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Quel serait l'effet d'un excès de taq polymérase sur la PCR ?


J'avais juste une question concernant l'effet possible de mettre trop de Taq polymérase dans mon tube PCR ?

Au lieu de 5µl j'ai mis 50µl (10x plus).

Pensez-vous que cela aura un mauvais effet sur la réaction ??

Merci pour votre aide.


Erreur coûteuse. Et oui, cela affectera votre réaction, car la concentration d'ions magnésium, qui sont nécessaires comme cofacteur par l'enzyme, est trop faible. Si vous avez besoin de tant de produits PCR, vous pouvez maintenant ajuster le reste des réactifs ou vous pouvez recommencer et mettre cela sur votre liste personnelle d'erreurs. Vérifiez toujours le volume, s'il est étrangement élevé, vérifiez à nouveau.

Si vous décidez de continuer et de travailler avec un volume 10 fois plus important, assurez-vous que la réaction PCR unique ne dépasse pas 50 µl, car le volume plus important affecte également la vitesse à laquelle la réaction se réchauffe et se refroidit. Si votre réaction est trop lente pour atteindre 72°C par exemple, le temps d'élongation peut ne pas être assez long pour obtenir le produit complet. Si la dénaturation est trop courte, votre efficacité baissera.


Fonction de la Taq ADN polymérase en PCR

“La fonction de la Taq ADN polymérase en PCR est d'amplifier ou de synthétiser l'ADN ou le gène d'intérêt pour diverses applications en aval. C'est un type d'ADN polymérase thermostable, qui peut également fonctionner à des températures plus élevées.

Le présent article se concentre sur la fonction et l'importance de l'ADN polymérase Taq et sur la manière dont elle amplifie l'ADN. En plus de cela, les avantages et les inconvénients de celui-ci sont également inclus.

Commençons par les bases,


PCR imbriquée

Les amorces PCR imbriquées sont celles qui sont internes à la première paire d'amorces. Le plus grand fragment produit par le premier cycle de PCR est utilisé comme matrice pour la deuxième PCR. La PCR nichée peut également être effectuée avec l'une des premières paires d'amorces et une seule amorce nichée. La sensibilité et la spécificité de l'amplification de l'ADN et de l'ARN peuvent être considérablement augmentées en utilisant cette méthode. La spécificité est particulièrement renforcée car cette technique est presque toujours élimine tous les produits d'amplification non spécifiques parasites. En effet, après le premier cycle de PCR, il est peu probable que des produits non spécifiques soient suffisamment complémentaires des amorces nichées pour pouvoir servir de matrice pour une amplification supplémentaire, ainsi la séquence cible souhaitée est préférentiellement amplifiée. Cependant, le risque accru de contamination est un inconvénient de cette extrême sensibilité.


Rôle du MgCl 2 en réaction PCR :

Les ions Mg + se lient au site catalytique de l'enzyme et augmentent sa capacité à effectuer la réaction. D'où la capacité de Taq L'ADN polymérase de l'ajout de dNTP sur le brin d'ADN en croissance est augmentée.

Il est très important de mentionner la polymérase comme Taq ADN polymérase car l'ADN polymérase utilisée dans la réaction PCR n'est pas la même que celle utilisée lors de la réplication.

Taq L'ADN polymérase est isolée d'une bactérie appelée thermophilus acquaticus et il peut fonctionner même à une température plus élevée, ce qui n'est pas possible avec notre ADN polymérase normale.

De plus, MgCl 2 augmente la Tm de réaction. Le mg 2 + ions de MgCl 2 lier au bon de commande 3 – du squelette de l'ADN temporairement et protège le phosphate chargé négativement du squelette de l'ADN en diminuant la répulsion électrostatique entre les brins d'ADN.

La répulsion électrostatique entre deux brins d'ADN empêche la liaison de l'amorce à son emplacement spécifique. Ici l'ajout de MgCl 2 aide à une bonne liaison de l'amorce à sa séquence complémentaire.

Jusqu'à présent MgCl 2 implique dans deux activités importantes de la réaction PCR: augmenter Taq activité polymérase en agissant comme cofacteur et aide les amorces à se lier à un endroit spécifique.

"Trop de MgCl2 facilite la liaison non spécifique de l'amorce avec l'ADN matrice, ce qui entraîne des bandes d'ADN non spécifiques dans l'électrophorèse sur gel d'agarose."

Le tampon PCR standard contient du MgCl 2 ce qui est suffisant pour une réaction PCR normale. Cependant, dans certaines conditions (teneur élevée en GC de la matrice, amorce directe et inverse inappropriée et pour d'autres modifications PCR) plus de quantité de MgCl 2 est requis.

Au cours de la réaction PCR, les désoxynucléotides triphosphates se transforment en désoxynucléotide monophosphate pour former une liaison phosphodiester entre 3'-OH et 5'-P du nucléotide adjacent.

Crédit image : Wikimedia Commons

Ici mg 2 L'ion + se lie au phosphate alpha des dNTP, ce qui aide à éliminer les phosphates bêta et gamma des dNTP (permet uniquement au phosphate alpha de former une liaison phosphodiester avec le 3'-OH du dNTP adjacent).

Généralement, une concentration de 1 mM à 5 mM peut être utilisée pour la réaction PCR, mais la concentration standard est de 2 mM, ce qui donnera le meilleur résultat.

Une concentration supérieure à 2 mM entraînera une liaison non spécifique. Comme la concentration de MgCl 2 augmente, le risque de liaison non spécifique augmentera.

Plus la concentration de MgCl est élevée 2 , plus de bandes d'ADN seront observées pendant l'électrophorèse sur gel d'agarose car les amorces peuvent se lier à d'autres séquences que ses séquences complémentaires et amplifient plus de fragments.

Nous avons couvert toute une série d'articles sur l'électrophorèse sur gel d'agarose, lisez-la ici,

Comprenons comment MgCl 2 travaille:

  1. Un protocole standard sans ajout de tampon PCR.
  2. Ajout de tampon PCR
  3. Ajout de 2 mM de MgCl 2 dans la réaction
  4. Ajout de 3 mM de MgCl 2 dans la réaction
  5. Ajout de 4 mM de MgCl 2 dans la réaction
  6. Ajout de 5 mM MgCl 2 dans la réaction

Nous avons préparé les 6 tubes avec un contrôle négatif. Pour le contrôle positif, nous avons ajouté une amorce qui amplifiera le fragment de 800 pb dans chaque tube.

L'image représente différentes conditions de PCR.

  1. échelle d'ADN
  2. Réaction PCR sans tampon
  3. Réaction PCR avec tampon
  4. Réaction PCR avec 2 mM de MgCl 2
  5. Réaction PCR avec 3 mM MgCl 2
  6. Réaction PCR avec 4 mM de MgCl 2
  7. Réaction PCR avec 5 mM MgCl 2
  8. Contrôle négatif

Les résultats indiquent que le fragment de notre intérêt (fragment de 400 pb) est très moins amplifié sans tampon PCR mais il donne le meilleur résultat après ajout de 2mM de MgCl 2 avec le tampon PCR (piste 4).

Comme la concentration de MgCl 2 augmente la liaison non spécifique entraîne plus d'une bande, ce qui indique que la concentration de MgCl 2 augmenter la spécificité de liaison à l'amorce est diminuée.

En conclusion, si vous souhaitez modifier votre protocole PCR, un ajout de la quantité appropriée de MgCl 2 peut diminuer la température de recuit d'une amorce. Vous pouvez exécuter plus de deux protocoles à une même température (Cependant, la qualité du résultat peut diminuer).


Protocole

1. Concevoir des amorces

La conception d'amorces appropriées est essentielle au succès d'une expérience PCR. Lors de la conception d'un ensemble d'amorces pour une région spécifique de l'ADN souhaitée pour l'amplification, une amorce doit s'hybrider au brin plus, qui par convention est orienté dans la direction 5' → 3' (également connu sous le nom de brin sens ou non-modèle) et l'autre amorce doit compléter le brin moins, qui est orienté dans la direction 3' → 5' (brin antisens ou matrice). Il existe quelques problèmes courants qui surviennent lors de la conception des amorces : 1) auto-annelage des amorces entraînant la formation de structures secondaires telles que des boucles en épingle à cheveux (Figure 1a) 2) l'hybridation des amorces entre elles, plutôt qu'avec la matrice d'ADN, créant des dimères d'amorces (Figure 1b) 3) températures de fusion radicalement différentes (Tm) pour chaque amorce, ce qui rend difficile la sélection d'une température d'hybridation qui permettra aux deux amorces de se lier efficacement à leur séquence cible pendant le cycle thermique (Figure 1c) (Voir les sections CALCUL DE LA TEMPÉRATURE DE FUSION (Tm) et MODIFICATIONS DES CONDITIONS DE CYCLISME pour plus d'informations sur Tms).

Vous trouverez ci-dessous une liste de caractéristiques à prendre en compte lors de la conception des amorces.

La longueur de l'amorce doit être de 15 à 30 résidus nucléotidiques (bases).

La teneur optimale en G-C doit se situer entre 40 et 60 %.

L'extrémité 3' des amorces doit contenir un G ou un C afin de serrer l'amorce et d'empêcher la « respiration » des extrémités, augmentant ainsi l'efficacité de l'amorçage. La "respiration" de l'ADN se produit lorsque les extrémités ne restent pas recuites mais s'effilochent ou se séparent. Les trois liaisons hydrogène dans les paires GC aident à empêcher la respiration mais augmentent également la température de fusion des amorces.

Les extrémités 3' d'un jeu d'amorces, qui comprend une amorce brin plus et une amorce brin moins, ne doivent pas être complémentaires l'une de l'autre, et l'extrémité 3' d'une seule amorce ne peut pas non plus être complémentaire d'autres séquences dans l'amorce. Ces deux scénarios entraînent respectivement la formation de dimères d'amorces et de structures en boucle en épingle à cheveux.

Températures de fusion optimales (Tm) pour les amorces comprises entre 52-58 ଌ, bien que la plage puisse être étendue à 45-65 ଌ. Le T finalm pour les deux amorces ne doit pas différer de plus de 5 ଌ.

Les répétitions dinucléotidiques (par exemple, GCGCGCGCGC ou ATATATATAT) ou les analyses à base unique (par exemple, AAAAA ou CCCCC) doivent être évitées car elles peuvent provoquer un glissement le long du segment amorcé de l'ADN et/ou des structures en boucle en épingle à cheveux. Si cela est inévitable en raison de la nature de la matrice d'ADN, n'incluez que des répétitions ou des analyses de base unique avec un maximum de 4 bases.

Remarques:

Il existe de nombreux programmes informatiques conçus pour aider à la conception de paires d'amorces. L'outil de conception NCBI Primer http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ et Primer3 http://frodo.wi.mit.edu/primer3/ sont des sites Web recommandés à cet effet.

Afin d'éviter l'amplification de pseudogènes ou d'homologues apparentés, il pourrait être utile d'effectuer un blast sur NCBI pour vérifier la spécificité cible des amorces.

2. Matériaux et réactifs

Lors de la mise en place d'une expérience PCR, il est important d'être préparé. Porter des gants pour éviter de contaminer le mélange réactionnel ou les réactifs. Inclure un contrôle négatif, et si possible un contrôle positif.

Disposez tous les réactifs nécessaires à l'expérience PCR dans un seau à glace fraîchement rempli et laissez-les décongeler complètement avant de mettre en place une réaction (Figure 2). Gardez les réactifs sur la glace tout au long de l'expérience.

Les réactifs PCR standard comprennent un ensemble d'amorces appropriées pour le gène cible ou le segment d'ADN souhaité à amplifier, l'ADN polymérase, un tampon pour l'ADN polymérase spécifique, des désoxynucléotides (dNTP), une matrice d'ADN et de l'eau stérile.

Les réactifs supplémentaires peuvent inclure le sel de magnésium Mg 2+ (à une concentration finale de 0,5 à 5,0 mM), le sel de potassium K + (à une concentration finale de 35 à 100 mM), le diméthylsulfoxyde (DMSO à une concentration finale de 1 à 10 %) , formamide (à une concentration finale de 1,25-10 %), albumine de sérum bovin (à une concentration finale de 10-100 μg/ml) et bétaïne (à une concentration finale de 0,5 M à 2,5 M). Les additifs sont discutés plus en détail dans la section de dépannage.

Organiser l'équipement de laboratoire sur l'établi.

Les matériaux comprennent des tubes et des bouchons PCR, un support de tubes PCR, un marqueur résistant à l'éthanol et un ensemble de micropipettes qui distribuent entre 1 - 10 μl (P10), 2 - 20 μl (P20), 20 - 200 & #x003bcl (P200) et 200 - 1000 μl (P1000), ainsi qu'un thermocycleur.

Lors de la mise en place de plusieurs expériences PCR qui utilisent toutes les mêmes réactifs, elles peuvent être mises à l'échelle de manière appropriée et combinées dans un mélange maître (Master Mix). Cette étape peut être effectuée dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,8 ml (voir Notes).

Pour analyser les amplicons résultant d'une expérience PCR, des réactifs et du matériel pour l'électrophorèse sur gel d'agarose sont nécessaires. Pour approximer la taille d'un produit de PCR, une norme de taille de poids moléculaire appropriée et disponible dans le commerce est nécessaire.

3. Mise en place d'un mélange réactionnel

Commencez par faire un tableau des réactifs qui seront ajoutés au mélange réactionnel (voir Tableau 1).

Ensuite, étiquetez les tubes PCR avec le marqueur résistant à l'éthanol.

Les volumes de réaction varieront en fonction des concentrations des réactifs de base. Les concentrations finales (CF) pour une réaction typique de 50 μl sont les suivantes.

Tampon X (généralement fourni par le fabricant de l'ADN polymérase peut contenir 15 mM de MgCl2). Ajouter 5 μl de tampon 10X par réaction.

200 μM dNTP (50 μM de chacun des quatre nucléotides). Ajouter 1 μl de 10 mM de dNTP par réaction (dATP, dCTP, dTTP et dGTP sont à 2,5 mM chacun).

1,5 mM de Mg2+. Ajoutez uniquement s'il n'est pas présent dans le tampon 10X ou si nécessaire pour l'optimisation PCR. Par exemple, pour obtenir les 4,0 mM de Mg 2+ nécessaires à la production optimale d'amplicons d'un segment d'ADN conservé de 566 pb trouvé dans un mycobactériophage non caractérisé, ajoutez 8 μl de 25 mM de MgCl2 à la réaction (figure 3).

20 à 50 pmol de chaque amorce. Ajouter 1 μl de chaque apprêt 20 μM.

Ajouter 10 4 à 10 7 molécules (ou environ 1 à 1000 ng) matrice d'ADN. Ajouter 0,5 μl d'ADN de mycobactériophage génomique 2ng/μl.

Ajouter 0,5 à 2,5 unités d'ADN polymérase par réaction de 50 μl (Voir les recommandations des fabricants) Par exemple, ajouter 0,5 μl de Sigma 0,5 Unités/μl Taq ADN polymérase.

Ajouter Q.S. de l'eau distillée stérile pour obtenir un volume final de 50 μl par réaction comme prédéterminé dans le tableau des réactifs (Q.S. est une abréviation latine pour quantum satis signifiant la quantité nécessaire). Ainsi, 33 μl par réaction sont nécessaires pour porter le volume à 50 μl. Cependant, il est à noter que l'eau est ajoutée en premier mais nécessite dans un premier temps de faire un tableau des réactifs et de déterminer les volumes de tous les autres réactifs ajoutés à la réaction.

4. Protocole PCR de base

Placer une plaque à 96 puits dans le seau à glace comme support pour les tubes PCR à paroi mince de 0,2 ml. Permettre aux réactifs PCR d'être ajoutés dans des tubes PCR froids à paroi mince de 0,2 ml aidera à prévenir l'activité de la nucléase et l'amorçage non spécifique.

Pipeter les réactifs PCR suivants dans l'ordre suivant dans un tube PCR à paroi mince de 0,2 ml (Figure 4) : Eau stérile, tampon PCR 10X, dNTP, MgCl2, amorces et matrice d'ADN (voir Tableau 1). Étant donné que les expériences doivent avoir au moins un contrôle négatif et éventuellement un contrôle positif, il est avantageux de mettre en place un Master Mix dans un tube de microcentrifugeuse de 1,8 ml (voir l'explication dans les notes).

Dans des tubes PCR à paroi mince séparés de 0,2 ml (Figure 4) ajouter tous les réactifs à l'exception de l'ADN matrice pour un contrôle négatif (augmenter l'eau pour compenser le volume manquant). De plus, une autre réaction (si des réactifs sont disponibles) doit contenir un contrôle positif utilisant de l'ADN matrice et/ou des amorces connues pour s'amplifier dans les mêmes conditions que les tubes PCR expérimentaux.

Taq L'ADN polymérase est généralement stockée dans une solution de glycérol à 50 % et pour une dispersion complète dans le mélange réactionnel, il faut un mélange doux des réactifs PCR par pipetage vers le haut et vers le bas au moins 20 fois. La micropipette doit être réglée à environ la moitié du volume de réaction du mélange maître lors du mélange, et des précautions doivent être prises pour éviter d'introduire des bulles.

Mettez des bouchons sur les tubes PCR à paroi mince de 0,2 ml et placez-les dans le thermocycleur (Figure 5). Une fois le couvercle du thermocycleur bien fermé, démarrez le programme (voir Tableau 2).

Une fois le programme terminé, les tubes PCR à paroi mince de 0,2 ml peuvent être retirés et conservés à 4 ଌ. Les produits de PCR peuvent être détectés en chargeant des aliquotes de chaque réaction dans des puits d'un gel d'agarose, puis en colorant l'ADN qui a migré dans le gel après électrophorèse avec du bromure d'éthidium. Si un produit PCR est présent, le bromure d'éthidium s'intercalera entre les bases des brins d'ADN, permettant de visualiser les bandes avec un illuminateur UV.

Remarques:

Lors de la mise en place de plusieurs expériences de PCR, il est avantageux d'assembler un mélange de réactifs commun à toutes les réactions (c'est-à-dire Master Mix). Habituellement, le cocktail contient une solution d'ADN polymérase, de dNTP, de tampon de réaction et d'eau assemblée dans un tube de microcentrifugation de 1,8 ml. La quantité de chaque réactif ajouté au Master Mix est équivalente au nombre total de réactions plus 10 % arrondi à la réaction entière la plus proche. Par exemple, s'il y a 10 x 0,1 = 1 réaction, alors (10 + 1) x 5 μl 10X buffer équivaut à 55 μl de 10X buffer pour le Master Mix. Les réactifs du Master Mix sont soigneusement mélangés en pompant doucement le piston d'une micropipette de haut en bas environ 20 fois comme décrit ci-dessus. Chaque tube PCR reçoit une aliquote du Master Mix auquel la matrice d'ADN, les amorces requises et les réactifs spécifiques à l'expérience sont ensuite ajoutés (voir Tableaux 1 et 7).

Le site Web suivant propose une calculatrice pour déterminer le nombre de copies d'un modèle d'ADN (http://www.uri.edu/research/gsc/resources/cndna.html). Le nombre total de copies d'ADN double brin peut être calculé à l'aide de l'équation suivante : Nombre de copies d'ADN = (quantité d'ADN (ng) x 6,022x10 23 ) / (longueur d'ADN x 1x10 9 ng/ml x 650 Daltons) Le calcul du nombre de copies d'ADN est utilisé pour déterminer la quantité de matrice nécessaire par réaction.

Des faux positifs peuvent survenir à la suite d'un transfert d'une autre réaction de PCR qui serait visualisé comme de multiples produits indésirables sur un gel d'agarose après électrophorèse. Par conséquent, il est prudent d'utiliser une technique appropriée, d'inclure un contrôle négatif (et un contrôle positif lorsque cela est possible).

Bien que le bromure d'éthidium soit la tache la plus courante pour les acides nucléiques, il existe plusieurs alternatives plus sûres et moins toxiques. Le site Web suivant décrit plusieurs des alternatives, notamment le bleu de méthylène, le violet cristal, le SYBR Safe et le rouge gel, ainsi que des descriptions de la façon d'utiliser et de détecter le produit final (http://bitesizebio.com/articles/ethidium-bromide-the- alternatives/).

Alors que la plupart des machines PCR modernes utilisent des tubes de 0,2 ml, certains modèles peuvent nécessiter des réactions dans des tubes de 0,5 ml. Consultez le manuel de votre thermocycleur pour déterminer la taille de tube appropriée.

5. Calcul de la température de fusion (Tm)

Connaissant la température de fusion (Tm) des amorces est impératif pour une expérience PCR réussie. Bien qu'il existe plusieurs Tm calculatrices disponibles, il est important de noter que ces calculs sont une estimation du T réelm en raison du manque d'informations spécifiques sur une réaction particulière et des hypothèses formulées dans les algorithmes pour le Tm calculatrices elles-mêmes. Cependant, les modèles thermodynamiques du plus proche voisin sont préférés au calcul plus conventionnel : Tm ≈ 4(G-C) + 2(A-T). Le premier donnera T plus précism estimation car elle prend en compte l'énergie d'empilement des paires de bases voisines. Ce dernier est utilisé plus fréquemment car les calculs sont simples et peuvent être effectués rapidement à la main.Voir la section Dépannage pour plus d'informations sur la manière dont les diverses conditions de PCR et les additifs affectent la température de fusion. Pour calculer le Tm valeurs par les modèles thermodynamiques du plus proche voisin, l'un des calculateurs suivants est recommandé : http://www6.appliedbiosystems.com/support/techtools/calc/ http://www.cnr.berkeley.edu/

6. Configuration des conditions de cyclage thermique

Les thermocycleurs PCR chauffent et refroidissent rapidement le mélange réactionnel, permettant la dénaturation induite par la chaleur de l'ADN duplex (séparation des brins), l'annelage des amorces aux brins plus et moins de la matrice d'ADN et l'allongement du produit PCR. Les temps de cycle sont calculés en fonction de la taille de la matrice et de la teneur en GC de l'ADN. La formule générale commence par une étape de dénaturation initiale à 94 ଌ à 98 ଌ en fonction de la température optimale pour l'activité de l'ADN polymérase et la teneur en G-C de l'ADN matrice. Une réaction typique commencera par une dénaturation d'une minute à 94 ଌ. Une durée supérieure à 3 minutes peut inactiver l'ADN polymérase, détruisant son activité enzymatique. Une méthode, connue sous le nom de PCR à démarrage à chaud, prolonge considérablement le temps de dénaturation initial de 3 minutes à 9 minutes. Avec la PCR à démarrage à chaud, l'ADN polymérase est ajoutée une fois l'étape initiale de dénaturation exagérée terminée. Cette modification du protocole évite l'inactivation probable de l'enzyme ADN polymérase. Reportez-vous à la section Dépannage de ce protocole pour plus d'informations sur la PCR de démarrage à chaud et d'autres méthodes alternatives.

L'étape suivante consiste à régler le thermocycleur pour qu'il initie le premier des 25 à 35 cycles d'un cycle de température en trois étapes (Tableau 2). Alors qu'augmenter le nombre de cycles au-dessus de 35 entraînera une plus grande quantité de produits PCR, trop de cycles entraînent souvent l'enrichissement de produits secondaires indésirables. Les trois étapes de température dans un seul cycle accomplissent trois tâches : la première étape dénature la matrice (et dans les cycles ultérieurs, les amplicons également), la deuxième étape permet un annelage optimal des amorces, et la troisième étape permet à l'ADN polymérase de se lier à la matrice d'ADN et synthétiser le produit PCR. La durée et la température de chaque étape d'un cycle peuvent être modifiées pour optimiser la production de l'amplicon souhaité. La durée de l'étape de dénaturation est maintenue aussi courte que possible. En général, 10 à 60 secondes suffisent pour la plupart des matrices d'ADN. Le temps et la température de dénaturation peuvent varier en fonction de la teneur en G-C de l'ADN matrice, ainsi que du taux de rampe, qui est le temps qu'il faut au thermocycleur pour passer d'une température à l'autre. La température pour cette étape est généralement la même que celle utilisée pour la phase de dénaturation initiale (étape 1 ci-dessus, par exemple, 94 ଌ). Une étape de recuit de 30 secondes suit dans le cycle à une température réglée à environ 5 ଌ en dessous du T apparentm des amorces (idéalement entre 52 ଌ à 58 ଌ). Le cycle se termine par une étape d'allongement. La température dépend de l'ADN polymérase choisie pour l'expérience. Par exemple, Taq L'ADN polymérase a une température d'élongation optimale de 70 ଌ à 80 ଌ et nécessite 1 minute pour allonger les 2 premiers kb, puis nécessite une minute supplémentaire pour chaque 1 kb supplémentaire amplifié. L'ADN polymérase Pfu est une autre enzyme thermostable qui a une température d'élongation optimale de 75 ଌ. L'ADN polymérase Pfu est recommandée pour une utilisation dans les réactions de PCR et d'extension d'amorce qui nécessitent une haute fidélité et nécessitent 2 minutes pour chaque 1 kb à amplifier. Voir les recommandations du fabricant pour les températures d'élongation exactes et le temps d'élongation indiqués pour chaque ADN polymérase spécifique.

La phase finale du cycle thermique comprend une période d'allongement prolongée de 5 minutes ou plus. Cette dernière étape permet de terminer la synthèse de nombreux amplicons inachevés et, dans le cas de Taq L'ADN polymérase permet l'ajout d'un résidu adénine aux extrémités 3' de tous les produits PCR. Cette modification est médiée par l'activité transférase terminale de Taq ADN polymérase et est utile pour les procédures de clonage moléculaire ultérieures qui nécessitent un débord 3'.

La fin de la réaction est obtenue en refroidissant le mélange à 4 ଌ et/ou par l'ajout d'EDTA à une concentration finale de 10 mM.

7. Considérations importantes lors du dépannage de la PCR

Si les conditions PCR standard ne donnent pas l'amplicon souhaité, une optimisation PCR est nécessaire pour obtenir de meilleurs résultats. La rigueur d'une réaction peut être modulée de telle sorte que la spécificité est ajustée en modifiant les variables (par exemple, les concentrations de réactif, les conditions de cycle) qui affectent le résultat du profil d'amplicon. Par exemple, si la réaction n'est pas assez rigoureuse, de nombreux amplicons parasites seront générés avec des longueurs variables. Si la réaction est trop stricte, aucun produit ne sera produit. Le dépannage des réactions PCR peut parfois être une entreprise frustrante. Cependant, une analyse minutieuse et une bonne compréhension des réactifs utilisés dans une expérience PCR peuvent réduire le temps et les essais nécessaires pour obtenir les résultats souhaités. De toutes les considérations qui ont un impact sur la stringence de la PCR, le titrage du Mg 2+ et/ou la manipulation des températures de recuit résoudront probablement la plupart des problèmes. Cependant, avant de changer quoi que ce soit, assurez-vous qu'un résultat erroné n'est pas dû à une erreur humaine. Commencez par confirmer que tous les réactifs ont été ajoutés à une réaction donnée et que les réactifs n'étaient pas contaminés. Notez également le résultat erroné et posez les questions suivantes : Les dimères d'amorces sont-ils visibles sur le gel après électrophorèse (ceux-ci se présentent sous forme de petites bandes 𼄀 b près du bas de la piste) ? Existe-t-il des produits non spécifiques (bandes qui migrent à une taille différente du produit souhaité) ? Y avait-il un manque de produit ? L'ADN cible est-il sur un plasmide ou dans un extrait d'ADN génomique ? En outre, il est sage d'analyser la teneur en G-C de l'amplicon souhaité.

Déterminez d'abord si l'un des réactifs PCR est catastrophique pour votre réaction. Cela peut être réalisé en préparant de nouveaux réactifs (par exemple, des stocks de travail frais, de nouvelles dilutions), puis en ajoutant systématiquement un nouveau réactif à la fois aux mélanges réactionnels. Ce processus déterminera quel réactif était le coupable de l'échec de l'expérience PCR. Dans le cas d'ADN très ancien, qui accumule souvent des inhibiteurs, il a été démontré que l'ajout d'albumine de sérum bovin peut aider à atténuer le problème.

Des dimères d'amorces peuvent se former lorsque les amorces s'auto-hybrident de préférence ou s'hybrident à l'autre amorce dans la réaction. Si cela se produit, un petit produit de moins de 100 pb apparaîtra sur le gel d'agarose. Commencez par modifier le rapport de la matrice à l'amorce si la concentration d'amorce est en excès extrême par rapport à la concentration de matrice, alors les amorces seront plus susceptibles de s'hybrider entre elles ou entre elles sur la matrice d'ADN. L'ajout de DMSO et/ou l'utilisation d'une méthode de cycle thermique de démarrage à chaud peut résoudre le problème. En fin de compte, il peut être nécessaire de concevoir de nouvelles amorces.

Des produits non spécifiques sont produits lorsque la stringence PCR est excessivement faible, ce qui entraîne des bandes PCR non spécifiques avec des longueurs variables. Cela produit un effet d'échelle sur un gel d'agarose. Il est alors conseillé de choisir des conditions de PCR qui augmentent la stringence. Un frottis de différentes tailles peut également résulter d'amorces conçues pour des séquences hautement répétitives lors de l'amplification de l'ADN génomique. Cependant, les mêmes amorces peuvent amplifier une séquence cible sur un plasmide sans rencontrer le même problème.

Le manque de produits PCR est probablement dû à des conditions de réaction trop strictes. Les dimères d'amorces et les structures en boucle en épingle à cheveux qui se forment avec les amorces ou dans l'ADN matrice dénaturé peuvent également empêcher l'amplification des produits de PCR car ces molécules peuvent ne plus s'apparier avec la contrepartie d'ADN souhaitée.

Si la teneur en G-C n'a pas été analysée, il est temps de le faire. La PCR des régions riches en G-C (contenu en GC 㹠%) pose certains des plus grands défis de la PCR. Cependant, de nombreux additifs ont été utilisés pour aider à atténuer les problèmes.

8. Manipulation des réactifs PCR

Comprendre la fonction des réactifs utilisés sur la PCR conventionnelle est essentiel pour décider d'abord de la meilleure façon de modifier les conditions de réaction pour obtenir le produit souhaité. Le succès peut simplement dépendre de la modification de la concentration de MgCl2, KCl, dNTP, amorces, ADN matrice ou ADN polymérase. Cependant, la mauvaise concentration de ces réactifs peut conduire à des résultats erronés, diminuant la rigueur de la réaction. Lors du dépannage de la PCR, un seul réactif doit être manipulé à la fois. Cependant, il peut être prudent de titrer le réactif manipulé.

Sel de magnésium Mg 2+ (concentration réactionnelle finale de 0,5 à 5,0 mM) Les ADN polymérases thermostables nécessitent la présence de magnésium pour agir comme cofacteur pendant le processus de réaction. La modification de la concentration en magnésium est l'un des réactifs les plus faciles à manipuler avec peut-être le plus grand impact sur la rigueur de la PCR. En général, le rendement du produit PCR augmentera avec l'ajout de plus grandes concentrations de Mg 2+ . Cependant, des concentrations accrues de Mg 2+ diminueront également la spécificité et la fidélité de l'ADN polymérase. La plupart des fabricants incluent une solution de chlorure de magnésium (MgCl2) avec l'ADN polymérase et une solution tampon PCR 10X. Les solutions tampons 10 X PCR peuvent contenir 15 mM de MgCl2, ce qui est suffisant pour une réaction PCR typique, ou il peut être ajouté séparément à une concentration optimisée pour une réaction particulière. Mg 2+ n'est pas réellement consommé dans la réaction, mais la réaction ne peut pas se dérouler sans qu'il soit présent. Lorsqu'il y a trop de Mg 2+ , cela peut empêcher la dénaturation complète de la matrice d'ADN en stabilisant le brin duplex. Trop de Mg 2+ peut également stabiliser l'hybridation parasite des amorces à des sites de matrice incorrects et diminuer la spécificité résultant en des produits PCR indésirables. Lorsqu'il n'y a pas assez de Mg 2+ , la réaction ne se poursuit pas, ce qui entraîne l'absence de produit de PCR.

Sel de potassium K + (concentration réactionnelle finale de 35 à 100 mM) Les produits de PCR plus longs (10 à 40 kb) bénéficient de la réduction du sel de potassium (KCl) par rapport à sa concentration réactionnelle normale de 50 mM, souvent en conjonction avec l'ajout de DMSO et/ou glycérol. Si l'amplicon souhaité est inférieur à 1000 pb et que de longs produits non spécifiques se forment, la spécificité peut être améliorée en titrant le KCl, en augmentant la concentration par incréments de 10 mM jusqu'à 100 mM. L'augmentation de la concentration en sel permet aux molécules d'ADN plus courtes de se dénaturer préférentiellement en molécules d'ADN plus longues.

Désoxynucléotide 5'-triphosphates (concentration de réaction finale de 20 et 200 μM chacun) Les désoxynucléotide 5'-triphosphates (dNTP) peuvent poser des problèmes pour la PCR s'ils ne sont pas aux concentrations équivalentes appropriées (c'est-à-dire, [A] = [T] = [C] = [G]) et/ou en raison de leur instabilité due aux congélations et décongélations répétées. La concentration habituelle de dNTP est de 50 μM de CHACUN des quatre dNTP. Cependant, la PCR peut tolérer des concentrations comprises entre 20 et 200 μM chacune. Des concentrations plus faibles de dNTP peuvent augmenter à la fois la spécificité et la fidélité de la réaction, tandis que des concentrations excessives de dNTP peuvent en fait inhiber la PCR. Cependant, pour des fragments de PCR plus longs, une concentration de dNTP plus élevée peut être requise. Un grand changement dans la concentration de dNTP peut nécessiter un changement correspondant dans la concentration de Mg 2+.

Les ADN polymérases thermiquement stables Les enzymes PCR et les tampons associés à ces enzymes ont parcouru un long chemin depuis le premier Taq L'ADN polymérase a été utilisée pour la première fois. Ainsi, le choix d'une enzyme appropriée peut être utile pour obtenir les produits d'amplicons souhaités. Par exemple l'utilisation de Taq L'ADN polymérase peut être préférée à l'ADN polymérase Pfu si la processivité et/ou l'addition d'un résidu adénine aux extrémités 3' du produit PCR est souhaitée. L'ajout d'une adénine 3' est devenu une stratégie utile pour cloner des produits de PCR dans des vecteurs TA avec des surplombs de thymine 3'. Cependant, si la fidélité est plus importante, une enzyme telle que la Pfu peut être un meilleur choix. Plusieurs fabricants ont une gamme d'ADN polymérases spécifiques conçues pour des besoins spécialisés. Jetez un œil aux conditions de réaction et aux caractéristiques de l'amplicon souhaité, puis faites correspondre l'expérience PCR avec l'ADN polymérase appropriée. La plupart des fabricants ont des tableaux qui facilitent la sélection de l'ADN polymérase en répertoriant des caractéristiques telles que la fidélité, le rendement, la vitesse, les longueurs cibles optimales et si elle est utile pour l'amplification riche en G-C ou la PCR à démarrage à chaud.

ADN modèle La qualité et la pureté de l'ADN auront un effet substantiel sur la probabilité d'une expérience PCR réussie. Les concentrations d'ADN et d'ARN peuvent être déterminées à l'aide de leurs mesures de densité optique à 260 nm (DO260). La masse d'acides nucléiques purifiés en solution est calculée à 50 μg/ml d'ADN double brin ou 40 μg/ml pour l'ARN ou l'ADN simple brin à une DO260 =1.0. Les contaminants d'extraction d'ADN sont des inhibiteurs courants dans la PCR et doivent être soigneusement évités. Les inhibiteurs courants d'extraction d'ADN de la PCR comprennent les protéines, l'ARN, les solvants organiques et les détergents. Utilisation de l'absorption maximale des acides nucléiques OD260 par rapport à celle des protéines DO280 (DO260/280), il est possible de déterminer une estimation de la pureté de l'ADN extrait. Idéalement, le rapport de DO260/280 est compris entre 1,8 et 2,0. OD inférieur260/280 indique une contamination par des protéines et/ou des solvants qui, selon toute probabilité, sera problématique pour la PCR. En plus de la qualité de l'ADN matrice, l'optimisation de la quantité d'ADN peut grandement bénéficier au résultat d'une expérience PCR. Bien qu'il soit pratique de déterminer la quantité en ng/μl, qui est souvent la sortie des nanospectrophotomètres modernes, l'unité pertinente pour une expérience PCR réussie est le nombre de molécules. C'est-à-dire, combien de copies de matrice d'ADN contiennent une séquence complémentaire aux amorces de PCR ? Les molécules cibles optimales sont comprises entre 104 et 107 molécules et peuvent être calculées comme cela a été décrit dans les notes ci-dessus.

9. Réactifs additifs

Les réactifs additifs peuvent donner des résultats lorsque tout le reste échoue. Comprendre les réactifs et à quoi ils servent est essentiel pour déterminer quels réactifs peuvent être les plus efficaces dans l'acquisition du produit PCR souhaité. L'ajout de réactifs à la réaction est compliqué par le fait que la manipulation d'un réactif peut avoir un impact sur la concentration utilisable d'un autre réactif. En plus des réactifs énumérés ci-dessous, des additifs exclusifs disponibles dans le commerce sont disponibles auprès de nombreuses sociétés de biotechnologie.

10. Additifs qui profitent aux modèles riches en G-C

Diméthylsulfoxyde (concentration réactionnelle finale de 1 à 10 % de DMSO) Dans les expériences de PCR dans lesquelles l'ADN matrice est particulièrement riche en G-C (teneur en GC 㹠%), l'ajout de DMSO peut améliorer la réaction en perturbant l'appariement des bases et en abaissant efficacement le Tm. Certains Tm les calculatrices incluent une entrée variable pour ajouter la concentration de DMSO souhaitée dans l'expérience PCR. Cependant, l'ajout de plus de 2% de DMSO peut nécessiter l'ajout de plus d'ADN polymérase car il a été démontré qu'il inhibe Taq ADN polymérase.

Formamide (concentration réactionnelle finale de 1,25-10%) Comme le DMSO, le formamide perturbe également l'appariement des bases tout en augmentant la stringence de l'hybridation des amorces, ce qui entraîne moins d'amorçage non spécifique et une efficacité d'amplification accrue. Le formamide s'est également avéré être un amplificateur pour les modèles riches en G-C.

7-déaza-2'-désoxyguanosine 5'-triphosphate (concentration réactionnelle finale de dc 7 GTP 3 dc 7 GTP:1 dGTP 50 μM) Utilisation de 3 parties, ou 37,5 μM, de l'analogue de guanosine base dc 7 GTP en conjonction avec 1 partie, ou 12,5 μM, le dGTP déstabilisera la formation de structures secondaires dans le produit. Lorsque l'amplicon ou l'ADN matrice est dénaturé, il formera souvent des structures secondaires telles que des boucles en épingle à cheveux. L'incorporation de dc 7 GTP dans l'amplicon d'ADN interdira la formation de ces structures aberrantes.

dc 7 GTP atténue le signal de coloration au bromure d'éthidium, c'est pourquoi il est utilisé dans un rapport 3:1 avec dGTP.

Bétaïne (concentration réactionnelle finale de 0,5 M à 2,5 M) La bétaïne (N,N,N-triméthylglycine) est un analogue d'acide aminé zwitterionique qui réduit et peut même éliminer la dépendance de la température de fusion de l'ADN à la composition nucléotidique. Il est utilisé comme additif pour faciliter l'amplification par PCR de cibles riches en G-C. La bétaïne est souvent utilisée en combinaison avec le DMSO et peut considérablement augmenter les chances d'amplifier l'ADN cible avec une teneur élevée en G-C.

11. Additifs qui aident la PCR en présence d'inhibiteurs

Les détergents non ioniques ont pour fonction de supprimer la formation de structure secondaire et d'aider à stabiliser l'ADN polymérase. Des détergents non ioniques tels que Triton X-100, Tween 20 ou NP-40 peuvent être utilisés à des concentrations réactionnelles de 0,1 à 1 % afin d'augmenter la production d'amplicons. Cependant, des concentrations supérieures à 1% peuvent être inhibitrices de la PCR. La présence de détergents non ioniques diminue la rigueur de la PCR, entraînant potentiellement la formation de produits parasites. Cependant, leur utilisation neutralisera également les effets inhibiteurs du SDS, un contaminant occasionnel des protocoles d'extraction d'ADN.

L'ajout de protéines spécifiques telles que l'albumine sérique bovine (BSA) utilisée à 400 ng/μl et/ou la protéine T4 gène 32 à 150 ng/μl facilitent la PCR en présence d'inhibiteurs tels que FeCl3, hémine, acide fulvique, acide humique, acides tanniques ou extraits de matières fécales, d'eau douce et d'eau de mer. Cependant, certains inhibiteurs de PCR, y compris les sels biliaires, la bilirubine, l'EDTA, le NaCl, le SDS ou le Triton X-100, ne sont pas atténués par l'ajout de BSA ou de la protéine T4 du gène 32.

12. Modifications des conditions de cyclisme

L'optimisation de la température de recuit améliorera toute réaction de PCR et doit être envisagée en combinaison avec d'autres additifs et/ou avec d'autres modifications des conditions de cyclage. Ainsi, afin de calculer la température de recuit optimale, l'équation suivante est utilisée : Tune OPT = 0,3 Tm Apprêt + 0,7 Tm Produit -14,9 Tm L'amorce est calculée comme le Tm de la paire la moins stable en utilisant l'équation : Tm Amorce = ((ΔH/(ΔS+R x ln(c/4)))-273,15 + 16,6 log[K + ] Où ΔH est la somme des changements d'enthalpie du voisin le plus proche pour les hybrides ΔS est la somme des changements d'entropie du voisin le plus proche R est la constante de gaz (1,99 cal K-1 mol-1) C est la concentration d'amorce et [K + ] est la concentration en potassium. Cette dernière équation peut être calculée en utilisant l'un des Tm calculatrices répertoriées sur le site Web suivant : http://protein.bio.puc.cl/cardex/servers/melting/sup_mat/servers_list.html Tm Le produit est calculé comme suit : Tm Produit = 0,41(%G-C) + 16,6 log [K + ] - 675/longueur du produit Pour la plupart des réactions PCR, la concentration de potassium ([K + ]) sera de 50 mM.

La PCR à démarrage à chaud est une modification polyvalente dans laquelle le temps de dénaturation initial est considérablement augmenté (Tableau 4). Cette modification peut être incorporée avec ou sans autres modifications des conditions de cyclage. De plus, il est souvent utilisé en conjonction avec des additifs pour la formation d'amplicons capricieux. En fait, la PCR de démarrage à chaud est de plus en plus incluse comme un aspect régulier des conditions générales de cyclisme. Il a été démontré que le démarrage à chaud augmente le rendement en amplicon, tout en augmentant la spécificité et la fidélité de la réaction. La justification de la PCR à démarrage à chaud est d'éliminer l'amorce-dimère et l'amorçage non spécifique qui peuvent résulter de la mise en place de la réaction en dessous de la Tm. Ainsi, une réaction de démarrage à chaud typique chauffe l'échantillon à une température supérieure à la T optimalem, au moins à 60 ଌ avant qu'une amplification ne puisse se produire. En général, l'ADN polymérase est retirée de la réaction pendant le temps de dénaturation initial allongé. Bien que d'autres composants de la réaction soient parfois omis à la place de l'ADN polymérase, nous nous concentrerons ici sur l'ADN polymérase. Il existe plusieurs méthodes qui permettent à l'ADN polymérase de rester inactive ou physiquement séparée jusqu'à la fin de la période de dénaturation initiale, notamment l'utilisation d'une barrière de cire solide, d'anticorps anti-ADN polymérase et de protéines accessoires. En variante, l'ADN polymérase peut être simplement ajoutée à la réaction une fois le cycle de dénaturation initial terminé.

Touchdown PCR (TD-PCR) est destiné à prendre une partie de la conjecture de la Tm limitations de calcul en mettant entre parenthèses les températures de recuit calculées. Le concept est de concevoir deux phases de conditions cyclables (Tableau 5). La première phase utilise des températures de recuit successivement plus basses tous les deux cycles (traditionnellement 1,0 ଌ), en commençant à 10 ଌ ci-dessus et en terminant au T calculém ou légèrement en dessous. La phase deux utilise les conditions standard en 3 étapes avec la température de recuit réglée à 5 ଌ en dessous du T calculém pendant 20 à 25 cycles supplémentaires. La fonction de la première phase devrait atténuer les erreurs d'amorçage, conférant un avantage quadruple au bon produit. Ainsi, après 10 cycles, un avantage de 410 fois donnerait 4096 copies du produit correct par rapport à tout amorçage parasite.

La PCR progressive est similaire à la TD-PCR avec moins d'incréments dans la première phase d'amorçage. À titre d'exemple, la première phase abaisse les températures de recuit tous les deux cycles de 3 ଌ, en commençant à 10 ଌ au-dessus et en finissant à 2 ଌ en dessous du T calculé.m. Comme la TD-PCR, la phase deux utilise les conditions standard en 3 étapes avec la température de recuit réglée à 5 ଌ en dessous de la T calculéem pendant 20 à 25 cycles supplémentaires. Cela permettrait au bon produit un avantage de 256 fois par rapport aux faux produits d'amorçage.

La PCR lente est simplement une modification de la TD-PCR et a réussi à amplifier des séquences extrêmement riches en G-C (au-dessus de 83 %) (Tableau 6). Le concept prend en compte une fonctionnalité relativement nouvelle associée aux thermocycleurs modernes, qui permet d'ajuster la vitesse de rampe ainsi que la vitesse de refroidissement. Le protocole utilise également dc 7 GTP pour réduire la formation de 2 &# x000b0structure qui pourrait inhiber la réaction. La vitesse de rampe est abaissée à 2,5 ଌ s -1 avec une vitesse de refroidissement de 1,5 ଌ s -1 pour les cycles de recuit. La première phase commence par une température de recuit de 70 ଌ et réduit la température de recuit de 1 ଌ tous les 3 tours jusqu'à ce qu'elle atteigne 58 ଌ. La deuxième phase se poursuit ensuite avec une température de recuit de 58 ଌ pendant 15 cycles supplémentaires.

La PCR nichée est un outil puissant utilisé pour éliminer les produits parasites. L'utilisation d'amorces imbriquées est particulièrement utile lorsqu'il existe plusieurs gènes paralogues dans un même génome ou lorsqu'il existe un faible nombre de copies d'une séquence cible au sein d'une population hétérogène de séquences orthologues. La procédure de base implique deux ensembles d'amorces qui amplifient une seule région d'ADN. Les amorces externes chevauchent le segment d'intérêt et sont utilisées pour générer des produits de PCR qui sont souvent non spécifiques en 20 à 30 cycles. Une petite aliquote, généralement à environ 5 μl de la première réaction de 50 μl, est ensuite utilisée comme matrice d'ADN pour 20 à 30 autres cycles d'amplification en utilisant le deuxième ensemble d'amorces qui s'hybrident à un emplacement interne par rapport au premier ensemble.

D'autres protocoles PCR sont plus spécialisés et dépassent le cadre de cet article. Les exemples incluent RACE-PCR, Multiplex-PCR, Vectorette-PCR, Quantitative-PCR et RT-PCR.

13. Résultats représentatifs

Des résultats de PCR représentatifs ont été générés en suivant les protocoles de PCR de base décrits ci-dessus. Les résultats intègrent plusieurs stratégies de dépannage pour démontrer l'effet de divers réactifs et conditions sur la réaction. Gènes de la levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae et à partir d'un mycobactériophage non caractérisé ont été amplifiés dans ces expériences. Le protocole PCR standard en 3 étapes décrit dans le tableau 2 a été utilisé pour les trois expériences décrites ci-dessous.

Avant de mettre en place l'expérience PCR, l'ADN génomique des deux S. cerevisiae et les mycobactériophages ont été quantifiés et dilués à une concentration qui permettrait entre 10 4 et 10 7 molécules d'ADN par réaction. Les stocks de travail ont été préparés comme suit. Une préparation d'ADN de levure génomique a donné 104 ng/μl. Une dilution à 10 ng/μl a été générée en ajoutant 48 μl dans 452 μl de tampon TE pH 8,0. Depuis le S. cerevisiae le génome est d'environ 12,5 Mb, 10 ng contiennent 7,41 X 10 5 molécules. La préparation d'ADN de mycobactériophage génomique a donné 313 ng/μl. Une dilution à 2 ng/μl a été générée en ajoutant 6,4 μl dans 993,6 μl de tampon TE pH 8,0. Cet ADN de phage est d'environ 67 Kb. Ainsi, 1 ng contient 2,73 X 10 7 molécules, ce qui est à la limite supérieure de l'ADN généralement utilisé pour une PCR. Les stocks de travail ont ensuite été utilisés pour générer les solutions Master Mix décrites dans Tableau 7. Les expériences ont varié les conditions de cyclage comme décrit ci-dessous.

Dans Figure 3a, ADN génomique de S. cerevisiae a été utilisé comme matrice pour amplifier le gène GAL3, qui code pour une protéine impliquée dans le métabolisme du galactose. Le but de cette expérience était de déterminer la concentration optimale de Mg 2+ pour cet ensemble de réactifs. Pas de MgCl2 était présent dans le tampon PCR original et devait être complété aux concentrations indiquées avec une gamme testée de 0,0 mM à 5,0 mM. Comme le montre la figure, un produit PCR de la taille attendue (2098 pb) apparaît à partir d'une concentration en Mg 2+ de 2,5 mM (piste 6) avec une concentration optimale à 4,0 mM (piste 9). La concentration recommandée fournie par le fabricant était de 1,5 mM, ce qui correspond à la quantité fournie dans les tampons PCR typiques. De manière peut-être surprenante, la concentration nécessaire requise pour la formation du produit dans cette expérience dépassait cette quantité.

Une matrice d'ADN différente a été utilisée pour l'expérience présentée dans Figure 3b. L'ADN génomique d'un mycobactériophage a été utilisé pour amplifier un segment d'ADN conservé de 566 pb. Comme pour l'expérience précédente, la concentration optimale en Mg 2+ a dû être déterminée. Comme représenté sur la Figure 3b, l'amplification du produit de PCR souhaité nécessite au moins 2,0 mM de Mg 2+ (piste 5). Alors qu'il y avait plus de variabilité dans la quantité de produit formé à des concentrations croissantes de MgCl2, le plus de produit PCR a été observé à 4 mM de Mg 2+ (piste 9), la même concentration observée pour le gène GAL3 de levure.

Notez que dans les expériences présentées dans Figures 3A et 3B, une bande discrète a été obtenue en utilisant les conditions de cyclage considérées comme optimales sur la base des températures de recuit des amorces. Plus précisément, la température de dénaturation était de 95 ଌ avec une température de recuit de 61 ଌ, et l'extension a été réalisée pendant 1 minute à 72 ଌ pendant 30 cycles. L'extension finale de 5 minutes a ensuite été effectuée à 72 ଌ. Pour la troisième expérience présentée dans Figure 3c, trois changements ont été apportés aux conditions de cyclage utilisées pour amplifier le gène GAL3 de levure. Tout d'abord, la température de recuit a été réduite à une température sous-optimale de 58 ଌ. Deuxièmement, le temps d'extension a été prolongé à 1 minute et 30 secondes. Troisièmement, le nombre de cycles a été augmenté de 30 à 35 fois. Le but était de démontrer les effets des conditions d'amplification sous-optimales (c'est-à-dire la réduction de la stringence de la réaction) sur une expérience de PCR. Comme représenté sur la Figure 3c, ce qui était un groupe discret dans Figure 3a, devient un frottis de produits non spécifiques dans ces conditions de cyclage sous-optimales. De plus, avec la stringence globale de la réaction réduite, une quantité inférieure de Mg 2+ est nécessaire pour former un amplicon.

Les trois expériences montrent que lorsque les concentrations de Mg 2+ sont trop faibles, il n'y a pas de production d'amplicon. Ces résultats démontrent également que lorsque les deux conditions de cyclage sont correctement conçues et que les réactifs sont à des concentrations optimales, l'expérience PCR produit un amplicon discret correspondant à la taille attendue. Les résultats montrent l'importance d'effectuer des expériences de PCR à une stringence suffisamment élevée (par exemple, des bandes discrètes par rapport à un frottis). De plus, les expériences indiquent que la modification d'un paramètre peut influencer un autre paramètre, affectant ainsi le résultat de la réaction.

Tableau 1. réactifs PCR dans l'ordre dans lequel ils doivent être ajoutés.

*Les unités peuvent varier d'un fabricant à l'autre

** Ajouter tous les réactifs au Master Mix à l'exception de ceux nécessitant un titrage ou pouvant varier en fonction de la réaction. Le Master Mix représenté dans le tableau ci-dessus est calculé pour 11 réactions plus 2 réactions supplémentaires pour compenser la perte de transfert de la pipette en s'assurant qu'il y a suffisamment d'aliquotes dans chaque tube de réaction.

 Cycle PCR standard en 3 étapes 
Étape du cycleTempératureTempsNombre de cycles
Dénaturation initiale94 ଌ à 98 ଌ1 minute1
Dénaturation recuit Extension94 ଌ 5 ଌ en dessous de Tm 70 ଌ à 80 ଌ 10 à 60 secondes 30 secondes Dépendant de l'amplicon et de l'ADN polymérase 25-35
Prolongation finale70 ଌ à 80 ଌ5 minutes1
Prise*4 ଌ1

Tableau 2. Cycle PCR standard en 3 étapes.

* La plupart des thermocycleurs ont la possibilité de s'arrêter indéfiniment à 4ଌ à la fin des cycles.

 Cyclisme PCR en 2 étapes 
Étape du cycleTempératureTempsNombre de cycles
Dénaturation initiale94 ଌ à 98 ଌ1 minute1
Dénaturation Recuit/Extension94 ଌ 70 ଌ à 80 ଌ10 à 60 secondes Dépendant de l'amplicon et de l'ADN polymérase 25-35
Prolongation finale70 ଌ à 80 ଌ5 minutes1

Tableau 3. Cyclisme PCR en 2 étapes.

 Cycle PCR à démarrage à chaud 
Étape du cycleTempératureTempsCycles
Dénaturation initiale60 ଌ à 95 ଌ5 minutes puis ajouter l'ADN polymérase1
Dénaturation recuit Extension94 ଌ 5 ଌ en dessous de Tm 70 ଌ à 80 ଌ10 à 60 secondes 30 secondes Dépendant de l'amplicon et de l'ADN polymérase 25-35
Prolongation finale70 ଌ à 80 ଌ5 minutes1

Tableau 4. Cycle PCR à démarrage à chaud.

 Cyclisme PCR Touchdown 
Étape du cycleTempératureTempsCycles
Dénaturation initiale94 ଌ à 98 ଌ1 minute1
Dénaturation recuit Extension94 ଌ X =10 ଌ au-dessus de Tm 70 ଌ à 80 ଌ10 à 60 secondes 30 secondes Dépendant de l'amplicon et de l'ADN polymérase 2
Dénaturation recuit Extension94 ଌ X-1 ଌ réduire 1 ଌ tous les deux cycles 70 ଌ à 80 ଌ10 à 60 secondes 30 secondes Dépendant de l'amplicon et de la polymérase 28
Dénaturation recuit Extension94 ଌ 5 ଌ en dessous de Tm 70 ଌ à 80 ଌ10 à 60 secondes 30 secondes Dépendant de l'amplicon et de l'ADN polymérase 20-25
Prolongation finale70 ଌ à 80 ଌ5 minutes1

Tableau 5. Touchdown PCR Cyclisme.

 Ralentissement du cycle PCR 
Étape du cycleTempératureTempsCycles
Dénaturation initiale94 ଌ à 98 ଌ1 minute1
Dénaturation recuit Extension94 ଌ X ଌ =10 ଌ au-dessus de Tm 70 ଌ à 80 ଌ10 à 60 secondes 30 secondes Dépendant de l'amplicon et de la polymérase 2
Dénaturation recuit Extension94 ଌ X-1 ଌ réduire 1 ଌ tous les deux cycles 70 ଌ à 80 ଌ*10 à 60 secondes 30 secondes Dépendant de l'amplicon et de la polymérase 28
Dénaturation recuit Extension94 ଌ 5 ଌ en dessous de Tm 70 ଌ à 80 ଌ10 à 60 secondes 30 secondes Dépendant de l'amplicon et de la polymérase 20-25
Prolongation finale70 ଌ à 80 ଌ5 minutes1

Tableau 6. Ralentissement du cycle PCR.

*Pour la PCR au ralenti, la vitesse de rampe est abaissée à 2,5 ଌ s -1 avec une vitesse de refroidissement de 1,5 ଌ s -1 pour les cycles de recuit.

Tableau 7. Titrage du Mg 2+ utilisé dans figure 3.

Figure 1. Problèmes courants qui surviennent avec les amorces et l'amplification PCR en 3 étapes de l'ADN cible. (a) Auto-annelage des amorces entraînant la formation d'une structure de boucle en épingle à cheveux secondaire. Notez que les amorces ne s'hybrident pas toujours aux extrémités et peuvent former des structures en boucle plus petites. (b) L'annelage des amorces entre elles, plutôt qu'avec la matrice d'ADN, créant des dimères d'amorces. Une fois que les amorces s'hybrident les unes aux autres, elles s'allongeront jusqu'aux extrémités des amorces. (c) Cycles PCR générant un amplicon spécifique. Le cycle PCR standard en 3 étapes comprend la dénaturation de l'ADN matrice, l'annelage des amorces et l'extension de l'ADN cible (amplicon) par l'ADN polymérase.

Figure 2. Seau à glace avec réactifs, pipettes et racks requis pour une PCR. (1.) Pipette P-200, (2.) Pipette P-1000, (3.) Pipette P-20, (4.) Pipette P-10, (5.) Plaque à 96 puits et tubes PCR à paroi mince de 0,2 ml , (6.) Réactifs comprenant Taq polymérase, tampon PCR 10X, MgCl2, eau stérile, dNTP, amorces et matrice d'ADN, (7.) tubes et rack de 1,8 ml.

Figure 3. Exemple de titrages Mg 2+ utilisés pour optimiser une expérience PCR à l'aide d'un protocole PCR standard en 3 étapes. (une) S. cerevisiae L'ADN génomique de levure a été utilisé comme matrice pour amplifier un gène GAL3 de 2098 pb. Dans les pistes 1 à 6, où la concentration en Mg 2+ est trop faible, il n'y a pas de produit formé (pistes 1 à 5) ou très peu de produit formé (piste 6). Les pistes 7 à 11 représentent les concentrations optimales de Mg 2+ pour cette expérience de PCR comme indiqué par la présence du produit d'amplicon de 2098 pb. (b) Une matrice d'ADN génomique de mycobactériophage non caractérisée a été utilisée pour amplifier un amplicon de 566 pb. Pistes 1 à 4, la concentration en Mg 2+ est trop faible, comme indiqué par l'absence de produit. Les pistes 5 à 11 représentent les concentrations optimales de Mg 2+ pour cette PCR comme indiqué par la présence du produit d'amplicon de 566 kb. (c) . S. cerevisiae L'ADN génomique de levure a été utilisé comme matrice pour amplifier un gène GAL3 de 2098 pb comme indiqué dans le panneau a. Cependant, la température de recuit a été réduite de 61 ଌ à 58 ଌ, résultant en des bandes PCR non spécifiques avec des longueurs variables produisant un effet de maculage sur le gel d'agarose. Pistes 1 à 4, où la concentration en Mg 2+ est trop faible, il n'y a pas de produit formé. Les pistes 5 à 8 représentent les concentrations optimales de Mg 2+ pour cette PCR comme le montre la présence d'un frottis et d'une bande autour de la taille du produit d'amplicon de 2098 kb. Les pistes 9 à 11 indiquent des conditions excessivement strictes sans formation de produit. (a-c) Les pistes 12 sont un contrôle négatif qui ne contient aucun ADN matrice. Lane M (marqueur) a été chargée avec NEB 1kb Ladder.

Figure 4. Tubes stériles utilisés pour la PCR. (1.) Tube de 1,8 ml (2.) Tube PCR individuel à paroi mince de 0,2 ml, (3.) Tubes et bouchons PCR à paroi mince en bande de 0,2 ml.

Figure 5. Thermocycleur. Image de gauche du thermocycleur fermé. L'image de droite contient des tubes PCR à paroi mince de 0,2 ml placés dans le bloc chauffant d'un thermocycleur ouvert.


Optimiser votre PCR

La PCR peut parfois nécessiter une optimisation des conditions de réaction afin d'obtenir un résultat satisfaisant. Découvrez comment optimiser les conditions de PCR pour vos expériences en utilisant la FAQ ci-dessous.

Lors de l'optimisation des conditions de PCR, quelles conditions sont particulièrement importantes ?

Étape de dénaturation initiale

Un préchauffage est parfois nécessaire pour dénaturer les matrices complexes (par exemple, l'ADN génomique) 94°C pendant 1 min est suffisant pour la dénaturation. Un traitement thermique excessif peut conduire à l'inactivation des enzymes.

  • Pour Terra PCR Direct Polymerase Mix, qui est utilisé pour l'amplification PCR directe à partir de tissus sans extraction ni purification d'ADN, un préchauffage à 98°C pendant 2 min est requis.
  • Pour Takara LA Taq ADN polymérases et ADN polymérases Advantage GC2, une première étape de dénaturation est nécessaire.
  • Les enzymes PrimeSTAR ne nécessitent pas de préchauffage pour l'activation des enzymes.

Conditions dénaturantes

Les conditions de dénaturation doivent être sélectionnées en tenant compte du modèle de thermocycleur qui sera utilisé. Une directive générale est 94&ndash95°C pendant 30 sec ou 98°C pendant 10 sec.

Si vous utilisez une enzyme résistante à la chaleur, telle que l'une des polymérases PrimeSTAR, nous recommandons une étape de dénaturation de courte durée et à haute température (c'est-à-dire 5&ndash10 sec à 98°C).

Une dénaturation à une température excessivement élevée ou pendant trop longtemps peut entraîner une perte d'activité enzymatique et/ou endommager les matrices longues.

Conditions de recuit

L'étape de recuit doit être ajustée pour chaque jeu d'amorces, la température de recuit dépend directement de la Tm d'amorces. L'utilisation de températures d'hybridation trop basses peut entraîner une erreur d'amorçage et une amplification non spécifique, conduisant à de faibles rendements du produit souhaité.

L'efficacité et la spécificité de l'amplification peuvent être améliorées en ajustant la température de recuit en fonction du T de l'amorcem ou en effectuant une PCR en deux étapes.

  • Pour Taq enzymes, le temps de recuit recommandé est de 30 sec.
  • Les enzymes de la série PrimeSTAR ont une excellente efficacité d'amorçage. Par conséquent, il est important d'utiliser un temps de recuit court de 5 à 15 secondes. Des temps d'hybridation excessivement longs peuvent conduire à une amplification non spécifique induite par une erreur d'amorçage.
  • Lors de l'amplification de courtes séquences inférieures à 1 ko, un protocole PCR en trois étapes est recommandé. Pour les cibles riches en GC ou les amplifications de longues séquences (>10 kb), un protocole PCR en deux étapes est recommandé.

Étape d'extension

En général, un temps d'extension de 1 min/ko est recommandé. Lorsque vous utilisez les enzymes à grande vitesse SpeedSTAR HS DNA Polymerase ou SapphireAmp Fast PCR Master Mix, utilisez une vitesse de réaction de 10 s/kb de produit amplifié (c'est-à-dire 10 s pour un produit de 1 ko, 20 s pour un produit de 2 ko , etc.).

PrimeSTAR Max DNA Polymerase et PrimeSTAR GXL DNA Polymerase contiennent un facteur d'allongement exclusif et permettent des réactions à grande vitesse à 5&ndash20 sec/kb. Si vous utilisez ces enzymes avec des échantillons contenant un excès de matrice, un temps d'élongation de 1 min/kb doit être utilisé.

Dois-je utiliser un protocole PCR en trois étapes ou en deux étapes ?

La PCR en trois étapes comprend des étapes de dénaturation, d'hybridation et d'extension. Ce type de protocole doit être utilisé lorsque le Tm des amorces est inférieure à la température d'extension ou est inférieure à 68°C.

Si la température de fusion du primaire (Tm) est proche de la température d'extension (72°C) ou quelques degrés en dessous, envisagez d'utiliser un protocole PCR en deux étapes qui comprend une étape de dénaturation et une étape combinée d'annelage/extension. Avec ce protocole, la température de recuit ne doit pas dépasser la température d'extension.

Quelle température d'extension dois-je utiliser, 68°C ou 72°C ?

Une température d'extension de 68°C est préférée pour la PCR en deux étapes et lors de l'amplification de modèles plus longs (>4 kb). Cette température d'extension inférieure améliore considérablement les rendements des produits d'amplification plus longs en réduisant le taux de dépuration qui influence l'amplification.

72°C doit être utilisé comme température d'extension lors de la réalisation d'une PCR standard en trois étapes et pour l'amplification de fragments courts (<4 kb).

Quelle est la quantité optimale de matrice d'ADN qui devrait être utilisée pour la PCR ?

La quantité optimale de matrice requise dépend de la complexité de la matrice et du nombre de copies de la séquence cible. Environ 104 copies de la séquence d'ADN cible sont nécessaires pour détecter le produit d'amplification dans 25&ndash30 cycles PCR.

  • Typiquement, 1 µg d'ADN génomique humain contient 3,04 x 105 molécules d'ADN. Pour la plupart des applications PCR, 30&ndash100 ng d'ADN génomique humain sont suffisants. Les cibles à copie élevée, telles que les gènes d'entretien, ne nécessitent que 10 ng de matrice. Les quantités de modèles pour les modèles plus complexes varient entre 10 ng et 500 ng.
  • Typiquement, 1 µg de E. coli L'ADN génomique contient 2 x 10 8 molécules d'ADN par conséquent, la quantité recommandée de matrice se situe entre 100 pg et 1 ng.
  • Typiquement, 1 µg d'ADN lambda contient 1,9 x 10 10 molécules d'ADN, par conséquent, l'entrée de matrice peut être aussi faible que 100 pg.
  • La quantité de modèle d'ADNc dépend du nombre de copies de la cible. L'entrée d'ADNc est généralement décrite en termes d'entrée d'ARN équivalente. La quantité d'ADNc dans une réaction PCR peut être aussi faible que 10 pg (équivalent ARN).

Il est important de noter que toutes les polymérases ne peuvent pas tolérer des quantités excessives de matrice. Pour les échantillons contenant un excès de matrice (jusqu'à 1 µg), nous recommandons PrimeSTAR GXL DNA Polymerase.

Quels sont les facteurs critiques pour l'amplification de cibles génomiques longues ?

Qualité du modèle

L'intégrité de l'ADN est critique pour l'amplification de cibles longues. Les dommages à l'ADN, tels que la rupture de l'ADN lors de l'isolement de l'ADN ou la dépurination de l'ADN à des températures élevées et à un pH bas, entraînent une plus grande quantité de produits partiels et une diminution du rendement global. Des dommages à l'ADN peuvent également se produire dans des conditions acides, évitez donc d'utiliser de l'eau pour remettre en suspension les matrices d'ADN. L'ADN est le plus stable à pH 7&ndash8 ou dans des solutions tamponnées.

Conditions PCR

  • Le temps de dénaturation doit être réduit au minimum pour réduire les événements de dépurination.
  • Utilisez le démarrage PCR touchdown à une température de recuit plus élevée et réduisez de deux degrés par cycle pendant plusieurs cycles.
  • Apprêts de conception avec des températures de fusion (Tm) au-dessus de 68°C.

PCR polymérases

Nous proposons plusieurs polymérases PCR optimisées pour la PCR longue portée. Takara LA Taq ADN polymérase, TaKaRa LA Taq La polymérase avec tampon GC et l'ADN polymérase PrimeSTAR GXL sont recommandées en fonction de la teneur en GC et de la taille de la ou des cibles.

Comment déterminer si un modèle est riche en GC ?

Le rapport GC varie à travers le génome. Les modèles avec >65% de contenu GC sont considérés comme riches en GC. Les régions riches en GC du génome sont principalement concentrées dans les régions régulatrices, y compris les promoteurs, les amplificateurs et les éléments cis-régulateurs. Les voies riches en GC ont tendance à former des répétitions inversées, ou des structures en épingle à cheveux, qui peuvent ne pas fondre pendant l'étape de recuit de la PCR. Par conséquent, l'amplification des matrices riches en GC est entravée par une séparation inefficace des deux brins d'ADN. Il en résulte des amplicons tronqués en raison de la fin prématurée de l'extension de la polymérase.

Quels sont les facteurs critiques pour l'amplification des matrices riches en GC ?

Conditions PCR

  • Utilisez des températures de dénaturation plus élevées (par exemple, 98°C par opposition à 94°C ou 95°C) pour permettre une dénaturation complète de la matrice.
  • Gardez les temps de recuit pour les modèles riches en GC aussi courts que possible.
  • Utilisez des amorces avec un T plus élevém (>68°C), car le recuit peut se produire à une température plus élevée.

PCR polymérases

Utilisez une polymérase optimisée pour l'amplification de séquences riches en GC. Pour trouver une enzyme, consultez notre guide de sélection.

Le DMSO peut-il être ajouté pour améliorer l'amplification des modèles riches en GC ?

Des clients nous ont dit qu'une amplification améliorée des matrices riches en GC avait été obtenue en ajoutant du DMSO aux réactions en utilisant PrimeSTAR MAX DNA Polymerase ou CloneAmp HiFi PCR Premix. La concentration recommandée de DMSO est comprise entre 2,5% et 5%.

Comment puis-je optimiser les conditions PCR pour les modèles riches en AT ?

Certains modèles peuvent avoir de longs tronçons riches en AT qui sont difficiles à amplifier dans des conditions de réaction standard. Les Plasmodium falciparum le génome contient environ 80 % d'AT, et les régions flanquant les gènes sont souvent riches en AT.

Les polymérases recommandées pour les matrices riches en GC, telles que EmeraldAmp GT PCR Master Mix, EmeraldAmp Max PCR master mix et PrimeSTAR GXL DNA Polymerase, conviennent également aux matrices riches en AT.

L'avantage d'avoir des matrices riches en AT est qu'une température d'extension inférieure peut être utilisée. Pour certains modèles avec un contenu AT >80&ndash85%, la température d'extension peut être abaissée de 72°C à 65&ndash60°C. La réplication de l'ADN à cette température réduite semble être fiable (Su et al. 1996).

Les références

Su, X. Z., et al. Températures d'extension réduites requises pour l'amplification par PCR d'ADN extrêmement riche en A+T. Nucl Acides Res. 24, 1574&ndash1575 (1996).

Quel est le rôle du magnésium dans la PCR, et quelle est la concentration optimale ?

Le magnésium est un cofacteur requis pour les ADN polymérases thermostables et est important pour une amplification réussie. Sans Mg 2+ libre adéquat, les polymérases PCR ne sont pas actives. En revanche, un excès de Mg 2+ libre réduit la fidélité enzymatique et peut augmenter l'amplification non spécifique. Un certain nombre de facteurs peuvent affecter la quantité de Mg 2+ libre dans une réaction, notamment la concentration de matrice d'ADN, les agents chélatants dans l'échantillon (par exemple, EDTA ou citrate), la concentration de dNTP et la présence de protéines.

  • Certaines polymérases (par exemple, Takara Ex Taq ADN polymérases et Takara LA Taq ADN polymérases) sont fournis avec un tampon de réaction sans magnésium et un tube séparé de 25 mM de MgCl2. Pour ces enzymes, vous pouvez optimiser la concentration en Mg 2+ pour chaque réaction. et les ADN polymérases Advantage 2 sont des polymérases tolérantes au magnésium qui sont fournies avec des tampons contenant 3,5 mM de MgCl2.
  • La concentration finale de Mg 2+ pour les réactions d'ADN polymérase PrimeSTAR GXL et d'ADN polymérase PrimeSTAR MAX est de 1 mM. Cette concentration augmente la fidélité de ces enzymes.

Quel est le rôle du sel dans les réactions PCR ?

Une PCR réussie nécessite que le duplex d'ADN se sépare pendant l'étape de dénaturation et que les amorces s'hybrident à l'ADN dénaturé. Le sel neutralise les charges négatives sur le squelette phosphate de l'ADN, stabilisant l'ADN double brin en compensant les charges négatives qui se repousseraient autrement. Le chlorure de potassium (KCl) est normalement utilisé dans les amplifications PCR à une concentration finale de 50 mM. Pour améliorer l'amplification des fragments d'ADN, en particulier des fragments entre 100 et 1 000 pb, une concentration en KCl de 70&ndash100 mM est recommandée. Pour l'amplification de produits plus longs, une concentration en sel plus faible semble être plus efficace, tandis que l'amplification de produits plus courts se produit de manière optimale avec des concentrations en sel plus élevées. Cet effet est probablement dû au fait qu'une concentration élevée en sel permet de préférence la dénaturation des molécules d'ADN courtes par rapport aux molécules d'ADN longues.

Il est important de noter qu'une concentration en sel supérieure à 50 mM peut inhiber Taq polymérases.

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Dépannage de votre PCR

Que faire lorsque votre PCR tourne mal ? Les FAQ ci-dessous peuvent vous mettre sur la voie d'une PCR réussie.

Pour obtenir des conseils sur la façon de sauver vos expériences de la contamination par PCR, consultez cet article de blog.

Si aucun produit d'amplification n'est obtenu, quels paramètres doivent être considérés en premier lieu lors du dépannage ?

Considérer ce qui suit:

  • Tout d'abord, assurez-vous que tous les composants PCR ont été inclus dans les réactions. Un contrôle positif doit toujours être inclus pour s'assurer que chaque composant est présent et fonctionnel.
  • S'il n'y a eu aucun problème avec la configuration expérimentale, augmentez le nombre de cycles de PCR (3&ndash5 cycles à la fois), jusqu'à 40 cycles. L'augmentation du nombre de cycles peut résoudre les problèmes liés à un modèle en faible abondance ou à l'inaccessibilité du modèle en raison d'impuretés ou d'une faible efficacité d'amorçage des amorces.
  • Si l'augmentation du nombre de cycles n'améliore pas les résultats, les conditions de PCR peuvent être trop strictes pour l'ensemble d'amorces ou le modèle particulier. Envisagez de modifier les conditions PCR comme suit :
    • Abaissez la température de recuit par incréments de 2 degrés.
    • Augmentez le temps de prolongation.
    • Augmentez le montant du modèle. Reportez-vous aux directives fournies avec l'enzyme pour déterminer la quantité optimale de matrice.

    Considérez ces raisons supplémentaires possibles pour l'échec de la PCR :

    • Inhibiteurs de PCR dans l'échantillon de modèle
      Si des inhibiteurs de PCR sont présents, l'utilisation d'une matrice diluée peut augmenter l'efficacité de la PCR. Alternativement, le modèle peut avoir besoin d'être purifié à l'aide d'un kit tel que le kit NucleoSpin Gel et PCR Clean-up. Si la purification de la matrice n'est pas possible, une enzyme qui a une tolérance plus élevée aux impuretés, telle que la polymérase Terra PCR Direct, peut améliorer les résultats.
    • Le modèle a >65% de contenu GC
      Lors de l'amplification à partir de modèles à haute teneur en GC, utilisez une enzyme formulée pour cette condition. Consultez notre guide de sélection PCR pour trouver une enzyme appropriée.
    • Les amorces ne sont pas optimales
      Vérifiez soigneusement vos amorces, redessinez-les si nécessaire. Envisagez également de réamplifier le produit PCR primaire en utilisant des dilutions de 10 fois (1:100 à 1:10 000) à l'aide d'amorces imbriquées.

    Lors de l'utilisation de l'ADN polymérase PrimeSTAR HS, tenez compte de :

    • En utilisant une quantité appropriée de modèle. Si la matrice est de l'ADN génomique humain ou une banque d'ADNc, n'utilisez pas plus de

    Lorsque vous utilisez PrimeSTAR Max DNA Polymerase, tenez compte de :

    • Ajustement du temps d'extension si le mélange réactionnel contient un excès de matrice. Si la quantité de modèle dépasse 200 ng dans un mélange réactionnel de 50 et microlitres, réglez le temps d'extension entre 30 sec/kb et 1 min/kb.
    • Augmenter la concentration des amorces.

    Lorsque vous utilisez l'ADN polymérase SpeedSTAR HS, tenez compte des éléments suivants :

    • Augmenter le temps de prolongation. Bien que le temps d'extension standard soit de 10 sec/kb, le temps d'extension peut être augmenté jusqu'à

    S'il existe des bandes d'amplification non spécifiques, que peut-on faire pour améliorer la spécificité ?

    Toutes les polymérases Takara Bio PCR

    Problème:

    Solution:

    Utilisez l'alignement BLAST pour déterminer si les extrémités 3' des amorces sont complémentaires de sites autres que le ou les sites cibles. Reconcevoir les amorces si nécessaire ou modifier les conditions de PCR.

    Problème:

    Les conditions de PCR ne sont pas suffisamment strictes.

    Solutions:

    • Augmentez la température de recuit par incréments de 2 degrés.
    • Utilisez la PCR de toucher des roues.
    • Utilisez un protocole PCR en deux étapes.
    • Réduisez le nombre de cycles PCR.

    Problème:

    Trop de modèle a été utilisé.

    Solution:

    Réduisez la quantité de 2&ndash5 fois.

    ADN polymérases PrimeSTAR HS et PrimeSTAR Max

    Problème:

    Le temps de recuit est trop long.

    Solution:

    Pour obtenir une amplification spécifique, il est essentiel d'utiliser un temps de recuit court (5 & ndash15 sec) lors de l'exécution de la PCR en trois étapes.

    ADN polymérases PrimeSTAR GXL

    Problème:

    Les amorces ont un T sous-optimalm valeurs.

    Solution:

    Pour amplifier les cibles <1 kb, concevez des amorces avec Tm valeurs >55°C, et utilisez une température de recuit de 60°C. Si l'amorce Tm les valeurs sont <55°C, essayez un temps d'extension plus court entre 5 et 10 sec/kb.

    Takara Ex Taq et Takara LA Taq ADN polymérases

    Problème:

    Recuit d'amorce non spécifique à basse température.

    Solution:

    Les versions à démarrage à chaud de ces enzymes peuvent améliorer les résultats de certaines amorces.

    ADN polymérase SpeedSTAR HS

    Problème:

    Frottis des bandes de produit PCR sur un gel.

    Solution:

    Des temps d'extension excessivement longs peuvent entraîner des bavures. La recommandation générale pour le temps d'extension pour cette enzyme est de 10&ndash20 sec/kb. Si le rendement de la PCR est faible, essayez d'augmenter le nombre de cycles de 5.

    Si la PCR génère un frottis après avoir passé les produits sur un gel, que peut-on faire pour améliorer les résultats ?

    Tout d'abord, déterminez la source du frottis à l'aide de contrôles positifs et négatifs (pas de modèle). Cela peut déterminer si la cause du frottis est une contamination ou un surcyclage, ou si le frottis résulte d'amorces mal conçues ou de conditions PCR sous-optimales.

    Si le contrôle négatif est vierge, il n'y a pas de contamination. Au lieu de cela, les conditions PCR devront être optimisées, tenez compte des éléments suivants lors de l'ajustement des conditions PCR :

    • Réduisez la quantité de modèle.
    • Augmenter la température de recuit.
    • Utilisez la PCR de toucher des roues.
    • Réduisez le nombre de cycles PCR.
    • Redessiner les amorces.
    • Utilisez des amorces imbriquées.
    • Réamplifiez le produit. (Un petit bouchon du gel peut être retiré avec une pointe de micropipette, et l'ADN peut être récupéré en ajoutant le bouchon à 200 µl d'eau, puis en incubant à 37°C. 5 µl de cette solution peuvent être utilisés comme modèle PCR pour re- amplification.)

    Si le contrôle négatif est également étalé, il y a contamination. Vous devrez déterminer la source de cette contamination. Il peut être nécessaire de remplacer les réactifs PCR et de décontaminer les pipettes et votre poste de travail (voir les questions ci-dessous pour plus d'informations sur la contamination).

    Quelles sont les sources de contamination par PCR ?

    Il existe quatre sources principales de contamination par PCR :

    1. La source de contamination la plus courante est le produit de PCR provenant d'amplifications précédentes (appelée « contamination par transfert »). Lorsque de grandes quantités de produit PCR (10 à 12 molécules) sont générées à plusieurs reprises sur une période de temps, le potentiel de contamination augmente.
    2. Une autre source de contamination est l'ADN cloné préalablement manipulé en laboratoire.
    3. Une contamination d'échantillon à échantillon peut également se produire. Cette source de contamination est plus susceptible de se trouver dans les échantillons qui nécessitent un traitement approfondi avant l'amplification.
    4. Les réactions peuvent également être contaminées par de l'ADN exogène dans l'environnement, y compris l'ADN présent sur l'équipement de laboratoire et dans les réactifs utilisés pour l'extraction d'ADN et la PCR.

    Comment éviter la contamination ?

    La sensibilité de la PCR exige que les échantillons ne soient pas contaminés par de l'ADN exogène ou des produits préalablement amplifiés provenant de l'environnement du laboratoire. Nous recommandons que des zones distinctes soient utilisées pour la préparation des échantillons, la configuration PCR et l'analyse post-PCR.

    Une hotte à flux laminaire équipée d'une lampe UV est recommandée pour la préparation des mélanges réactionnels. Deux stations devraient être établies qui sont physiquement séparées l'une de l'autre.

    • Établissez une "zone pré-PCR" réservée à la configuration de la réaction PCR. Aucun élément de la « zone post-PCR » ne doit être introduit dans cette zone, ce qui inclut des éléments tels que des cahiers et des stylos.
    • Établissez une "zone post-PCR" qui est utilisée pour la PCR, la purification de l'ADN amplifié par PCR, la mesure de la concentration d'ADN, l'exécution de gels d'agarose et l'analyse des produits PCR.

    L'équipement doit également être limité à ces zones. La machine PCR et l'appareil d'électrophorèse doivent être situés dans la zone post-PCR. Il est fortement recommandé d'avoir des pipettes et des pointes de pipette avec des filtres aérosols dédiées à la préparation d'échantillons d'ADN et de mélanges réactionnels uniquement. Les recommandations supplémentaires incluent :

    • Disposer d'ensembles séparés de pipettes et d'embouts de pipettes, de blouses de laboratoire, de boîtes à gants et de corbeilles à déchets pour les zones pré-PCR et post-PCR.
    • Étiquetage des articles pré- et post-PCR, afin qu'ils ne soient pas retirés de leur zone de travail désignée.
    • Suivre la règle d'or de la PCR : NE JAMAIS ramener de réactifs, d'équipements ou de pipettes utilisés dans une zone post-PCR dans la zone pré-PCR.
    • Préparer et stocker séparément les réactifs pour la PCR et les utiliser uniquement aux fins prévues. Les réactifs doivent être aliquotés en petites portions et stockés dans des zones désignées selon qu'ils sont utilisés pour des applications pré-PCR ou post-PCR. Les aliquotes doivent être conservées séparément des autres échantillons d'ADN.

    Une réaction de contrôle qui omet l'ADN matrice doit toujours être effectuée pour confirmer l'absence de contamination. De plus, le nombre de cycles de PCR doit être réduit au minimum, car les tests très sensibles sont plus sujets aux effets de la contamination.

    Comment puis-je décontaminer si j'ai une contamination PCR ?

    1. Laissez les pipettes sous la lumière UV dans la hotte de culture cellulaire pendant la nuit. L'irradiation UV favorise la réticulation des résidus de thymidine, endommageant l'ADN résiduel.
    2. Vaporisez les postes de travail/équipements/pipettes avec de l'eau de Javel à 10 %, puis essuyez.
    3. Changer de poste de travail déplacez la zone pré-PCR vers un autre emplacement pré-nettoyé.
    4. N'utilisez pas d'instruments ou de pipettes que vous avez déjà utilisés.

    Que puis-je faire si la PCR génère des erreurs ?

    Pour éviter les erreurs lors de la PCR, nous vous recommandons d'utiliser une enzyme haute fidélité (voir guide de sélection). De plus, veillez à éviter les éléments suivants :

    1. Surcyclage
      Surcyclage des réactions PCR souvent :
      • Modifie le pH de la réaction d'une manière qui déstabilise l'ADN.
      • Augmente la quantité de produit PCR, réduisant ainsi l'efficacité de la polymérase et favorisant les erreurs.
      • Diminue la quantité de dNTP, augmentant ainsi la probabilité d'une mauvaise incorporation de la base en raison de la concentration de dNTP déséquilibrée.(Si vous utilisez les enzymes PCR de Takara Bio, la concentration de dNTP est optimisée à 200 nM, l'augmentation de la concentration de dNTP entraîne une mauvaise incorporation.)
      • Provoque l'accumulation d'ADN simple brin et double brin.
    2. Concentration élevée en Mg 2+
      La concentration de Mg 2+ varie de 1 à 5 mM. L'utilisation d'une concentration élevée en Mg 2+ peut augmenter le rendement, mais peut également avoir un impact sur l'activité de relecture des enzymes. Cependant, la concentration en Mg 2+ doit toujours être supérieure à la concentration en dNTP.
    3. Dommages à l'ADN modèle
      Limitez le temps d'exposition aux UV lors de l'analyse ou de l'excision des produits PCR des gels.

    Que sont les inhibiteurs de PCR ?

    Les impuretés qui interfèrent avec l'amplification par PCR sont appelées inhibiteurs de PCR. Les inhibiteurs de la PCR sont présents dans une grande variété de types d'échantillons et peuvent entraîner une diminution de la sensibilité de la PCR ou même des résultats PCR faussement négatifs. Les inhibiteurs de PCR peuvent avoir des origines inorganiques et organiques (Schrader 2012).

    Les inhibiteurs de PCR inorganiques comprennent :

    • Calcium ou autres ions métalliques qui concurrencent le magnésium
    • EDTA qui se lie au magnésium, réduisant sa concentration

    Certains inhibiteurs de PCR organiques comprennent :

    • Polysaccharides et glycolipides qui imitent la structure des acides nucléiques, interférant avec les amorces se liant à la matrice
    • Mélanine et collagène qui forment un complexe réversible avec l'ADN polymérase
    • Acides humiques qui interagissent avec l'ADN matrice et la polymérase, empêchant la réaction enzymatique, même à de faibles concentrations
    • Urée pouvant conduire à la dégradation de la polymérase

    D'autres composés organiques qui peuvent inhiber la PCR comprennent :

    • Hémoglobine, lactoferrine et IgG dans les échantillons de sang, de sérum ou de plasma
    • Anticoagulants tels que l'héparine
    • Polyphénols, pectine et xylane de plantes
    • Éthanol, alcool isopropylique, phénol ou détergents tels que SDS

    Si des inhibiteurs sont présents dans la préparation de matrice, une dilution de 100 fois de la matrice de départ peut suffisamment diluer l'inhibiteur et permettre l'amplification. Alternativement, la précipitation à l'éthanol de la matrice peut être nécessaire pour résoudre le problème.

    Les références

    Schrader, C., et al. Inhibiteurs de PCR et occurrence, propriétés et élimination. J Appl Microbiol. 113:1014&ndash1026 (2012).

    Qu'est-ce que le surcyclage PCR ? Comment savoir si mon produit est surcyclé ?

    Le surcyclage PCR se produit lorsque le cycle dépasse la phase exponentielle d'amplification. Le surcyclage se produit lorsque les événements suivants se produisent pendant la PCR :

    • Épuisement des substrats (dNTP ou amorces).
    • Les réactifs (dNTP ou enzymes) ne sont plus stables à la température de dénaturation.
    • La PCR polymérase est inhibée par le produit (pyrophosphate, ADN duplex).
    • Compétition pour les réactifs (dNTP et amorces) par des produits non spécifiques.
    • Abaissement du pH de la réaction.
    • Dénaturation incomplète/séparation des brins des produits à des concentrations élevées de produits.

    L'indicateur de surcyclage PCR est un frottis de fond intense avec des bandes indiscernables lorsque la réaction est résolue sur un gel d'agarose. Il est toujours recommandé d'effectuer un test préliminaire pour déterminer le nombre minimal de cycles PCR nécessaires pour obtenir un produit suffisant. Le produit PCR reste dans la phase linéaire d'amplification si le rendement en produit est sensiblement augmenté tous les 3&ndash5 cycles. On trouve que surcyclé L'ADNc ne produit pas de modèle approprié pour une application en aval.

    Quels types de mutations peuvent être causés par la PCR ?

    Les polymérases PCR peuvent introduire différents types de mutations, y compris des substitutions, des délétions et des insertions à base unique. Les substitutions de bases sont généralement causées par une mauvaise incorporation d'un dNTP incorrect lors de la synthèse d'ADN.

    Les polymérases peuvent générer des mutations à des emplacements où un ou plusieurs nucléotides sont perdus ou gagnés. La fréquence de ce type de mutation peut dépendre de la séquence et peut être plus élevée dans les séquences hautement répétitives. La mutation la plus courante est la perte d'un seul nucléotide, qui pourrait être le résultat d'un désalignement matrice-amorce au sein d'une séquence homopolymère répétitive. Des réarrangements d'ADN peuvent également se produire lorsque la polymérase termine la synthèse sur un brin d'ADN et continue la synthèse après que l'amorçage se soit produit sur un brin complémentaire (c'est-à-dire, une PCR à commutation de brin ou à saut). Ce type de mutation a lieu lorsqu'il existe une forte homologie entre différentes régions de l'ADN. Une matrice d'ADN excessive dans la réaction peut également favoriser ce type de mutation.

    Quels facteurs contribuent aux mutations introduites par PCR ?

    Les facteurs suivants peuvent contribuer aux mutations introduites par PCR :

    • Concentrations de dNTP déséquilibrées
      Des quantités inégales des quatre dNTP peuvent augmenter la substitution de base jusqu'à huit fois. L'utilisation de concentrations égales des quatre dNTP est essentielle pour réduire le taux d'erreur de la polymérase.
    • Concentration élevée en enzymes
    • Longs temps d'incubation
    • Absence d'activité exonucléase 3'&rarr5'
    • Concentration de magnésium
      La fidélité est maximale lorsque la concentration de Mg 2+ est équimolaire à la concentration totale des dNTP. La fidélité diminue lorsque la concentration de cations divalents libres augmente.
    • pH de la réaction
      L'abaissement du pH de la réaction de trois unités peut augmenter les substitutions de bases jusqu'à 60 fois. Un pH bas (<6.0) peut entraîner une perte spontanée de purine.
    • Dommages à l'ADN
      Des dommages à l'ADN peuvent se produire à des températures élevées, augmentant éventuellement le taux de mutation. Une mutation fréquente est la désamination de la cytosine pour produire de l'uracile.
    • La présence d'étirements A dans les séquences d'amorces
    • Surcyclage
      Le taux d'erreur est augmenté lorsque la concentration d'ADN est augmentée pendant les cycles de PCR finaux. Le nombre total de cycles doit être réduit au minimum pour produire le produit PCR souhaité sans erreurs.

    Que sont les artefacts PCR ?

    Les artefacts PCR courants sont les suivants :

    • Dimères d'amorces
      Les dimères d'amorces sont formés par auto-complémentarité à l'extrémité 3' des amorces d'amplification. Les dimères d'amorces sont suspectés si le produit est produit dans une réaction sans matrice (témoin négatif). Pour éviter les dimères d'amorces, les amorces ne devraient pas avoir de complémentarité à leurs extrémités 3'.
    • Produits PCR chimériques
      Les produits de PCR chimériques peuvent être causés par un modèle incomplètement étendu. En d'autres termes, une matrice simple brin qui n'a pas été complètement répliquée en raison d'une terminaison prématurée de la polymérase peut s'hybrider à une matrice partiellement homologue. Cela crée des produits PCR chimériques. Pour minimiser les chimères, utilisez le moins de cycles d'amplification PCR possible.
    • Biais PCR
      Le biais de PCR se produit lorsque certaines séquences sont amplifiées plus efficacement que d'autres en raison de la liaison préférentielle par les amorces de PCR. Si une séquence est amplifiée 10 % de plus qu'une autre dans un cycle, elle sera 17,4 fois plus abondante après 30 cycles. Pour réduire le biais de PCR, utilisez un taux de rampe élevé entre les étapes de dénaturation et de recuit et utilisez des températures de recuit basses. Les longues périodes d'extension (>180 sec) doivent être évitées.
    • dérive de la PCR
      La dérive de la PCR est due à la fluctuation stochastique des interactions des réactifs PCR, en particulier dans les premiers cycles lorsqu'une très faible concentration de matrice existe. Cet artefact est observé dans les dosages multiplex, où une perte de sensibilité est causée par les interactions entre différents ensembles d'amorces. Il est important de concevoir soigneusement des amorces pour ces types d'essais.
    • La PCR génère des produits de poids moléculaire élevé qui migrent à peine à travers le gel d'agarose
      Il n'y a pas de bonne explication pour cet artefact. La plupart des chercheurs supposent que cela est dû au surcyclage, car dans les derniers stades de la PCR, les molécules simple et double brin s'accumulent. L'accumulation de telles molécules simple brin peut créer des hétéroduplex en compétition avec les amorces. Une dénaturation incomplète dans les étapes ultérieures, lorsqu'il y a une forte concentration de produits PCR, empêche la séparation des brins d'ADN, et ainsi un amplicon nouvellement formé peut rester lié à la matrice précédemment faite. Ce processus pourrait se répéter, piégeant les produits PCR dans un réseau de molécules.

    Une autre explication de l'origine des frottis de poids moléculaire élevé est l'extension partielle des matrices au cours des cycles de PCR initiaux. Des extensions partielles pourraient être générées en sautant des artefacts lorsqu'une amorce ou un ADN simple brin s'hybride et s'étend à partir d'un site d'amorçage, puis s'hybride partiellement à un segment homologue ailleurs (voir Produits de PCR chimérique, ci-dessus). Les molécules partiellement étendues peuvent agir comme de nouvelles amorces, car elles contiennent un 3'-OH libre, et pourraient générer des molécules chimériques qui combinent le site d'amorçage initial et le site de "saut".

    Enfin, ce type d'artefact peut également être généré lorsqu'un modèle brut est utilisé pour la PCR. Les produits amplifiés directement à partir de tissus animaux ou végétaux peuvent se retrouver piégés dans les débris cellulaires, ce qui les empêche de migrer dans le gel. Ce problème peut être résolu par digestion à la protéinase K du produit de PCR amplifié :

    • Avant de charger vos échantillons sur un gel, ajoutez 1 µl du tampon de chargement contenant de la protéinase K à 4 µl de la réaction PCR.

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    Quel serait l'effet d'un excès de taq polymérase sur la PCR ? - La biologie

    L'article aborde de nombreuses questions liées aux réactifs utilisés dans les réactions PCR, y compris les taux d'erreur des ADN polymérases et les résultats d'enquêtes basés sur des articles formels. Un protocole PCR typique et quelques questions fréquemment posées sont également inclus.

    Veuillez consulter Current PCR Methods pour une discussion sur diverses méthodes PCR Machines PCR pour une enquête sur les machines PCR basée sur la littérature et les programmes logiciels en recherche biomédicale pour une discussion et les résultats de l'enquête sur les logiciels de biologie moléculaire, y compris ceux pour la conception d'amorces PCR.

    De multiples polymérases PCR sont disponibles auprès de fournisseurs commerciaux. Les polymérases proviennent de sources différentes et avec des degrés variables de fidélité de réplication et avec des vitesses d'extension différentes. Le tableau 1 répertorie les principales polymérases PCR et certaines de leurs caractéristiques importantes. La Taq polymérase a été initialement purifiée à partir de T. aquaticus cellules, et plus tard, le gène a été cloné et exprimé dans des cellules d'E. coli. La polymérase Taq recombinante, nommée AmpliTaq ADN polymérase, était couramment utilisée [2]. La Taq polymérase peut être chimiquement inactivée à basse température, et cette modification peut être inversée à haute température. Cette modification réversible dépendant de la température de la protéine Taq, AmpliTaq Gold, présente dans des mélanges tels que le Thermo Power SYBR™ Green PCR Master Mix, peut être utilisé comme enzyme PCR de démarrage à chaud [2]. L'ADN polymérase Phusion fusionne l'ADN polymérase Pfu avec la protéine de liaison à l'ADN, Sso7d, de S. solfataricus [3] pour augmenter ses performances de processivité tout en conservant la haute fidélité de la polymérase Pfu [2]. Des ADN polymérases spécialisées ont également été conçues [4].

    Labome organise systématiquement des informations sur les réactifs, les instruments et les logiciels à partir d'articles officiels sélectionnés au hasard. Le tableau 2 répertorie les polymérases PCR les plus fréquemment citées et leurs principaux fournisseurs à partir d'une enquête d'articles officiels citant les ADN polymérases pour la PCR. Par exemple, Liu Y et al ont mesuré les niveaux d'ARN de plusieurs gènes de macrophages péritonéaux de souris en qPCR avec SYBR Green Realtime PCR Master Mix de TOYOBO (QPK-201) par QuantStudio 7 Flex de Thermo Fisher Scientific après extraction d'ARN total avec le réactif TRIzol et inverse transcription à l'aide de ReverTra Ace qPCR RT Master Mix avec gDNA Remover de TOYOBO (FSQ301) [15]. Chopra S et al ont utilisé PerfeCTa SYBR green fastmix de Quantabio et TaqMan Universal PCR master mix de Thermo Fisher pour la RT-PCR quantitative [16]. Flaherty SE et al ont évalué l'expression de plusieurs gènes dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse par PCR quantitative en utilisant QIAGEN PCR SYBR Green I QuantiTect Master Mix [21].

    Les taux d'erreur des ADN polymérases dépendent des conditions de PCR. Par exemple, lorsque le pH de la réaction est passé de 8 à 9, le taux d'erreur de Pfu a diminué de ∼2 fois, et le taux d'erreur de Pfu exo-déficient a augmenté de ∼9 fois [36]. Le Dr Peter McInerney et ses collègues ont comparé six ADN polymérases couramment utilisées dans les applications de PCR dans des tampons recommandés par les fournisseurs en 2014 [1]. La figure 1 répertorie les tableaux de leur article, indiquant que Pfu (Agilent), Phusion (Finnzymes) et Pwo (Roche) ont produit 10 fois moins d'erreurs que la polymérase Taq régulière et que la plupart des erreurs sont des mutations de transition. Q5 La polymérase haute fidélité de NEB, basée sur une nouvelle ADN polymérase, semble être l'une des polymérases populaires à faible taux d'erreur [37, 38]. Selon son fournisseur, NEB, il a un taux d'erreur

    280 fois inférieur à celui de la Taq ADN polymérase. Boettcher S et al ont utilisé l'ADN polymérase haute fidélité Q5 pour le New England Biolab (M0491L) pour le criblage TP53 MITE-seq [39]. de Goffau MC et al visaient à détecter de manière exhaustive le gène de l'ARNr 16S bactérien à partir de tissus placentaires humains avec la même polymérase Q5 [40]. D Cervettini et al l'ont également utilisé pour leurs travaux sur l'évolution de nouvelles paires aminoacyl-ARNt synthétase-ARNt [41]. L'ADN polymérase Invitrogen Platinum SuperFi avec une fidélité 100 fois supérieure à celle de la Taq native, a été utilisée dans la PCR à haute rigueur d'hybridation pour détecter les mutations somatiques du gène APP dans la maladie d'Alzheimer et les neurones normaux [22]. Lee J et al ont utilisé l'ADN polymérase PrimeSTAR GXL de Clontech pour détecter toute mutation hors cible dans l'édition génomique LMNA induite par TALEN [42].

    Les réactions PCR peuvent être réalisées directement sur des échantillons biologiques sans aucune purification préalable des molécules d'ADN. Le Dr Miura et ses collègues ont comparé six ADN polymérases directes de type PCR (KOD FX, Mighty Amp, Hemo KlenTaq, Phusion Blood II, KAPA Blood et BIOTAQ) dans du sang séché élué d'un papier filtre avec un tampon TE et ont conclu que KOD FX était le meilleur pour la PCR directe à base de sang en raison de sa résistance à l'inhibition des composants sanguins et aux détergents doux [43].

    Modèles d'ADN, amorces, ddH2O, ADN polymérase de fournisseurs commerciaux avec des tampons de réaction spécifiques, dNTP, MgSO4 (facultatif) et DMSO (facultatif).


    Matériaux et méthodes

    Des solutions mères métalliques (40 mM) des métaux suivants ont été préparées dans l'eau : sulfate de cuivre (II) (sulfate de cuivre (II), puriss. pa, anhydre 99%, Sigma-Aldrich), sulfate de fer (II) (sulfate ferreux, séché, VWR), sulfate d'aluminium (sulfate d'aluminium hexadécahydraté, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical), sulfate de nickel(II) (sulfate de nickel(II) hexahydraté, 99%, pour analyse, ACROS Organics™, Thermo Fisher Scientific), fer Chlorure (III) (chlorure de fer(III) hexahydraté, 99+%, pour analyse, ACROS Organics™, Thermo Fisher Scientific), nitrate de plomb(II) (nitrate de plomb(II), 99+%, technique, Fisher Chemical), chlorure d'étain(II) (chlorure d'étain(II), 98%, anhydre, ACROS Organics™, Thermo Fisher Scientific), chlorure de zinc (qualité réactif au chlorure de zinc, ≥ 98%, Sigma-Aldrich) et chlorure de calcium (chlorure de calcium, 96 %, extra pur, poudre, anhydre, ACROS Organics™, Thermo Fisher Scientific).

    Électrophorèse sur gel d'agarose

    L'analyse de l'ADN par électrophorèse sur gel d'agarose a été réalisée sur des gels d'agarose à 1 % p/v (qualité de biologie moléculaire Thermo Fisher Scientific) contenant du tampon TAE (40 mM Tris Base, 20 mM d'acide acétique, 1 mM d'EDTA pH 8,3) et 1 x Sybr Safe Gel Stain (Thermo Fisher Scientific) ajouté par le fabricant 10 000 × stock tel que fourni. Les gels ont été immergés dans du tampon TAE à une tension constante de 120 V pendant 35 à 40 min. Les bandes d'ADN ont été photographiées sous lumière bleue à l'aide d'un système de caméra Fujifilm LAS3000. La limite de détection pour ce système est de 250 pg d'ADN par bande.

    Chaque échantillon de test contenait de l'ADN génomique de contrôle TaqMan™ (Thermo Fisher Scientific) aux concentrations indiquées, comme indiqué dans les résultats. Toutes les réactions ont été effectuées avec Applied Biosystems™ PowerUp™ SYBR™ Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific) dans un volume de réaction total de 10 L. La paire d'amorces utilisée pour l'amplification était 5'-AAAGGGCCCTGACAACTCTTT-3', GAPDH sens et 5'-TCAGTCTGAGGAGAACATACCA-3' antisens avec une taille de produit attendue de 400 pb (Eurofins Scientific). La concentration de chaque amorce dans le volume total de l'échantillon était telle que recommandée par le fabricant de l'enzyme. La réaction contenait également des ions métalliques aux concentrations indiquées dans les résultats expérimentaux.

    Toutes les analyses d'échantillons ont été effectuées sur un système PCR en temps réel StepOnePlus™ (Applied Biosystems) selon le mode de cycle suivant : un cycle initial à 50 °C pendant 2 min, un cycle à 95 °C pendant 2 min, suivi de 40 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 15 s, hybridation à 60 °C pendant 15 s et extension à 72 °C pendant 1 min.

    Effet des ions métalliques sur diverses ADN polymérases

    Les polymérases testées comprenaient la KOD polymérase du kit KOD Hot Start DNA Polymerase (Merck KGaA), Taq polymérase de MyTaq™ Red Mix (Bioline) et Q5 DNA polymérase de Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs). Toutes les réactions ont été réalisées selon les protocoles recommandés par le fabricant. Les amorces utilisées pour l'amplification étaient les amorces GAPDH telles que décrites ci-dessus. La concentration finale des amorces pour chaque polymérase a été ajustée selon les recommandations du fabricant comme suit : 0,3 M pour les réactions de polymérase KOD, 0,5 M pour la polymérase Q5, 0,3 M pour la polymérase Taq. Chaque échantillon contenait 1 ng d'ADN matrice (TaqMan™ Control Genomic Human DNA, Thermo Fisher Scientific). L'amplification par PCR a été réalisée dans un thermocycleur à 96 puits Veriti™ (Applied Biosystems®) dans les conditions de cycle suivantes : (a) pour la polymérase Q5 : un cycle initial à 98 °C pendant 30 s, 30 cycles à 98 °C pendant 10 s, à 63 °C pendant 30 s et à 72 °C pendant 30 s, suivi d'un cycle final à 72 °C pendant 30 s (b) pour la KOD polymérase : un cycle initial à 95 °C pendant 2 min, 30 cycles à 95 °C pendant 20 s, à 63 °C pendant 30 s et à 72 °C pendant 30 s (c) pour la Taq polymérase : cycle initial à 95 °C pendant 1 min, 30 cycles à 95 °C pendant 15 s, à 63 °C pendant 15 s et à 72 °C pendant 10 s. Les résultats de l'amplification ont été visualisés sur gel d'agarose 1%.

    Éliminer l'inhibition du calcium

    Des échantillons contenant cinq concentrations différentes de chlorure de calcium (1 à 5 mM) ont été traités avec de l'EGTA (acide éthylène glycol-bis(2-aminoéthyléther)-N,N,N′,N′-tétraacétique, Sigma-Aldrich) à une concentration finale égale à celle du chlorure de calcium ajouté. Les échantillons ont été amplifiés à l'aide d'ADN polymérase KOD Hot Start ou amplifiés dans un mélange réactionnel qPCR à l'aide d'Applied Biosystems™ PowerUp™ SYBR™ Green Master Mix. Les amorces et les conditions de cyclage étaient telles que décrites ci-dessus pour les échantillons de polymérase KOD. L'ADN humain génomique de contrôle TaqMan™ a été utilisé comme matrice à 1 ng pour la PCR standard ou à 5 ng d'ADN pour la qPCR. Les produits d'amplification ont été visualisés par électrophorèse sur gel d'agarose 1% ou analysés respectivement par le logiciel StepOne.


    Commentaire

    Informations d'arrière-plan

    La base théorique de la réaction en chaîne par polymérase (PCR voir introduction du chapitre) a probablement été décrite pour la première fois dans un article de Kleppe et al. (1971). Cependant, cette technique n'a suscité l'intérêt général qu'au milieu des années 1980, lorsque Kary Mullis et ses collègues de Cetus ont développé la PCR en une technique pouvant être utilisée pour générer de grandes quantités de gènes à copie unique à partir d'ADN génomique (Saiki et al. , 1985, 1986 Mullis et coll., 1986 Embury et coll., 1987).

    La procédure initiale consistait à ajouter une nouvelle aliquote du fragment de Klenow de E. coli ADN polymérase I au cours de chaque cycle car cette enzyme a été inactivée au cours de l'étape de dénaturation suivante. L'introduction du thermostable Taq ADN polymérase de Thermus aquatique (Saiki et al., 1988) ont atténué cet ennui et facilité l'automatisation de la partie cyclage thermique de la procédure. Taq L'ADN polymérase a également permis l'utilisation de températures plus élevées pour l'hybridation et l'extension, ce qui a amélioré la stringence de l'hybridation amorce-matrice et donc la spécificité des produits. Cela a également servi à augmenter le rendement du produit souhaité.

    Toutes les applications de la PCR dépendent d'une PCR optimisée. Le dans cette unité optimise la PCR pour plusieurs variables, y compris MgCl2 concentration, améliorant les additifs - diméthylsulfoxyde (DMSO), glycérol ou Perfect Match Polymerase Enchaner (PMPE) - et prévention des erreurs d'amorçage pré-PCR. Ces paramètres et d'autres peuvent être extrêmement importants, car chaque élément de la PCR peut affecter le résultat (voir 2.2 pour la discussion des paramètres individuels).

    Il existe plusieurs kits d'optimisation PCR et activateurs propriétaires sur le marché (tableau 3). Les kits d'optimisation fournissent généralement un panel de tampons dans lesquels le pH, le tampon, les détergents non ioniques et l'ajout de (NH4)2DONC4 sont variés, MgCl2 peuvent être ajoutés à plusieurs concentrations, et des activateurs (par exemple, DMSO, glycérol, formamide, bétaïne et/ou composés exclusifs) peuvent être choisis. Le protocole présenté ici vise à maintenir les coûts bas et les options larges.

    Informations techniques en annexe au catalogue

    Boehringer-Mannheim, Invitrogen, Stratagene, Sigma, Epicenter Technologies, Life Technologies

    Plusieurs tampons, Mg 2+ et activateurs qui peuvent inclure DMSO, glycérol, formamide, (NH4)2DONC4, et d'autres agents non spécifiés ou exclusifs

    Amersham Pharmacia Biotech

    Billes Ready-To-Go « optimisées pour la PCR standard » et billes d'analyse RAPD Ready-To-Go (tampon, nucléotides, Taq ADN polymérase)

    EasyStart PCR Mix-in-a-Tube—tubes préemballés avec des billes de cire contenant un tampon, MgCl2, nucléotides, Taq ADN polymérase

    PCR SuperMix—1.1× conc.—prémélange contenant un tampon, MgCl2, nucléotides, TaqADN polymérase

    Advanced Biochemicals Red Hot DNA Polymerase—un nouveau rival pour Taq polymérase avec caractéristiques pratiques

    Tubes de stockage et de réaction Molecular Bio-Products HotStart—la bille de cire pré-adhérée dans chaque tube nécessite l'ajout manuel d'un composant à haute température

    Billes HotWax Mg 2+—les billes de cire contiennent du MgCl préformulé2 qui est libéré à la première étape à température élevée

    Billes de cire de magnésium StrataSphere : billes de cire contenant du Mg 2+ préformulé

    Hot Start/polymérase séparée

    TaqBead Hot Start Polymerase—encapsulation de billes de cire Taq ADN polymérase libérée lors de la première étape à température élevée

    Inactivation à chaud/réversible de la polymérase par liaison d'anticorps

    Anticorps TaqStart, anticorps TthStart—inactivés de manière réversible Taq et Je ADN polymérases jusqu'à première dénaturation à 95°C

    PlatinumTaq—contient l'anticorps PlatinumTaq

    JumpStart Taq : contient l'anticorps TaqStart

    Hot-start/modification chimique réversible

    AmpliTaq Gold—activé à haute température

    Hot-start/modification chimique réversible

    ADN polymérase HotStarTaq—activée à haute température

    Boehringer Mannheim, Laboratoires biologiques de la Nouvelle-Angleterre

    Je pyrophosphatase, thermostable

    GC-Melt (dans les kits Advantage-GC)—propriétaire

    Système d'amplification Taq-FORCE et MIGHTY Buffer — propriétaires

    Kit Eppendorf MasterTaq avec TaqMaster Enhancer—propriétaire

    Système PCRx Enhancer—propriétaire

    E. coli Protéine de liaison simple brin (SSB)

    Perfect Match Polymerase Enhancer—propriétaire

    Additif PCR TaqExtender — propriétaire

    Paramètres critiques et dépannage

    MgCl2 Concentration

    Détermination du MgCl optimal2 la concentration, qui peut varier même pour différentes amorces de la même région d'une matrice donnée (Saiki, 1989), peut avoir une énorme influence sur le succès de la PCR. Dans ce protocole, trois concentrations sont testées - 1,5 mM (L), 3,0 mM (M) et 4,5 mM (H) - contre trois activateurs. Les amplificateurs ont tendance à élargir le MgCl2 plage optimale, contribuant au succès de la PCR à l'une de ces concentrations. Un tampon 10× optimisé pour une enzyme donnée et un flacon séparé de MgCl2 sont généralement fournis avec la polymérase, de sorte que l'utilisateur peut titrer le MgCl2 concentration pour leur ensemble unique d'amorces-gabarits.

    Pureté du réactif

    Pour les applications qui amplifient des modèles rares, la pureté du réactif est le paramètre le plus important, et il est essentiel d'éviter la contamination à chaque étape.

    Pour maintenir la pureté, stockez plusieurs petits volumes de chaque réactif dans des tubes à bouchon à vis.

    Pour de nombreuses applications, il suffit d'utiliser des réactifs de haute qualité et d'éviter la contamination par les nucléases. Cependant, évitez un réactif commun utilisé pour inactiver les nucléases, le diéthylpyrocarbonate (DEPC). Même de minuscules quantités de produits chimiques laissés après le traitement de l'eau par autoclavage suffisent à ruiner une PCR.

    Sélection d'apprêt

    C'est le facteur le moins prévisible et le plus difficile à résoudre. En termes simples, certains amorces ne fonctionnent tout simplement pas. Pour maximiser la probabilité qu'une paire d'amorces donnée fonctionne, faites attention aux paramètres suivants.

    Considérations générales. Un jeu d'amorces optimal doit s'hybrider efficacement à la séquence d'intérêt avec une hybridation négligeable aux autres séquences présentes dans l'échantillon. S'il existe des quantités raisonnables de matrice disponibles, la spécificité d'hybridation peut être testée en effectuant une hybridation d'oligonucléotides comme décrit dans UNITÉ Indisponible. La distance entre les amorces est plutôt flexible, allant jusqu'à 10 kb. Il peut cependant y avoir une baisse considérable de l'efficacité de la synthèse avec des distances >3 kb (Jeffreys et al., 1988). De petites distances entre les amorces, cependant, diminuent la capacité d'obtenir beaucoup d'informations de séquence ou de réamplifier avec des oligonucléotides internes imbriqués, si cela est nécessaire.

    Concevoir des amorces pour permettre la démonstration de la spécificité du produit PCR. Assurez-vous qu'il existe des sites d'endonucléase de restriction diagnostiques entre les amorces ou qu'un oligonucléotide peut détecter le produit PCR spécifiquement par hybridation.

    Plusieurs programmes informatiques peuvent aider à la conception de l'amorce (voir les ressources Internet à la fin de l'unité). Ceux-ci sont les plus utiles pour éviter les ensembles d'amorces avec une complémentarité intra- et intermoléculaire, ce qui peut augmenter considérablement l'efficacité Tm. Compte tenu de l'abondance d'amorces par rapport à la matrice, cela peut empêcher l'amorçage de la matrice. La conception de l'amorce informatique n'est pas infaillible. Si possible, commencez avec une amorce ou un jeu d'amorces connu pour amorcer efficacement les extensions. De plus, les sites Web des fabricants offrent une aide technique pour la conception des amorces.

    Complémentarité au modèle. Pour de nombreuses applications, les amorces sont conçues pour être exactement complémentaires au modèle. Pour d'autres, cependant, tels que l'ingénierie de mutations ou de nouveaux sites d'endonucléases de restriction, ou pour des efforts pour cloner ou détecter des homologues de gènes où l'information sur les séquences fait défaut, des mésappariements de paires de bases seront créés intentionnellement ou inévitablement. Il est préférable d'avoir des mésappariements (par exemple, dans un lieur d'endonucléase de restriction) à l'extrémité 5' de l'amorce. Plus un mésappariement est proche de l'extrémité 3' de l'amorce, plus il est probable qu'il empêche l'extension.

    L'utilisation d'amorces oligonucléotidiques dégénérées pour cloner des gènes là où seule la séquence protéique est disponible, ou pour rechercher des homologues de gènes chez d'autres espèces, a parfois été couronnée de succès, mais elle a également échoué un nombre incalculable (et non publié) de fois. Lorsque la réaction fonctionne, elle peut être extrêmement précieuse, mais elle peut également générer des produits apparemment spécifiques qui nécessitent beaucoup de travail pour être identifiés et ne fournissent aucune information utile. Moins les oligonucléotides sont dégénérés, notamment à l'extrémité 3', mieux c'est. Caveat videur.

    Longueur d'amorce. Une amorce doit avoir une longueur de 20 à 30 bases. Il est peu probable que des amorces plus longues contribuent à augmenter la spécificité de manière significative.

    Séquence d'amorce. Concevez des amorces avec un contenu GC similaire à celui du modèle. Évitez les amorces avec des distributions de séquences inhabituelles, telles que des segments de polypurines ou de polypyrimidines, car leur structure secondaire peut être désastreuse. Il vaut la peine de vérifier la structure secondaire potentielle à l'aide de l'un des programmes informatiques appropriés disponibles.

    « Amorce-dimères ». Les amorces-dimères sont un artefact courant le plus fréquemment observé lorsque de petites quantités de matrice sont soumises à de nombreux cycles d'amplification. Ils se forment lorsque l'extrémité 3' d'une amorce s'hybride à l'extrémité 3' de l'autre amorce, et la polymérase étend ensuite chaque amorce à l'extrémité de l'autre. Le produit résultant peut concurrencer très efficacement le produit PCR d'intérêt. Les amorces-dimères peuvent être évitées au mieux en utilisant des amorces sans complémentarité, notamment à leurs extrémités 3'. S'ils se produisent, l'optimisation du MgCl2 la concentration peut minimiser leur abondance par rapport à celle du produit d'intérêt.

    Modèle

    Outre les méthodes standard de préparation de l'ADN ( UNITÉ Unavailable- Unavailable), un certain nombre de procédures simples et rapides ont été développées pour des tissus particuliers (Higuchi, 1989). Même des préparations d'ADN relativement dégradées peuvent servir de matrices utiles pour la génération de produits PCR de taille modérée. Les deux principales préoccupations concernant le modèle sont la pureté et la quantité.

    Un certain nombre de contaminants présents dans les préparations d'ADN peuvent diminuer l'efficacité de la PCR. Ceux-ci comprennent l'urée, le détergent SDS (dont l'action inhibitrice peut être inversée par des détergents non ioniques), l'acétate de sodium et, parfois, des composants transportés dans l'ADN purifiant des gels d'agarose (Gelfand, 1989 Gyllensten, 1989 K. Hicks et D. Coen, obs. non publié). Des extractions organiques supplémentaires, une précipitation à l'éthanol à partir d'acétate d'ammonium 2,5 M et/ou une purification sur gel sur polyacrylamide plutôt que sur agarose, peuvent toutes être bénéfiques pour minimiser une telle contamination si la méthode la plus simple (précipitation de l'échantillon avec de l'éthanol et lavage répété du culot avec de l'éthanol à 70 % ) c'est insuffisant.

    Il est clair que la quantité de matrice doit être suffisante pour pouvoir visualiser les produits PCR en utilisant le bromure d'éthidium. Habituellement, 100 ng d'ADN génomique sont suffisants pour détecter un produit PCR à partir d'un gène de mammifère à copie unique. L'utilisation de trop de modèles n'est pas recommandée lors de l'optimisation pour MgCl2 ou d'autres paramètres, car cela peut masquer les différences d'efficacité d'amplification. De plus, trop de matrice peut diminuer l'efficacité en raison de contaminants dans la préparation d'ADN.

    La quantité de matrice, en particulier en termes de quantité de séquence cible par rapport aux séquences non spécifiques, peut avoir un effet majeur sur le rendement en produits non spécifiques. Avec moins de séquence cible, il est plus probable que des produits non spécifiques soient observés. Pour certaines applications, telles que certains protocoles de séquençage d'ADN où il est important d'avoir un seul produit, la purification sur gel du produit PCR spécifique et la réamplification sont conseillées.

    Taq et autres ADN polymérases thermostables

    Parmi les avantages conférés par la thermostabilité de Taq L'ADN polymérase est sa capacité à résister au chauffage et au refroidissement répétés inhérents à la PCR et à synthétiser l'ADN à des températures élevées qui font fondre les amorces et les régions de structure secondaire locale non concordantes. L'enzyme, cependant, n'est pas infiniment résistante à la chaleur, et pour une plus grande efficacité, elle ne doit pas être soumise à des étapes de dénaturation inutiles. En effet, certains protocoles (par exemple, UNITÉ Non disponible et la méthode de « démarrage à chaud » décrite ici) recommandent de l'ajouter après la première étape de dénaturation.

    Augmenter le montant de Taq L'ADN polymérase au-delà de 2,5 U/réaction peut parfois augmenter l'efficacité de la PCR, mais seulement jusqu'à un certain point. L'ajout de plus d'enzyme peut parfois augmenter le rendement des produits PCR non spécifiques au détriment du produit d'intérêt. De plus, Taq L'ADN polymérase n'est pas bon marché.

    Une propriété très importante de Taq L'ADN polymérase est son taux d'erreur, initialement estimé à 2 × 10 -4 nucléotides/cycle (Saiki et al., 1988 ). L'enzyme purifiée fournie par les fabricants n'a pas d'activité exonucléase 3′⇒5′ de relecture, ce qui réduit les taux d'erreur d'autres polymérases telles que le fragment de Klenow de E. coli ADN polymérase I. Pour de nombreuses applications, cela ne présente aucune difficulté. Cependant, pour le séquençage de clones issus de la PCR, ou en commençant avec très peu de matrices, cela peut conduire à des problèmes majeurs. Séquençage direct de produits PCR ( UNITÉ Non disponible), le séquençage de nombreux clones générés par PCR et/ou l'utilisation de contrôles négatifs appropriés peuvent aider à surmonter ces problèmes. Alternativement, changer les conditions de réaction (Eckert et Kunkel, 1990) ou passer à une non-Taq L'ADN polymérase (avec une plus grande fidélité) peut être utile.

    Une autre propriété importante de Taq L'ADN polymérase est sa propension à ajouter des nucléotides sans matrice aux extrémités 3' des chaînes d'ADN. Cela peut être particulièrement problématique dans le clonage de produits PCR. Il est souvent nécessaire de « polir » les produits de PCR avec des enzymes telles que d'autres ADN polymérases avant d'ajouter des linkers ou de procéder au clonage à extrémités franches. A l'inverse, l'ajout d'un A non templated par Taq L'ADN polymérase peut être avantageuse pour le clonage ( UNITÉ Indisponible).

    Certains protocoles de PCR peuvent mieux fonctionner avec une polymérase thermostable plutôt qu'une autre. Le tableau 4 répertorie les ADN polymérases thermostables actuellement disponibles par noms génériques et commerciaux, la source d'origine des enzymes natives et recombinantes, le fournisseur, la fin générée (ajout de 3 ′A par rapport à l'émoussé) et les activités exonucléases associées. Une activité exonucléase 3' à 5' est en relecture. Suppression de l'activité exonucléase 5' à 3' de Taq Il est rapporté que l'ADN polymérase (délétion N-terminale) produit un rendement plus élevé. Une activité exonucléase 5' à 3' peut dégrader quelque peu les amorces. Les enzymes de relecture synthétisent l'ADN avec une plus grande fidélité et peuvent générer des produits plus longs que Taq, mais ont tendance à générer de faibles rendements. Les mélanges d'enzymes (tableau 5) ont été optimisés pour une fidélité et une longueur accrues ainsi qu'une sensibilité et un rendement.

    Taq (natif et/ou recombinant)

    Ambion, Amersham Pharmacia Biotech, Boehringer Mannheim, Clontech, Fisher, Life Technologies, Marsh Biomedical, Perkin Elmer, Promega, Qiagen, Sigma, Stratagene

    Taq, suppression N-terminale

    - une une Aucune information pour le moment.

    Promega, Epicentre Technologies

    - une une Aucune information pour le moment.

    Thermococcus litoralis

    Biolabs de la Nouvelle-Angleterre (Vent), Promega

    Thermococcus litoralis

    Amersham Pharmacia Biotech, Boehringer Mannheim, Epicenter Technologies, Perkin Elmer, Promega

    ADN polymérases thermostables et autres composants

    Développez la haute fidélité, développez le modèle long et développez les systèmes PCR de 20 Ko

    Mélange de polymérase KlenTaq LA

    KlenTaq-1 (déficient en 5′-exonucléase Taq) + polymérase de relecture non précisée

    KlenTaq-1 + polymérase de relecture non spécifiée + anticorps TaqStart

    Mélanges et kits de polymérase Advantage-cDNA et Advantage-GC cDNA

    KlenTaq-1 + polymérase de relecture non spécifiée + TaqStart Antibody GC Kit contient GC Melt

    Mélanges et kits de polymérase génomique Advantage Genomic et Advantage-GC

    Je + polymérase de relecture non spécifiée + TthStart Antibody GC Kit contient GC Melt

    Taq +Psp + polymérase(s) de relecture non précisée + tampon eLONGase

    Platine Taq ADN polymérase

    Taq + Psp + Platine Taq Anticorps

    ADN polymérase haute fidélité platine

    Taq + Psp + Taq Anticorps

    Tbr avec amplificateur non spécifié

    Kits GeneAmp XL PCR et XL RNA PCR

    Mélange d'enzymes de séquençage OmniBase

    Polymérase(s) de relecture non précisée avec pyrophosphatase thermostable

    Mélange d'ADN polymérase AccuTaq LA

    Taq + polymérase de relecture non précisée

    Systèmes PCR TaqPlus Long et TaqPlus Precision

    Pfu+Taq Tampon de réaction de précision TaqPlus (propriétaire)

    Système RT-PCR à tube unique haute fidélité Calypso de mélange d'enzymes PCR Accurase Fidelity

    Thermus sp. + Thermocoque sp. Calypso contient également de l'AMV-RT

    Démarrage à chaud

    Ce qui se passe avant le cycle thermique est essentiel au succès de la PCR. Taq L'ADN polymérase conserve une certaine activité même à température ambiante. Par conséquent, dans des conditions d'annelage non strictes, comme à température ambiante, des produits peuvent être générés à partir de l'annelage d'amorces à l'ADN cible à des emplacements de faible complémentarité ou ayant une complémentarité de quelques nucléotides aux extrémités 3'. Ces derniers créeraient en effet de nouvelles matrices « étiquetées » avec les séquences d'amorces. Les cycles suivants amplifient ces séquences marquées en abondance, générant à la fois des produits non spécifiques et réduisant éventuellement l'efficacité d'amplification de produits spécifiques par compétition pour les substrats ou la polymérase. Ainsi, des conditions empêchant la polymérisation avant les premières étapes à température contrôlée sont souhaitables. Dans ce protocole, trois méthodes d'inhibition de la polymérisation avant l'étape à température contrôlée sont comparées. Ceux-ci incluent la séparation physique d'un composant de réaction essentiel avant la première étape de dénaturation, le refroidissement des réactifs à 0°C et le blocage réversible de l'activité enzymatique avec un anticorps.

    Dénaturation du gabarit avant Taq polymérase ou MgCl2 est ajouté à la réaction fournit une amélioration spectaculaire de la spécificité et de la sensibilité dans de nombreux cas (Chou et al., 1992).Le principal inconvénient de cette méthode est qu'elle nécessite d'ouvrir une seconde fois les tubes de réaction pour ajouter le composant manquant essentiel. Cela crée à la fois un inconvénient et une augmentation du risque de contamination, une considération importante lors du test de la présence d'une séquence donnée dans des échantillons expérimentaux ou cliniques.

    Refroidir tous les composants du mélange réactionnel à 0°C avant le mélange est la méthode la plus pratique et la moins coûteuse mais aussi la moins fiable. Le transfert des tubes de réaction PCR du coulis de glace à un bloc thermocycleur préchauffé à 95 °C peut améliorer les chances de succès.

    Inhibition réversible de Taq L'ADN polymérase par anticorps TaqStart (Clontech) est la méthode la plus pratique et très efficace (Kellogg et al., 1994). Des réactions complètes peuvent être mises en place, recouvertes d'huile et stockées à 4°C jusqu'à plusieurs heures avant le cycle thermique sans perte de sensibilité ou de spécificité par rapport aux autres méthodes de démarrage à chaud (MF Kramer et DM Coen, unpub. observ .). Le cyclage est amorcé immédiatement après 5 minutes de dénaturation de l'anticorps à 94°C. Le DMSO inhibe la liaison des anticorps et ne doit pas être utilisé avec TaqStart.

    Plusieurs produits de démarrage à chaud sont maintenant disponibles dans le commerce (tableau 3). Le succès de chacun peut dépendre du strict respect des protocoles du fabricant, même d'un thermocycleur spécifique. Les méthodes de barrière de cire et de liaison d'anticorps réversibles sont plus tolérantes, tandis que les modifications chimiques ont des exigences de température d'activation plus strictes.

    Désoxyribonucléoside triphosphates

    Dans un effort pour augmenter l'efficacité de la PCR, il peut être tentant d'augmenter la concentration des dNTP. Non ! Lorsque chaque dNTP est de 200 mM, il y a de quoi synthétiser 12,5 mg d'ADN lorsque la moitié des dNTP sont incorporés. Les dNTP chélatent le magnésium et modifient ainsi la concentration optimale effective de magnésium. De plus, des concentrations de dNTP > 200 mM chacune augmentent le taux d'erreur de la polymérase. Les concentrations millimolaires de dNTP inhibent en fait Taq ADN polymérase (Gelfand, 1989).

    Le protocole de cette unité appelle à la préparation de 4dNTP dans 10 mM Tris⋅Cl/1 mM EDTA (tampon TE), pH 7,4 à 7,5. Ceci est plus facile et moins sujet aux catastrophes que la neutralisation avec de l'hydroxyde de sodium. Cependant, l'EDTA chélate également le magnésium, et cela doit être pris en compte si les stocks de dNTP sont modifiés. Alternativement, pour réduire le risque de contamination, un mélange 4dNTP peut être fait en combinant des volumes égaux de stocks préparés commercialement.

    Améliorateurs

    Les amplificateurs sont utilisés pour augmenter le rendement et la spécificité et pour surmonter les difficultés rencontrées avec une teneur élevée en GC ou des modèles longs. Les détergents non ioniques (Triton X-100, Tween 20 ou Nonidet P-40) neutralisent les charges de détergents ioniques souvent utilisés dans la préparation des matrices et doivent être utilisés dans le mélange réactionnel de base, plutôt que comme activateurs facultatifs. Des rendements plus élevés peuvent être obtenus en stabilisant/améliorant l'activité de la polymérase avec des protéines stabilisantes enzymatiques (BSA ou gélatine), des solutés stabilisants enzymatiques tels que la bétaïne ou la bétaïne⋅HCl (TMAC), des solvants stabilisants enzymatiques (glycérol), des solvants améliorant la solubilité (DMSO ou acétamide), solvants d'encombrement moléculaire (PEG) et préférences de sel de polymérase [(NH4)DONC4 est recommandé pour les polymérases autres que Taq]. Une plus grande spécificité peut être obtenue en abaissant le TM d'ADNds (en utilisant du formamide), en déstabilisant le recuit d'amorces incompatibles (en utilisant des stratégies de PMPE ou de démarrage à chaud) et en stabilisant l'ADNss (en utilisant E. coli SSB ou T4 Gene 32 Protein). L'amplification des modèles à haute teneur en GC peut être améliorée en diminuant la dépendance de la composition des paires de bases du TM d'ADNdb (avec la bétaïne Rees et al., 1993). La bétaïne est un osmolyte largement répandu dans les plantes et les animaux et est non toxique, une caractéristique qui le recommande pour des raisons de commodité de manipulation, de stockage et d'élimination. La bétaïne peut être l'ingrédient exclusif de diverses formulations commerciales. Pour les modèles longs, un pH plus élevé est recommandé (pH 9,0). Le pH du tampon Tris diminue à haute température, la PCR longue durée nécessite plus de temps à haute température, et une durée plus longue à un pH inférieur peut entraîner une certaine dépuration de la matrice, entraînant une réduction du rendement du produit spécifique. Le phosphate inorganique (PPi), un produit de la synthèse de l'ADN, peut s'accumuler avec l'amplification des produits longs à des niveaux qui peuvent favoriser l'inversion de la polymérisation. L'accumulation de PPi peut être évitée par l'ajout de PPase thermostable. Lorsqu'un grand nombre d'échantillons sont analysés, la commodité d'ajouter des produits PCR directement à un gel représente un gain de temps significatif. Certaines entreprises combinent leur polymérase thermostable avec un colorant rouge et un composant à haute densité pour faciliter le chargement des produits de réaction sur les gels sans autre ajout de tampon de chargement.

    Paramètres de cyclage thermique

    Chaque étape du cycle nécessite un minimum de temps pour être efficace, alors que trop de temps peut être à la fois un gaspillage et délétère pour l'ADN polymérase. Si le temps passé à chaque étape peut être réduit, tant mieux.

    Dénaturation. Il est essentiel qu'une séparation complète des brins se produise pendant l'étape de dénaturation. Il s'agit d'une réaction unimoléculaire qui, en elle-même, est très rapide. La dénaturation suggérée de 30 secondes utilisée dans le protocole garantit que le contenu du tube atteint 94°C. Si la PCR ne fonctionne pas, il vaut la peine de vérifier la température à l'intérieur d'un tube de contrôle contenant 100 µl d'eau. Si la teneur en GC est extrêmement élevée, des températures de dénaturation plus élevées peuvent cependant être nécessaires, Taq L'activité de l'ADN polymérase diminue rapidement à des températures plus élevées (Gelfand, 1989). Pour amplifier une longue séquence (>3 kb), minimisez le temps de dénaturation pour protéger l'ADN cible des effets possibles, tels que la dépurination, d'un pH abaissé du tampon Tris à des températures élevées.

    recuit. Il est essentiel que les amorces s'hybrident de manière stable à la matrice. Les amorces avec une teneur en GC relativement faible (<50%) peuvent nécessiter des températures inférieures à 55°C pour un recuit complet. D'autre part, cela peut également augmenter la quantité de produits non spécifiques. Pour les amorces à haute teneur en GC, des températures de recuit plus élevées peuvent être nécessaires. Il peut être intéressant, bien que chronophage, d'expérimenter ce paramètre. Certains fabricants proposent sur le marché des thermocycleurs capables de former un gradient de température à travers les unités de chauffage, permettant ainsi une optimisation de la température de recuit en un seul passage. Comme pour la dénaturation, le temps de cette étape est basé principalement sur le temps qu'il faut pour atteindre la bonne température, car les amorces sont en tel excès que la réaction d'hybridation se produit très rapidement.

    Extension. La température d'extension de 72°C est proche de la température optimale pour Taq L'ADN polymérase (∼75°C), mais empêche les amorces de tomber. En effet, l'extension de l'amorce commence pendant le recuit, car Taq L'ADN polymérase est partiellement active à 55°C et même à des températures plus basses (Gelfand, 1989).

    La durée d'extension dépend principalement de la longueur de la séquence à amplifier. Une durée de 1 min par ko de longueur de produit est généralement suffisante.

    Certains protocoles, y compris d'autres dans ce chapitre, terminent la PCR avec une longue période d'extension finale dans le but d'essayer de rendre les produits aussi complets que possible.

    Temps de rampe. Le temps de rampe fait référence au temps nécessaire pour passer d'une température à une autre. L'utilisation de bains-marie et le déplacement manuel des échantillons d'une température à l'autre donnent probablement les temps de rampe les plus courts, qui sont principalement le temps nécessaire pour que le contenu du tube change de température. Différents thermocycleurs ont des temps de rampe différents, plus c'est court, mieux c'est.

    Le Stratagene Robocycler utilise un bras robotisé pour déplacer les échantillons d'un bloc à température constante à un autre, éliminant pratiquement le temps de rampe du bloc, mais un temps de rampe pour le contenu du tube doit être calculé (∼1 sec/°C) et ajouté à la dénaturation, l'annelage, et les délais de prolongation. Les cycles rapides qui utilisent des pointes de pipette à déplacement positif ou des tubes capillaires pour les réactions PCR réduisent considérablement les temps de rampe.

    Généralement, les thermocycleurs plus « performants » avec des temps de rampe courts sont proportionnellement plus coûteux. Il existe de nombreux nouveaux thermocycleurs sur le marché dont le prix est inférieur à 5 000 $, qui fonctionnent assez bien (Beck, 1998 ).

    Résultats attendus

    À partir de ≥100 ng d'ADN de mammifère (≥10 4 molécules), le peut être utilisé pour déterminer quel MgCl2 la concentration, l'additif améliorant et les conditions initiales produiront un produit PCR prédominant à partir d'une séquence à copie unique qui est facilement visible sur un gel coloré au bromure d'éthidium. Il est possible que d'autres produits mineurs soient également visibles.

    Considérations de temps

    Le peut être complété en une seule journée. L'assemblage des mélanges réactionnels devrait prendre environ 1 h. Le vélo devrait prendre moins de 3 heures. La préparation, l'exécution et la coloration du gel devraient prendre encore quelques heures. Des vérifications supplémentaires de la spécificité du produit, telles que la digestion par des endonucléases de restriction ou l'hybridation par transfert de Southern, prendront respectivement quelques heures ou jours supplémentaires.