circulaire, double brin et auto-répliquant qui porte un gène de résistance aux antibiotiques (le plus souvent l'ampicilline ou la kanamycine) . Ceci est rendu possible par la digestion par restriction, un processus qui garantit que le gène cible et le vecteur récepteur ont des extrémités compatibles. Après la ligature du gène dans le vecteur, la molécule d'ADN recombinant résultante est introduite dans Escherichia coli cellules (transformation) et une pression antibiotique est appliquée pour sélectionner les bactéries qui portent le plasmide. Ces bactéries transformées peuvent ensuite être utilisées pour répliquer l'ADN plasmidique recombinant (préparation plasmidique). Dans d'autres cas, la machinerie cellulaire bactérienne peut être dirigée pour exprimer le gène cible et synthétiser sa protéine correspondante (expression de la protéine).

    Le clonage est une technique multi-étapes omniprésente dans les laboratoires de biologie moléculaire et consiste à insérer un gène cible (insert) dans une épine dorsale de vecteur plasmidique circulaire, double brin et auto-répliquant qui porte un gène de résistance aux antibiotiques (le plus souvent l'ampicilline ou la kanamycine) . Ceci est rendu possible par la digestion par restriction, un processus qui garantit que le gène cible et le vecteur récepteur ont des extrémités compatibles. Après la ligature du gène dans le vecteur, la molécule d'ADN recombinant résultante est introduite dans Escherichia coli cellules (transformation) et une pression antibiotique est appliquée pour sélectionner les bactéries qui portent le plasmide. Ces bactéries transformées peuvent ensuite être utilisées pour répliquer l'ADN plasmidique recombinant (préparation plasmidique). Dans d'autres cas, la machinerie cellulaire bactérienne peut être dirigée pour exprimer le gène cible et synthétiser sa protéine correspondante (expression de la protéine).

    Dans la série d'articles suivante, j'explorerai chaque étape (en commençant par la digestion par restriction) et je discuterai de conseils pour assurer le succès et un dépannage minimal.

    Digestion de restriction

    1. Endonucléases de restriction : Les RE sont des enzymes bactériennes qui reconnaissent de courtes séquences d'ADN (6 à 8 paires de bases) appelées sites de restriction, et clivent (digèrent) l'ADN double brin sur ces sites. La plupart des RE sont palindromes : tout comme les palindromes linguistiques (Madame, je suis Adam), ces enzymes lisent les mêmes séquences sur les deux brins d'ADN dans le sens 5' à 3'. Certaines enzymes créent des surplombs simple brin, également appelés extrémités collantes ou cohésives. D'autres enzymes coupent directement au milieu d'une séquence cible et ne laissent aucun surplomb, mais des extrémités émoussées ou affleurantes. À des fins de clonage, les ER qui créent des extrémités collantes sont plus souvent utilisées car elles entraînent une efficacité de clonage beaucoup plus élevée.

    2. Méthodologie : Pour préparer l'insert (par exemple. un produit de PCR) pour le clonage, il est le plus souvent coupé avec deux ER différents, et ces mêmes ER sont utilisés pour digérer le vecteur. Cela garantit la production d'extrémités non compatibles au sein d'une même molécule, force le clonage de l'insert dans un sens (clonage directionnel) et empêche l'auto-ligature du vecteur. D'autre part, comme l'insert et le vecteur sont digérés avec les mêmes enzymes, des queues compatibles insert-vecteur sont créées. Ces extrémités peuvent former une paire de bases et peuvent ensuite être jointes par l'ADN ligase, formant ainsi une molécule chimérique. Si l'insert est digéré avec une seule enzyme, les mêmes extrémités seront créées aux deux extrémités et la cible peut être insérée dans les deux sens. Tous les clones obtenus devront être criblés pour déterminer que l'orientation des gènes est correcte. Un vecteur digéré avec une seule enzyme devra être déphosphorylé pour empêcher l'auto-ligature. Un vecteur qui se ligature sur lui-même sera transformé plus efficacement en E. coli et diminuera ainsi l'efficacité de la réaction de clonage.

    3. Conseils pour un condensé de restriction réussi :

    une. Si votre insert est un produit PCR, vous ajouterez probablement les sites de restriction à l'extrémité 5' des deux amorces PCR. Pour assurer une liaison et une digestion efficaces, assurez-vous d'inclure six bases entre le site de reconnaissance et l'extrémité 5 'de l'amorce. N'oubliez pas de confirmer que les sites de restriction que vous sélectionnez n'apparaissent pas dans votre encart !

    b. Assurez-vous que l'ADN est exempt de contaminants, tels que le phénol, le chloroforme, l'éthanol et le sel. Si vous utilisez un produit PCR, vous pouvez utiliser un kit de nettoyage PCR. Si votre réaction PCR génère une bande non spécifique, vous devrez couper la bande cible du gel et purifier le produit à l'aide d'un kit d'extraction de gel d'ADN.

    c. La quantité d'enzyme utilisée ne doit pas dépasser 10 % du volume de réaction, car le glycérol transporté du tampon de stockage d'enzyme peut inhiber la réaction.

    ré. Ajoutez les composants de la réaction dans cet ordre : tampon d'enzyme de restriction, eau (l'enzyme peut se dénaturer si elle est ajoutée directement après le tampon concentré), ADN, enzyme.

    e. Gardez l'enzyme sur de la glace ou dans un bloc réfrigérant pendant que vous préparez la réaction.

    F. Mélanger les composants de la réaction en pipetant doucement le mélange réactionnel de haut en bas. Évitez de générer des bulles d'air car l'enzyme peut être piégée à l'interface liquide-air et se dénaturer. Suivez avec un spin-down rapide dans une microcentrifugeuse. Ne pas vortexer la réaction.

    g. Vérifiez le succès de votre réaction de digestion en exécutant côte à côte des produits digérés et non digérés sur un gel d'agarose. NEBcutter est un outil utile de New England BioLabs qui peut vous aider à prédire le résultat d'une réaction de digestion.

    h. Enfin, et avant de procéder à la ligature, l'ER présent dans la réaction doit être inactivé. Sinon, toute RE active restante digérera tous les produits ligaturés. De nombreuses ER peuvent être inactivées par la chaleur. Pour ceux qui ne le peuvent pas, une étape de purification sur gel est recommandée.

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    Introduction

    Les normes scientifiques de nouvelle génération favorisent la compréhension des idées fondamentales ainsi que le développement de pratiques scientifiques, et mettent particulièrement l'accent sur l'utilisation de preuves pour générer des explications aux problèmes scientifiques (NGSS Lead States, 2013). Les activités basées sur l'enquête sont un excellent moyen d'aider les élèves à comprendre et à apprécier les concepts et techniques scientifiques utilisés en biologie moderne, surtout s'ils peuvent être liés à la vie des élèves en dehors de la salle de classe. De plus, de telles activités permettent aux étudiants de s'engager directement dans la méthode scientifique en générant des questions, des preuves et des conclusions dans un laboratoire pratique. Afin d'introduire des outils fondamentaux de biologie moléculaire tels que l'isolement de l'ADN, l'électrophorèse sur gel d'agarose, la réaction en chaîne par polymérase (PCR), le séquençage de l'ADN et l'analyse de la base de données ADN, nous avons conçu un exercice de laboratoire pour détecter les poissons mal étiquetés (c. ) des restaurants et supermarchés locaux. Des études antérieures ont utilisé des données recueillies dans des cours de lycée ou de premier cycle pour enquêter sur les erreurs d'étiquetage des fruits de mer (Naaum & Hanner, 2015 Willette et al., 2017), et ont décrit des exercices de laboratoire dans lesquels les étudiants analysent des séquences d'ADN de poisson (Hallen-Adams, 2015 Cline & Gogarten, 2012). Notre article s'appuie sur ce travail en décrivant un projet de plusieurs jours dans lequel les étudiants effectuent des recherches basées sur l'enquête du début à la fin, et en incorporant le séquençage et l'analyse phylogénétique d'espèces de poissons de plusieurs familles et ordres. Nous avons également inclus un certain nombre d'exercices conçus pour élargir la compréhension des étudiants de la conception des amorces et de la structure et de l'analyse des séquences d'ADN, et pour stimuler une discussion interdisciplinaire sur la durabilité écologique et l'économie impliquée dans l'étiquetage erroné des produits de la mer.

    Les consommateurs américains ont dépensé environ 91,7 milliards de dollars en produits de la pêche en 2013 et ont consommé en moyenne 14,6 livres de poisson et de crustacés par habitant et par an entre 2000 et 2009 (NMFS, 2014). Malheureusement, des enquêtes récentes ont découvert la substitution d'espèces et l'étiquetage erroné des produits de la mer. Une étude nationale menée par Oceana de 2010 à 2012 a révélé que 33 pour cent des 1 215 échantillons de fruits de mer étaient mal étiquetés (Warner et al., 2013). Et de récents tests ADN de 174 lots de produits à base de poisson par la Food and Drug Administration ont révélé que 15 pour cent étaient mal étiquetés (FDA, 2013). Le tableau 1 comprend une liste de poissons couramment substitués.

    Espèces labellisées. Espèce réelle.
    Morue de l'Alaska/du Pacifique Pangasius (poisson-chat asiatique), morue de l'Atlantique, nageoires filetées, slickhead, goberge d'Alaska
    Saumon (sauvage, roi, sockeye) Saumon atlantique d'élevage
    Loup de mer Légine antarctique, Légine australe
    vivaneau Divers vivaneaux, perche du Pacifique, sébaste, tilapia, bar blanc, dorade royale
    Sole de citron Flet, semelle à tête plate
    Thon blanc Escolar
    Doré Sauger
    Espèces labellisées. Espèce réelle.
    Morue de l'Alaska/du Pacifique Pangasius (poisson-chat asiatique), morue de l'Atlantique, filé, slickhead, goberge d'Alaska
    Saumon (sauvage, roi, sockeye) Saumon atlantique d'élevage
    Loup de mer Légine de l'Antarctique, Légine de Patagonie
    vivaneau Divers vivaneaux, perche du Pacifique, sébaste, tilapia, bar blanc, dorade royale
    Sole de citron Flet, semelle à tête plate
    Thon blanc Escolar
    Doré Sauger

    De nombreuses espèces de poissons peuvent se ressembler et avoir un goût similaire, c'est pourquoi des tests ADN sont souvent nécessaires pour déterminer la véritable identité de l'échantillon. La technique d'identification par code-barres ADN est basée sur la comparaison d'une séquence d'ADN d'une région définie du génome à la base de données des séquences du génome d'espèces connues de poissons. Pour ce projet, nous avons analysé la région d'environ 700 paires de bases (pb) du gène de la sous-unité I de la cytochrome c oxydase mitochondriale (COI). Cette région du génome a été largement utilisée dans le codage à barres de l'ADN des animaux (Hebert et al., 2003). Des amorces PCR universelles ont été développées pour amplifier une section du gène COI dans le génome du poisson (Ward et al., 2005), et nous avons trouvé que ces amorces publiées fonctionnaient très bien dans l'amplification PCR de tous nos échantillons.

    Cet exercice d'investigation en laboratoire a été utilisé avec succès dans le cadre d'un cours d'été de deux semaines pour les élèves du secondaire et d'un cours de génétique de premier cycle de deuxième année au Carleton College. Ce projet a été conçu pour couvrir quatre périodes de laboratoire de 3 heures (tableau 2), mais peut être ajusté pour s'adapter à d'autres périodes. Les exercices peuvent être adaptés à des publics d'étudiants variés : d'une initiation à la biologie moléculaire pour les lycéens, à un projet de recherche avancée pour un cours de premier cycle en laboratoire. Dans la section Résumé et extensions, nous décrivons des activités pour les étudiants ayant besoin de pratique supplémentaire, ainsi que des opportunités d'apprentissage plus indépendantes pour les étudiants avancés. Nos étudiants ont travaillé en groupes de 2 à 4, contribuant ainsi à favoriser la collaboration scientifique et les compétences en communication. L'objectif de cet atelier est que les étudiants atteignent les objectifs suivants :

    . Avant le labo. Laboratoire 1 . Laboratoire 2 . Laboratoire 3 . Laboratoire 4 .
    Activités de laboratoireObtenir des échantillons de poisson Isolement de l'ADN du poisson (
    . Avant le labo. Laboratoire 1 . Laboratoire 2 . Laboratoire 3 . Laboratoire 4 .
    Activités de laboratoireObtenir des échantillons de poisson Isolement de l'ADN du poisson (

    Apprécier l'utilité des tests basés sur l'ADN.

    Comprendre et exécuter diverses techniques de biologie moléculaire : extraction d'ADN, électrophorèse sur gel d'agarose et réaction en chaîne par polymérase.

    Tenir à jour un cahier de recherche complet et indépendant.

    Naviguez dans les outils bioinformatiques (par exemple, BLAST, alignement de séquences) pour analyser les données de séquence d'ADN.

    Synthétiser les résultats et présenter les conclusions.

    Apprécier les liens entre la science d'investigation et leur vie quotidienne.


    Comment interprétez-vous les résultats des réactions PCR d'électrophorèse ?

    Je suis dans une classe de biologie 101 pour mes exigences de formation générale (je suis une majeure non scientifique), et j'ai du mal à comprendre exactement ce que je regarde en ce qui concerne les résultats de la PCR.

    Une image des résultats est incluse : http://imgur.com/BSo0u1T

    La bande 1 est l'échelle, la bande 2 est l'expérimental, la bande 3 est le contrôle négatif et la bande 4 est le contrôle positif.

    L'expérience était une tentative d'amplification d'un oncogène spécifique dans le génome des cellules tumorales. La bande 2 est l'échantillon d'ADN des cellules tumorales.

    Quel est l'intérêt de l'échelle ? Qu'est-ce que je regarde exactement en ce qui concerne les résultats ici ?

    Je suis vraiment confus et mon professeur n'est d'aucune aide. J'apprécie toute aide que vous pourriez m'apporter !

    puisque vous n'êtes pas en sciences, j'essaierai d'être bref et concis :

    Je suppose que vous savez ce qu'est la PCR et ce qu'elle fait (d'autres personnes ici ont donné de bonnes descriptions, si vous en avez besoin)

    l'électrophorèse sépare l'ADN en fonction de la taille des fragments à l'aide d'une charge électrique (l'ADN est légèrement négatif, il se déplace donc vers la charge positive). Plus le fragment est petit, plus il se déplace loin (les fragments plus petits ont moins de ɽrag'). Étant donné que l'ADN commence dans les puits du haut, plus la bande est basse sur le gel, plus elle est petite.

    L'échelle sert juste à vérifier la taille des fragments dans votre échantillon. Vous devez connaître la taille de chacune des bandes de votre échelle, en fonction de l'échelle que vous avez utilisée, et la comparer à votre échantillon pour déterminer la taille des fragments d'échantillon.

    Le contrôle négatif est vide, et c'est bien. Ignorez-le simplement pour le moment.

    Votre contrôle positif montre la taille du fragment d'ADN qui vous intéresse. Maintenant, comparez-le à votre échantillon expérimental. voyez comment il y a une bande dans votre échantillon qui est de la même taille que le contrôle positif ? Cela signifie que votre échantillon expérimental contenait probablement l'oncogène spécifique que vous recherchiez (vous devrez le séquencer ou faire un autre test pour être complètement positif à 100%).

    L'autre bande plus petite mais plus brillante pourrait être beaucoup de choses. peut-être une version différente du gène ou une amplification génique non cible. Dans tous les cas, ignorez-le pour ce problème. La partie la plus importante est qu'il y a une bande dans votre échantillon qui est de la même taille que le contrôle positif, vous pouvez donc dire que l'échantillon expérimental contient très probablement l'oncogène spécifique.

    J'espère que cela t'aides! Sentez-vous libre de poser des questions

    La PCR amplifie une section spécifique d'ADN, lorsque vous exécutez ces fragments d'ADN sur un gel d'agarose, vous exploitez le fait que différentes longueurs d'ADN peuvent se déplacer à travers le gel à différentes vitesses (plus la longueur est longue, plus elle va lentement).

    L'échelle est un ensemble prédéterminé de paires de bases de différentes longueurs connues, ce qui est nécessaire car la distance parcourue par l'ADN dépend de nombreux fragments, vous avez donc besoin d'une référence pour la comparer. D'accord, vous pourrez peut-être identifier une séquence plus longue ou plus courte sans cela, mais les échelles vous permettent d'être plus précis sur la longueur. Ceci est particulièrement important si vous amplifiez quelque chose dont vous connaissez déjà la longueur, comme l'ADN d'une protéine ou d'un marqueur tumoral. Vous connaîtrez sa taille dans le génome afin que vous puissiez identifier votre fragment dans le gel sachant que vous l'attendez à 750 pb à l'échelle qui montre que vous avez une bande sur votre échantillon à environ cette longueur.

    Maintenant, pour votre expérience, la piste 1 est l'échelle, et vous devriez être en mesure d'identifier la signification de chaque bande en recherchant les informations du nom de l'échelle (par exemple, l'échelle d'ADN NEB 1kbp) et en les comparant à leur exemple de référence. C'est dans un souci de précision, mais si vous avez des contrôles connus, vous devriez généralement pouvoir les identifier sans cela (et je pense que c'est probablement suffisant pour vos besoins généraux). Pour vous orienter, le haut du gel est l'endroit où vous placez votre échantillon, ce qui signifie que plus la bande est basse sur l'image, plus la longueur de l'ADN est petite.

    En arrivant aux pistes expérimentales, vous pouvez voir que la piste 3 est vide pour votre contrôle négatif, c'est bien. La piste 4 est le contrôle positif, ce qui signifie que c'est là que vous devriez vous attendre à voir votre groupe, en cas de succès, dans votre expérience. Maintenant, pour la piste d'expérimentation, vous pouvez probablement voir une bande faible autour du niveau du contrôle positif, mais une bande plus forte plus bas. Cela indique que bien que vous ayez cloné un fragment d'une longueur similaire à votre contrôle positif, quelque chose ne s'est pas bien passé parce que vous avez plus d'ADN avec une longueur plus petite. De plus, il convient de noter que bien que la bande supérieure soit de longueur similaire, cela ne signifie pas nécessairement qu'il s'agit de votre marqueur amplifié, car techniquement, vous auriez pu amplifier quelque chose d'une longueur similaire à partir d'un autre endroit du génome.

    A titre de comparaison, voici un gel que j'ai couru. La piste 1 est l'échelle d'ADN, la piste 2 est l'expérience et la piste 3 est le contrôle négatif. Vous voyez les bandes fortes en haut de la troisième voie, elles indiquent l'ADN génomique non amplifié, car sa taille est si grande qu'elle n'a pas (ou ne pouvait pas) bouger beaucoup dans le gel, tandis que la deuxième voie qui est my experiment shows a single band of appropriate base pairs in length and no other bands (meaning it only amplified a region of that length and nothing else).

    As for what happened and why, well it generally the biggest cause is a poorly designed primer (these are a short collection of nucleotides that bind to the corresponding area of DNA and help to initiate the cloning, they basically identify Quel part of the DNA is going to get cloned), or procedural errors during the experiment. If you get multiple bands in a PCR experiment it's usually a sign that your primer annealed to more than one area of the genome. When designing primers there are a number of factors you need to take into account. Since these are of short length,

    20 base pairs, if you don't design them with specificity to your target area they may amplify other things as well. This is why we tend to use tools like Primer-BLAST which, after entering a primer sequence, helps to identify what sequences in the genome will be amplified, to double check that you only get what you want. This also helps to design your primers with specific criteria such as including an intron in the primer (which prevents you from amplifying mRNA, since this doesn't have introns only the genomic DNA should be amplified). Identifying the length of the smallest band in your DNA ladder can also give you clues as to the identity of that lower band in your experiment, and running primer-blast can help confirm this too (but I don't know how much of this is what you were given or actually did in class).

    Now you do need to bear in mind what you are trying to achieve, I only wanted to clone a specific genetic sequence, whereas if you are working with a tumour cell there may inherently be changes in the genome of the cell so seeing something slightly different doesn't always mean your experiment went wrong. It could be that the tumour cell simply has mutations in the genome resulting in a smaller gene. As you can see a lot about science and experimentation is not only trying to get the damn thing to work but trying to understand and explain when things go wrong.

    Hope this has helped, Iɽ be happy to answer any questions you have as well!


    Voir la vidéo: Comprendre et interpréter lélectrophorèse des protéines (Janvier 2022).