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Pourquoi le nombre de cycles PCR est-il limité ?


On m'a dit que le nombre maximum de cycles en PCR est compris entre 20 et 30.

Est-ce vrai et quelles sont les raisons de cette limitation ?


Je tracerais la ligne au-delà de 35, mais c'est un peu cosmétique. Les raisons sont multiples :

  • en raison du mode exponentiel de l'amplification (idéalement), les réactifs sont épuisés à un moment donné
  • les réactifs se dégradent, c'est particulièrement vrai pour les dNTP
  • l'activité de l'enzyme, bien qu'elle soit thermostable, diminue avec le temps
  • au-delà de 35 cycles la courbe exponentielle s'aplatit (raisons voir ci-dessus)
  • si vous exécutez la PCR trop longtemps, vous obtiendrez de plus en plus de produits secondaires (principalement des dimères d'amorces, mais des amorces mal alignées peuvent également poser des problèmes), c'est plus un problème pour la PCR en temps réel que pour celles exécutées sur un gel

Si vous avez besoin d'une sensibilité plus élevée avec plus de cycles, vous pouvez utiliser la technique appelée « nested PCR ». Là, vous faites un premier tour avec une paire d'amorces spécifique à la région d'intérêt, puis un deuxième tour avec des amorces qui sont situées légèrement à l'intérieur de l'ADN amplifié. Ceci est fait pour éviter l'amplification de contaminations indésirables. Étant donné que vous effectuez au total 50 à 70 cycles d'amplification PCR, cette méthode est extrêmement sensible (également aux contaminations). Voir l'image de l'article de Wikipédia pour plus de détails :


Combien de cycles de PCR avant que les dNTP ne s'épuisent ?

Supposons une réaction de 25 ul.

Supposons 200 uM de dNTP.

200 M de dNTP = 200 pmol l -1

donc dans 25 l de réaction, il y a 5000 pmoles de dNTP

= 5000 x 10-12 x 6 x 1023 molécules

= 3x1015 molécules dNTP

Supposons que nous commençons avec 1 molécule d'un modèle de 1000 pb, 50% GC

1 kb = 2000 nucléotides

Alors , combien de ces molécules pouvons - nous construire en utilisant 3 x 1015 molécules dNTP ?

= 3x1015/2000

= 1,5 x 1012 Molécules d'ADN

Combien de cycles de PCR pour produire autant de cycles à partir d'une seule molécule matrice ?

2m = 1,5x1012

nlog2 = log(1.5) + log(1012)

nlog2 = 12,18

n = 12,18/log2 = 41 cycles

Bien sûr, cela dans une limite supérieure absolue. L'estimation suppose que vous commencez avec une molécule modèle de 1 kb, et que les dNTP ne sont pas hydrolysés ou autrement dégradés.


Dans mes propres recherches, j'ai découvert que la quantité de produit PCR augmentait à mesure que j'augmentais les cycles à 50 fois. Il s'agissait d'une seule paire d'amorces utilisée pour amplifier l'ADN génomique extrait avec un kit particulier, ce qui ne s'applique pas aux autres réactions que j'ai effectuées. Ce que certaines personnes semblent oublier, c'est que les produits PCR ne doublent pas nécessairement à chaque cycle à aucun moment de la PCR car certaines amorces ne fonctionnent pas aussi bien que d'autres et les conditions de réaction peuvent être sous-optimales (par exemple, présence de contaminants ou concentration de ions mg).

En bref, à condition que vous n'obteniez pas de produits de qualité réduite (par exemple, des produits de maculage ou d'amorçage non spécifiques), alors je pense que c'est bien d'augmenter le nombre de cycles bien au-delà de 30 - c'est quelque chose que vous devez tester empiriquement avec vos amorces particulières , matrice, polymérase, tampon, etc.


Réaction en chaîne par polymérase (PCR)

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une version en tube à essai du même processus de réplication de l'ADN que l'on trouve dans la cellule vivante. C'est un moyen rapide et peu coûteux d'amplifier ou de faire de nombreuses copies de petits segments d'ADN. Ceci est nécessaire car les méthodes utilisées pour analyser l'ADN (détermination de la séquence de paires de bases d'ADN) nécessitent plus d'ADN que ce qui peut être dans un échantillon typique. Une caractéristique particulièrement utile de la PCR est qu'elle permet de limiter le processus d'amplification à des segments spécifiquement ciblés du mélange d'ADN, tels que les marqueurs du chromosome Y utilisés dans les tests généalogiques.

Lorsque vos flacons de cellules de joue ou de salive arrivent au laboratoire pour être testés, l'ADN est extrait et purifié. Ils sont d'abord mélangés avec un détergent qui provoque l'éclatement des cellules et la libération de leur ADN avec d'autres contenus cellulaires. Le mélange est ensuite lavé avec une solution tampon contenant du phosphate (sel doux) pour diluer les débris cellulaires. Avec une préparation minimale, l'échantillon est prêt et l'ADN sur la zone ciblée d'un chromosome peut être amplifié.


À propos de ces tests RT-PCR

Son cas repose principalement sur l'utilisation inappropriée du test RT-PCR. Un de mes collègues a gracieusement accepté que je reproduise ses évaluations de ce test - il n'est pas seul. Pointe de chapeau Gerry @ http://boomfinanceandeconomics.com/#/

La PCR est une technologie difficile à appréhender car il y a tellement d'aspects subtils. La technologie PCR existe depuis 1987, lorsque Kary Mullis l'a inventée. Il a remporté le prix Nobel pour cela. Ce n'est pas un test que les cliniciens commandent à la légère. Dans la pratique médicale clinique normale, il n'est prescrit que lorsqu'il s'agit de patients très malades. Un examen attentif et une interprétation très prudente sont nécessaires et la situation clinique est critique.

Tout le monde devrait regarder les vidéos de Kary Mullis sur YouTube et Bitchute. Il était malheureusement un génie et un brillant scientifique, il est décédé récemment – ​​juste avant l'épidémie de Covid. https://www.bitchute.com/video/8KsH34IGgqBw/

Citation de Kary Mullis, lauréat du prix Nobel et inventeur des tests PCR :

«Des gars comme Fauci se lèvent et commencent à parler, vous savez, il ne sait vraiment rien de rien et je le lui dirais en face. Rien. L'homme pense que vous pouvez prélever un échantillon de sang et le coller dans un microscope électronique et s'il contient un virus, vous le saurez. Il ne comprend pas la microscopie électronique et il ne comprend pas la médecine et il ne devrait pas être dans une position comme il l'est. La plupart de ces gars là-haut sont juste des gens administratifs et ils ne savent rien de ce qui se passe allumé dans le corps.

Vous savez, ces gars ont un agenda, ce qui n'est pas ce que nous voudrions qu'ils aient étant que nous payons pour qu'ils prennent soin de notre santé d'une manière ou d'une autre. Ils ont un ordre du jour personnel. Ils établissent leurs propres règles au fur et à mesure. Ils les changent quand ils veulent. Et ils sont suffisants, comme Tony Fauci, ça ne dérange pas de passer à la télévision devant les gens qui paient son salaire et mentent directement devant la caméra.»

Le nombre de cycles de PCR peut avoir des conséquences dramatiques.

C'est le noyau du problème bien qu'il y ait beaucoup, beaucoup plus de facteurs. Les tests PCR ne permettent pas de faire la distinction entre les micro-organismes vivants (viables) et les micro-organismes morts. Ils contiennent tous deux du matériel génétique. C'est pourquoi l'utilisation de tests PCR avec des nombres Ct élevés (nombres de cycles d'amplification) dans une situation de dépistage est ridicule. Il ne doit jamais être utilisé chez des personnes non symptomatiques pour « diagnostiquer » une maladie.

En raison de ce problème, il ne peut jamais être considéré comme un « test de diagnostic ». Aucun clinicien digne de ce nom ne considérera jamais un test PCR autonome comme un diagnostic. Nous avons plus de 20 ans d'expérience clinique avec cette technologie. Si vous effectuez plus de 30 cycles d'amplification, vous êtes assuré de trouver des restes viraux ou des contaminants non viables (morts). De nombreux pays ont effectué 40 à 45 cycles pendant le phénomène Covid. Le numéro de cycle est garanti pour produire un taux élevé de tests positifs qui sont, en fait, faux. Nous les appelons « faux positifs » dans le monde de la médecine clinique.

Un test positif pour le SRAS CoV2 (avec moins de 25 cycles d'amplification) combiné avec un patient malade qui présente les symptômes d'une virémie aiguë et une tomodensitométrie qui montre des opacités en verre dépoli (en particulier bilatéralement) ainsi que des résultats hématologiques d'attaque virale aiguë peuvent alors faire partie des preuves d'un diagnostic préliminaire (provisoire) de Covid 19. Si le l'évolution clinique de la maladie progresse comme on pourrait s'y attendre, alors ce diagnostic peut devenir plus ferme avec le temps.

C'est ainsi que se pratique la médecine clinique. Les « épidémiologistes » et les « conseillers médicaux » fonctionnaires de nos gouvernements sont presque TOUS des non-cliniciens. Ils jamais voir un patient malade. Ils jamais assumer la responsabilité du traitement d'une personne seule qui est dangereusement malade avec Covid 19. Ils peuvent être choqués d'apprendre que les cliniciens les ignorent généralement et traitent leurs patients malades avec du zinc, des stéroïdes (inhalés, oraux et IV), de la vitamine D, de l'ivermectine et Hydroxychloroquine avant le résultat du test PCR revient.

Le diagnostic moléculaire révolutionne la pratique clinique des maladies infectieuses. Leurs effets peuvent être importants en milieu de soins aigus où des outils de diagnostic opportuns et précis sont essentiels pour les décisions et les résultats de traitement des patients. Les établissements de soins de courte durée ne sont PAS un dépistage de la population générale des non-symptomatiques. Et la PCR n'est pas le seul test ou observation qu'un clinicien utilisera dans un cadre de soins actifs.

Avec l'évolution de nouveaux outils de diagnostic de biologie moléculaire (PCR), des questions difficiles se sont posées concernant le rôle de ces tests dans l'évaluation des maladies infectieuses cliniques. Alors que les diagnostics moléculaires continuent de passer de la paillasse au chevet du patient, les cliniciens doivent acquérir une connaissance pratique des principes, de la valeur diagnostique et des limites de divers tests en milieu hospitalier.

La méthode repose sur la connaissance d'au moins séquences partielles de l'ADN cible a priori et les utiliser pour concevoir des amorces oligonucléotidiques qui s'hybrident spécifiquement à la séquence cible. Une séquence partielle n'est pas une séquence complète, c'est un problème potentiel pour l'interprétation des résultats du test.

Grâce à plusieurs cycles de chauffage et de refroidissement dans un thermocycleur pour produire des cycles de dénaturation de l'ADN cible, d'hybridation d'amorce et d'extension d'amorce, l'ADN cible est amplifié de façon exponentielle“.

Théoriquement, cette méthode a le potentiel de générer des milliards de copies d'ADN cible à partir d'une seule copie en moins d'une heure. Ainsi, un minuscule fragment de matériel génétique mort (non viable) peut être trouvé par la méthodologie d'amplification PCR. Il faut donc faire très attention aux résultats. Ils ne représentent pas de « cas » sauf sur la BBC, l'ABC et sur CNN et al.

Limites de la PCR :

Les principales lacunes dans l'application des tests PCR en milieu clinique comprennent :

  • Résultats faussement positifs dus à une contamination de fond par l'ADN
  • Le potentiel de résultats de test faussement négatifs
  • Sensibilité de détection dépassant la signification clinique
  • Espace de détection limité du test ou de la plate-forme pour l'identification simultanée de plusieurs espèces, facteurs de virulence ou résistance aux médicaments.

Faux positifs:

L'utilisation généralisée de la PCR en milieu clinique peut être entravée en grande partie par une contamination de fond provenant de sources exogènes d'ADN. Dans la plupart des tests spécifiques aux agents pathogènes, la source prédominante de contamination est dérivée des produits « de transfert » de réactions PCR antérieures qui peuvent être hébergés et transmis par les réactifs PCR, les tubes, les pipettes et les surfaces de laboratoire. Couplé à la puissance d'amplification robuste de la PCR, même de très petites quantités de contamination par transfert peuvent servir de substrats pour l'amplification et conduire à des résultats faussement positifs.

Des mesures de contrôle méticuleuses telles que les bonnes pratiques de laboratoire et la séparation physique des zones de pré-amplification et de post-amplification peuvent réduire les risques de contamination mais ne sont pas infaillibles. L'utilisation de l'inactivation enzymatique de l'ADN de transfert (c'est-à-dire l'uracile N-glycosylase) peut réduire davantage le risque de contamination.

Pour les médecins de soins actifs de première ligne ou les médecins travaillant dans des situations de catastrophe, un test PCR universel rapide ou des panels de tests PCR ciblant des catégories d'agents pathogènes impliqués dans des syndromes spécifiques tels que la méningite, la pneumonie ou la septicémie, peuvent permettre un triage rapide et précoce thérapie ciblée agressive.

En raison de préoccupations légitimes concernant la transmission de la maladie à partir de cas asymptomatiques et pré-symptomatiques, cet avis n'est pas suivi. En conséquence, la grande abondance de tests est un dépistage et non un diagnostic.

Une façon de réduire les résultats faussement positifs consiste à répéter le test en utilisant un test avec un format différent (fabricant différent). En raison des installations de test limitées, la confirmation n'est pas effectuée en routine et seuls quelques positifs sont confirmés par un deuxième test rRT-PCR. Il est probable qu'à la prévalence actuelle de la maladie, les résultats positifs de la rRT-PCR de nombreuses personnes asymptomatiques soient des faux positifs. Nous savons déjà que le nombre est au minimum de 90 % et peut atteindre 99 %, surtout si le nombre Ct dépasse 40.


si les deux sont égaux ou presque égaux.)

Le nombre de molécules d'amorce libres dans l'échantillon UNE après le cycle 4.

Le nombre de molécules d'amorce libres dans l'échantillon UNE après le cycle 10.

Le nombre de molécules d'amorce libres dans l'échantillon UNE après le cycle 10.

Le nombre de molécules d'amorce libres dans l'échantillon B après le cycle 10.

Le nombre de molécules de sonde TaqMan libres dans l'échantillon UNE après le cycle 10.

Le nombre de molécules de sonde TaqMan libres dans l'échantillon B après le cycle 10.

Le nombre de molécules de sonde TaqMan libres dans l'échantillon UNE après le cycle 18.

Le nombre r de molécules de sonde TaqMan libres dans l'échantillon B après le cycle 18.

Le nombre de complexes colorant/mononucléotide rapporteur dans l'échantillon UNE après le cycle 18.

Le nombre de complexes colorant/mononucléotide rapporteur dans l'échantillon B après le cycle 18.

Le nombre d'amplifiés HER2 fragments dans l'échantillon UNE après le cycle 20.

Le nombre d'amplifiés HER2 fragments dans l'échantillon B après le cycle 20.

Le nombre d'amplifiés HER2 fragments dans l'échantillon UNE après le cycle 30.

Le nombre d'amplifiés HER2 fragments dans l'échantillon B après le cycle 30.


À propos de ces tests RT-PCR

Reiner Fuellmich s'apprête à engager des poursuites judiciaires contre les auteurs de l'escroquerie du Covid-19 : covid-fraud-lawyers-medical-experts-start -legal-proeedings- against WHO Son cas repose principalement sur l'utilisation inappropriée du test RT-PCR. Un de mes collègues a gracieusement accepté que je reproduise ses évaluations de ce test - il n'est pas seul. Pointe de chapeau Gerry @ http://boomfinanceandeconomics.com/#/

La PCR est une technologie difficile à appréhender car il y a tellement d'aspects subtils. La technologie PCR existe depuis 1987, lorsque Kary Mullis l'a inventée. Il a remporté le prix Nobel pour cela. Ce n'est pas un test que les cliniciens commandent à la légère. Dans la pratique médicale clinique normale, il n'est prescrit que lorsqu'il s'agit de patients très malades. Un examen attentif et une interprétation très prudente sont nécessaires et la situation clinique est critique.

Tout le monde devrait regarder les vidéos de Kary Mullis sur YouTube et Bitchute. C'était un génie et un brillant scientifique malheureusement, il est décédé récemment, juste avant l'épidémie de Covid. https://www.bitchute.com/video/8KsH34IGgqBw/

Citation de Kary Mullis, lauréat du prix Nobel et inventeur des tests PCR : «Des gars comme Fauci se lèvent et commencent à parler, vous savez, il ne sait vraiment rien de rien et je le lui dirais en face. Rien. L'homme pense que vous pouvez prélever un échantillon de sang et le coller dans un microscope électronique et s'il contient un virus, vous le saurez. Il ne comprend pas la microscopie électronique et il ne comprend pas la médecine et il ne devrait pas être dans une position comme il l'est. La plupart de ces gars là-haut sont juste des gens administratifs et ils ne savent rien de ce qui se passe allumé dans le corps. Vous savez, ces gars ont un agenda, ce qui n'est pas ce que nous voudrions qu'ils aient étant que nous payons pour qu'ils prennent soin de notre santé d'une manière ou d'une autre. Ils ont un ordre du jour personnel. Ils établissent leurs propres règles au fur et à mesure. Ils les changent quand ils veulent. Et ils sont suffisants, comme Tony Fauci, ça ne dérange pas de passer à la télévision devant les gens qui paient son salaire et mentent directement devant la caméra.»

Le nombre de cycles de PCR peut avoir des conséquences dramatiques. C'est le noyau du problème bien qu'il y ait beaucoup, beaucoup plus de facteurs. Les tests PCR ne permettent pas de faire la distinction entre les micro-organismes vivants (viables) et les micro-organismes morts. Ils contiennent tous deux du matériel génétique. C'est pourquoi l'utilisation de tests PCR avec des nombres Ct élevés (nombres de cycles d'amplification) dans une situation de dépistage est ridicule. Il ne doit jamais être utilisé chez des personnes non symptomatiques pour « diagnostiquer » une maladie.

En raison de ce problème, il ne peut jamais être considéré comme un « test de diagnostic ». Aucun clinicien digne de ce nom ne considérera jamais un test PCR autonome comme un diagnostic. Nous avons plus de 20 ans d'expérience clinique avec cette technologie. Si vous effectuez plus de 30 cycles d'amplification, vous êtes assuré de trouver des restes viraux ou des contaminants non viables (morts). De nombreux pays ont effectué 40 à 45 cycles pendant le phénomène Covid. Le numéro de cycle est garanti pour produire un taux élevé de tests positifs qui sont, en fait, faux. Nous les appelons « faux positifs » dans le monde de la médecine clinique.

Un test positif pour le SRAS CoV2 (avec moins de 25 cycles d'amplification) combiné avec un patient malade qui présente les symptômes d'une virémie aiguë et une tomodensitométrie qui montre des opacités en verre dépoli (en particulier bilatéralement) ainsi que des résultats hématologiques d'attaque virale aiguë peuvent alors faire partie des preuves d'un diagnostic préliminaire (provisoire) de Covid 19. Si le l'évolution clinique de la maladie progresse comme on pourrait s'y attendre, alors ce diagnostic peut devenir plus ferme avec le temps.

C'est ainsi que se pratique la médecine clinique. Les « épidémiologistes » et les « conseillers médicaux » fonctionnaires de nos gouvernements sont presque TOUS des non-cliniciens. Ils jamais voir un patient malade. Ils jamais assumer la responsabilité du traitement d'une personne seule qui est dangereusement malade avec Covid 19. Ils peuvent être choqués d'apprendre que les cliniciens les ignorent généralement et traitent leurs patients malades avec du zinc, des stéroïdes (à la fois inhalés, par voie orale et IV), de la vitamine D, de l'ivermectine et Hydroxychloroquine avant le résultat du test PCR revient.

Le diagnostic moléculaire révolutionne la pratique clinique des maladies infectieuses. Leurs effets peuvent être importants en milieu de soins aigus où des outils de diagnostic opportuns et précis sont essentiels pour les décisions et les résultats de traitement des patients. Les établissements de soins de courte durée ne sont PAS un dépistage de la population générale des non-symptomatiques. Et la PCR n'est pas le seul test ou observation qu'un clinicien utilisera dans un cadre de soins actifs.

Avec l'évolution de nouveaux outils de diagnostic de biologie moléculaire (PCR), des questions difficiles se sont posées concernant le rôle de ces tests dans l'évaluation des maladies infectieuses cliniques. Alors que les diagnostics moléculaires continuent de passer de la paillasse au chevet du patient, les cliniciens doivent acquérir une connaissance pratique des principes, de la valeur diagnostique et des limites de divers tests en milieu hospitalier .

La méthode repose sur la connaissance d'au moins séquences partielles de l'ADN cible a priori et les utiliser pour concevoir des amorces oligonucléotidiques qui s'hybrident spécifiquement à la séquence cible. Une séquence partielle n'est pas une séquence complète, c'est un problème potentiel pour l'interprétation des résultats du test.

Grâce à plusieurs cycles de chauffage et de refroidissement dans un thermocycleur pour produire des cycles de dénaturation de l'ADN cible, d'hybridation d'amorce et d'extension d'amorce, l'ADN cible est amplifié de façon exponentielle“.

Théoriquement, cette méthode a le potentiel de générer des milliards de copies d'ADN cible à partir d'une seule copie en moins d'une heure. Ainsi, un minuscule fragment de matériel génétique mort (non viable) peut être trouvé par la méthodologie d'amplification PCR. Il faut donc faire très attention aux résultats. Ils ne représentent pas de « cas » sauf sur la BBC, l'ABC et sur CNN et al.

Limites de la PCR : Les principales lacunes dans l'application des tests PCR en milieu clinique comprennent :

  • Résultats faussement positifs dus à une contamination de fond par l'ADN
  • Le potentiel de résultats de test faussement négatifs
  • Sensibilité de détection dépassant la signification clinique
  • Espace de détection limité du test ou de la plate-forme pour l'identification simultanée de plusieurs espèces, facteurs de virulence ou résistance aux médicaments.

Faux positifs: L'utilisation généralisée de la PCR en milieu clinique peut être entravée en grande partie par une contamination de fond provenant de sources exogènes d'ADN. Dans la plupart des tests spécifiques aux agents pathogènes, la source prédominante de contamination est dérivée des produits « de transfert » de réactions PCR antérieures qui peuvent être hébergés et transmis par les réactifs PCR, les tubes, les pipettes et les surfaces de laboratoire. Couplé à la puissance d'amplification robuste de la PCR, même de très petites quantités de contamination par transfert peuvent servir de substrats pour l'amplification et conduire à des résultats faussement positifs.


Pourquoi le nombre de cycles PCR est-il limité ? - La biologie

La réaction en chaîne par polymérase ( PCR )

PCR commence par un mélange contenant un ADNdb modèle , une paire de shorts amorces oligonucléotidiques ADNsb , une piscine des quatre dNTP , et un ADN polymérase résistante à la chaleur, Taq Enzyme . La réaction est effectuée dans un bloc chauffant régulé par ordinateur, une thermocycleur , qui permet un chauffage et un refroidissement rapides et contrôlés. Les amorces sont choisis de sorte qu'ils soient complémentaires de base aux extrémités opposées de l'un ou l'autre brin d'un court tronçon d'ADN contenant la région du gène d'intérêt : PCR nécessite donc une certaine connaissance préalable du gène.

La réaction est d'abord chauffée à 95°C fondre (dénaturer) les ADNdb en brins séparés. La réaction est ensuite refroidie à

50 oC, à quelle température le amorces trouveront des régions complémentaires de base dans le ADNsb, auquel ils s'attacheront (recuire). La réaction est finalement chauffée à 72°C, à quelle température le Taq l'enzyme réplique l'amorce ADNsb (extension). À la fin d'un cycle, la région entre les deux amorces a été copiée une fois, produisant deux copies de la région du gène d'origine. [Ceci est légèrement simplifié : voir des détails].

Parce qu'une polymérase résistante à la chaleur est utilisée, la réaction peut être répétée en continu sans ajout d'enzyme supplémentaire. Chaque cycle double le nombre de copies du gène amplifié : dix cycles produisent idéalement 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1 024 ( 2 10 ) copies. Ainsi, 30 cycles donne a ( 2 10x3 ) = 10 amplification de 9 fois. Cela produit une quantité suffisante de la région du gène d'intérêt pour une analyse directe, par exemple par séquençage ADN.


Colorant de liaison à l'ADN :

Pour une personne novice et inexpérimentée, la méthode du colorant liant l'ADN est la meilleure technique de détection en temps réel.

Le colorant a sa propre fluorescence. Une fois que le colorant se lie à l'ADN double brin, la fluorescence émise par le colorant augmente de 100 à 1000 fois par rapport au signal d'origine.

Cependant, la fluorescence du colorant d'origine est prise comme ligne de base pour la détection.

La méthode est rapide, rapide, fiable et rentable. De plus, les risques d'erreur dans les expériences sont moindres et la configuration de la réaction est simple et facile à utiliser.

Le résultat de l'expérience dépend de la spécificité des amorces utilisées dans la réaction PCR.

Parce que même si les amorces se lient de manière non spécifique, le colorant de liaison à l'ADN se lie à la séquence non spécifique et donne les signaux fluorescents.

Parce que le colorant détecte l'ADN double brin pour se lier, même si l'ADNdb n'est pas spécifique, le colorant doit s'y lier.

Par conséquent, le risque de détection non spécifique est élevé dans la méthode à base de colorant vert SYBR.

Le vert SYBR est l'un des colorants les plus populaires utilisés dans la PCR en temps réel.

La sensibilité de l'expérience est limitée. Encore une fois une question se pose à l'esprit,

Convient-il à la détermination de modèles sensibles ?

Nous pouvons identifier les liaisons non spécifiques dans la réaction en effectuant l'analyse de la courbe de fusion.

Analyse de la courbe de fusion :

Une fois la réaction d'amplification terminée et les signaux de fluorescence enregistrés, la matrice est fondue pour la détermination des liaisons non spécifiques.

La matrice est fondue par chauffage, le colorant se dissocie et les signaux de fluorescence sont réduits.

La transition diminuée d'une fluorescence à large plage est signalée pour le produit spécifique tandis que différentes transitions thermiques sont enregistrées pour différentes bandes courtes non spécifiques.

"Les séquences plus grandes prennent plus de temps et une température plus élevée pour la fusion, tandis que les bandes non spécifiques fondent à une température plus basse et ont des courbes de température de fusion différentes."

Les données sont tracées dans le graphique de fluorescence en fonction de la température de fusion ci-dessous.

Le graphique de fluorescence en fonction de la température de fusion est également appelé courbe de dissociation et la méthode est appelée analyse de courbe de dissociation.

Image: L'image montre la courbe de dissociation pour des produits spécifiques et des dimères d'amorce tandis qu'une autre image montre différentes courbes de dissociation pour deux homozygotes et un hétérozygote.

Le vert SYBR et EvaGreen sont les deux principaux colorants utilisés dans la PCR quantitative en temps réel. Les expériences sont utilisées dans la validation des tests tels que les puces à ADN.

La chimie de la sonde TaqMan est largement utilisée dans la PCR quantitative, le nom TaqMan est tiré du “Taq” Taq ADN polymérase (car la chimie de la sonde dépend de l'activité de la Taq ADN polymérase) et “Homme” du jeu PacMan. Oui, le nom est tiré du jeu. Vous vous souvenez de ce que fait PacMan ?


Différents types de techniques PCR basées sur le thermocyclage (étapes de chauffage et de refroidissement)

Les techniques de thermocyclage utilisent des cycles de température pour entraîner des cycles répétés de synthèse d'ADN.

PCR multiplexe

La PCR multiplex est un type de technique de PCR qui permet une amplification de plusieurs séquences cibles simultanément dans le même mélange réactionnel.

Un mélange réactionnel unique comprend des ensembles de paires d'amorces pour différentes cibles d'ADN. Il réduit la consommation de Réactifs PCR, et, en même temps, impose des restrictions sur les amorces utilisées.

Pour fonctionner correctement dans une réaction, les ensembles d'amorces doivent être optimisés. Ils doivent avoir des températures de recuit similaires et produire des amplicons de différentes tailles pour former des bandes d'électrophorèse sur gel distinctes pour l'analyse PCR suivie.

PCR imbriquée

La PCR nichée est utilisée pour augmenter la spécificité d'une amplification d'ADN en réduisant les produits non spécifiques.

Cette technique utilise deux jeux d'amorces.

Le premier ensemble permet une première réaction en chaîne par polymérase. Le produit de cette réaction sert de source d'ADN cible pour une seconde PCR utilisant le second jeu d'amorces.

PCR de démarrage à chaud

Ce type de réaction en chaîne par polymérase sert à réduire l'amplification non spécifique pendant les étapes initiales de configuration.

La technique de PCR à démarrage à chaud maintient l'ADN polymérase dans un état inactif à des températures inférieures à une température d'hybridation.

Cette modification empêche l'amplification lors de la configuration de la réaction lorsque les amorces se lient à des séquences d'ADN avec une faible homologie.

Deux variantes de cette technique sont la PCR à démarrage à chaud mécanique et non mécanique.

PCR mécanique à démarrage à chaud réalisée en chauffant le mélange réactionnel à la température de fusion de l'ADN avant d'ajouter la Taq polymérase.

PCR à démarrage à chaud non mécanique utilise des systèmes enzymatiques spécialisés qui inhibent une activation de l'ADN polymérase à température ambiante.

PCR à l'atterrissage

Touchdown PCR est une autre technique pour réduire l'amplification non spécifique.

Il est obtenu en élevant la température de recuit au-dessus de la température de fusion des amorces utilisées dans les cycles initiaux et en l'abaissant dans les cycles ultérieurs.

Les températures plus élevées pendant les cycles initiaux aident les amorces à se lier aux matrices d'ADN avec une plus grande spécificité tandis que les températures plus basses permettent une amplification plus efficace à partir des amplicons produits.

Réaction en chaîne de la ligase (LCR)

Ce type de technique PCR utilise quatre amorces pour l'amplification d'ADN (deux amorces pour chaque brin de la cible d'ADN).

Les amorces de réaction en chaîne ligase sont beaucoup plus longues que les amorces PCR habituelles et conçues pour couvrir toute la séquence à amplifier.

Au cours de la première étape d'annelage, les amorces sont scellées par une ADN ligase thermostable.

Cela génère un fragment aussi long que la longueur totale de chaque paire d'amorces qui sert de matrices d'ADN pour les cycles suivants.

Le principal avantage de la réaction en chaîne de la ligase est qu'une mutation ponctuelle unique près de la jonction dans l'ADN matrice d'origine peut empêcher la réaction et qu'une absence de produit peut être un indicateur de mutations.

PCR quantitative (qPCR)

La quantité de produit synthétisé au cours d'un nombre défini de cycles d'une réaction en chaîne par polymérase dépend du nombre de molécules d'ADN présentes dans le mélange de départ. Cela permet à la PCR d'être utilisée pour quantifier le nombre de molécules d'ADN présentes dans un extrait.

En PCR quantitative, la quantité de produit synthétisé lors d'un test PCR est comparée aux quantités synthétisées lors de PCR avec des quantités connues d'ADN de départ.

Pcr en temps réel

Aujourd'hui, la quantification est réalisée par PCR en temps réel - une modification de la technique PCR standard dans laquelle la synthèse du produit est mesurée au cours du temps.

Plus fréquemment, cette méthode est utilisée pour mesurer les quantités d'ARN.

Par exemple pour déterminer l'expression d'un gène particulier dans les cellules cancéreuses. Cette méthode permet de suivre l'évolution du cancer.

PCR par transcription inverse

Pour effectuer une réaction en chaîne par polymérase où l'ARN est le matériau de départ, cette méthode utilise la transcriptase inverse, un processus appelé RT-PCR (réaction en chaîne par polymérase de la transcriptase inverse).

La première étape de cette méthode consiste à convertir les molécules d'ARN en ADN complémentaire simple brin (ADNc). Après cette étape, l'expérience se déroule comme dans la technique standard.

Certaines polymérases thermostables, telles que la Tth, ont une activité de transcriptase inverse dans certaines conditions tampons et sont capables de faire des copies d'ADN à la fois de molécules d'ARN et d'ADN.

PCR TaqMan

TaqMan PCR est l'une des techniques de PCR en temps réel.

Il utilise une sonde oligonucléotidique qui est complémentaire d'une séquence interne au sein des brins amplifiés.

Il a un groupe fluorescent à une extrémité et un extincteur à une autre extrémité. Tant que le fluorophore et l'extincteur restent à l'intérieur de la sonde oligonucléotidique, aucune fluorescence n'est émise.

Pendant l'amplification de l'ADN, la sonde oligonucléotidique et les amorces se lieront aux brins nouvellement synthétisés. La polymérase va détruire la sonde en raison de l'activité intrinsèque de l'exonucléase 5'→3' et libérer le fluorophore.

L'intensité de la fluorescence est proportionnelle à la quantité de produit généré.

PCR d'assemblage

Assembly PCR ou Polymerase Cycling Assembly a été développé pour produire de nouvelles séquences d'acides nucléiques longues.

La principale différence avec la réaction en chaîne par polymérase traditionnelle est la longueur et la quantité d'amorces.

Pour synthétiser l'oligonucléotide artificiel, la PCR d'assemblage est réalisée sur des amorces longues, jusqu'à 50 nucléotides. Ces amorces ont de courts segments chevauchants et alternent entre les directions sens et antisens couvrant la totalité de la séquence cible.

Au cours des cycles successifs, les amorces s'hybrident par segments complémentaires puis la polymérase augmente la longueur des fragments produisant la longue séquence d'acide nucléique finale.

Typiquement, la phase d'assemblage est suivie d'une réaction en chaîne par polymérase régulière avec des amorces terminales pour augmenter la quantité de produit final.


Dépannage de votre PCR

Que faire lorsque votre PCR tourne mal ? Les FAQ ci-dessous peuvent vous mettre sur la voie d'une PCR réussie.

Pour obtenir des conseils sur la façon de sauver vos expériences de la contamination par PCR, consultez cet article de blog.

Si aucun produit d'amplification n'est obtenu, quels paramètres doivent être considérés en premier lieu lors du dépannage ?

Considérer ce qui suit:

  • Tout d'abord, assurez-vous que tous les composants PCR ont été inclus dans les réactions. Un contrôle positif doit toujours être inclus pour s'assurer que chaque composant est présent et fonctionnel.
  • S'il n'y a eu aucun problème avec la configuration expérimentale, augmentez le nombre de cycles de PCR (3&ndash5 cycles à la fois), jusqu'à 40 cycles. L'augmentation du nombre de cycles peut résoudre les problèmes liés à un modèle en faible abondance ou à l'inaccessibilité du modèle en raison d'impuretés ou d'une faible efficacité d'amorçage des amorces.
  • Si l'augmentation du nombre de cycles n'améliore pas les résultats, les conditions de PCR peuvent être trop strictes pour l'ensemble d'amorces ou le modèle particulier. Envisagez de modifier les conditions PCR comme suit :
    • Abaissez la température de recuit par incréments de 2 degrés.
    • Augmentez le temps de prolongation.
    • Augmentez le montant du modèle. Reportez-vous aux directives fournies avec l'enzyme pour déterminer la quantité optimale de matrice.

    Considérez ces raisons supplémentaires possibles pour l'échec de la PCR :

    • Inhibiteurs de PCR dans l'échantillon de modèle
      Si des inhibiteurs de PCR sont présents, l'utilisation d'une matrice diluée peut augmenter l'efficacité de la PCR. Alternativement, le modèle peut avoir besoin d'être purifié à l'aide d'un kit tel que le kit NucleoSpin Gel et PCR Clean-up. Si la purification de la matrice n'est pas possible, une enzyme qui a une tolérance plus élevée aux impuretés, telle que la polymérase Terra PCR Direct, peut améliorer les résultats.
    • Le modèle a >65% de contenu GC
      Lors de l'amplification à partir de modèles à haute teneur en GC, utilisez une enzyme formulée pour cette condition. Consultez notre guide de sélection PCR pour trouver une enzyme appropriée.
    • Les amorces ne sont pas optimales
      Vérifiez soigneusement vos amorces, redessinez-les si nécessaire. Envisagez également de réamplifier le produit PCR primaire en utilisant des dilutions de 10 fois (1:100 à 1:10 000) à l'aide d'amorces imbriquées.

    Lors de l'utilisation de l'ADN polymérase PrimeSTAR HS, tenez compte de :

    • En utilisant une quantité appropriée de modèle. Si la matrice est de l'ADN génomique humain ou une banque d'ADNc, n'utilisez pas plus de

    Lorsque vous utilisez PrimeSTAR Max DNA Polymerase, tenez compte de :

    • Ajustement du temps d'extension si le mélange réactionnel contient un excès de matrice. Si la quantité de modèle dépasse 200 ng dans un mélange réactionnel de 50 et microlitres, réglez le temps d'extension entre 30 sec/kb et 1 min/kb.
    • Augmenter la concentration des amorces.

    Lorsque vous utilisez l'ADN polymérase SpeedSTAR HS, tenez compte des éléments suivants :

    • Augmenter le temps de prolongation. Bien que le temps d'extension standard soit de 10 sec/kb, le temps d'extension peut être augmenté jusqu'à

    S'il existe des bandes d'amplification non spécifiques, que peut-on faire pour améliorer la spécificité ?

    Toutes les polymérases Takara Bio PCR

    Problème:

    Solution:

    Utilisez l'alignement BLAST pour déterminer si les extrémités 3' des amorces sont complémentaires de sites autres que le ou les sites cibles. Reconcevoir les amorces si nécessaire ou modifier les conditions de PCR.

    Problème:

    Les conditions de PCR ne sont pas suffisamment strictes.

    Solutions:

    • Augmentez la température de recuit par incréments de 2 degrés.
    • Utilisez la PCR de toucher des roues.
    • Utilisez un protocole PCR en deux étapes.
    • Réduisez le nombre de cycles PCR.

    Problème:

    Trop de modèle a été utilisé.

    Solution:

    Réduisez la quantité de 2&ndash5 fois.

    ADN polymérases PrimeSTAR HS et PrimeSTAR Max

    Problème:

    Le temps de recuit est trop long.

    Solution:

    Pour obtenir une amplification spécifique, il est essentiel d'utiliser un temps de recuit court (5 & ndash15 sec) lors de l'exécution de la PCR en trois étapes.

    ADN polymérases PrimeSTAR GXL

    Problème:

    Les amorces ont un T sous-optimalm valeurs.

    Solution:

    Pour amplifier les cibles <1 kb, concevez des amorces avec Tm valeurs >55°C, et utilisez une température de recuit de 60°C. Si l'amorce Tm les valeurs sont <55°C, essayez un temps d'extension plus court entre 5 et 10 sec/kb.

    Takara Ex Taq et Takara LA Taq ADN polymérases

    Problème:

    Recuit d'amorce non spécifique à basse température.

    Solution:

    Les versions à démarrage à chaud de ces enzymes peuvent améliorer les résultats de certaines amorces.

    ADN polymérase SpeedSTAR HS

    Problème:

    Frottis des bandes de produit PCR sur un gel.

    Solution:

    Des temps d'extension excessivement longs peuvent entraîner des bavures. La recommandation générale pour le temps d'extension pour cette enzyme est de 10&ndash20 sec/kb. Si le rendement de la PCR est faible, essayez d'augmenter le nombre de cycles de 5.

    Si la PCR génère un frottis après avoir passé les produits sur un gel, que peut-on faire pour améliorer les résultats ?

    Tout d'abord, déterminez la source du frottis à l'aide de contrôles positifs et négatifs (pas de modèle). Cela peut déterminer si la cause du frottis est une contamination ou un surcyclage, ou si le frottis résulte d'amorces mal conçues ou de conditions PCR sous-optimales.

    Si le contrôle négatif est vierge, il n'y a pas de contamination. Au lieu de cela, les conditions PCR devront être optimisées, tenez compte des éléments suivants lors de l'ajustement des conditions PCR :

    • Réduisez la quantité de modèle.
    • Augmenter la température de recuit.
    • Utilisez la PCR de toucher des roues.
    • Réduisez le nombre de cycles PCR.
    • Redessiner les amorces.
    • Utilisez des amorces imbriquées.
    • Réamplifiez le produit. (Un petit bouchon du gel peut être retiré avec une pointe de micropipette, et l'ADN peut être récupéré en ajoutant le bouchon à 200 µl d'eau, puis en incubant à 37°C. 5 µl de cette solution peuvent être utilisés comme modèle PCR pour re- amplification.)

    Si le contrôle négatif est également étalé, il y a contamination. Vous devrez déterminer la source de cette contamination. Il peut être nécessaire de remplacer les réactifs PCR et de décontaminer les pipettes et votre poste de travail (voir les questions ci-dessous pour plus d'informations sur la contamination).

    Quelles sont les sources de contamination par PCR ?

    Il existe quatre sources principales de contamination par PCR :

    1. La source de contamination la plus courante est le produit de PCR provenant d'amplifications précédentes (appelée « contamination par transfert »). Lorsque de grandes quantités de produit PCR (10 à 12 molécules) sont générées à plusieurs reprises sur une période de temps, le potentiel de contamination augmente.
    2. Une autre source de contamination est l'ADN cloné préalablement manipulé en laboratoire.
    3. Une contamination d'échantillon à échantillon peut également se produire. Cette source de contamination est plus susceptible de se trouver dans les échantillons qui nécessitent un traitement approfondi avant l'amplification.
    4. Les réactions peuvent également être contaminées par de l'ADN exogène dans l'environnement, y compris l'ADN présent sur l'équipement de laboratoire et dans les réactifs utilisés pour l'extraction d'ADN et la PCR.

    Comment éviter la contamination ?

    La sensibilité de la PCR exige que les échantillons ne soient pas contaminés par de l'ADN exogène ou des produits préalablement amplifiés provenant de l'environnement du laboratoire. Nous recommandons que des zones distinctes soient utilisées pour la préparation des échantillons, la configuration PCR et l'analyse post-PCR.

    Une hotte à flux laminaire équipée d'une lampe UV est recommandée pour la préparation des mélanges réactionnels.Deux stations devraient être établies qui sont physiquement séparées l'une de l'autre.

    • Établissez une "zone pré-PCR" réservée à la configuration de la réaction PCR. Aucun élément de la « zone post-PCR » ne doit être introduit dans cette zone, ce qui inclut des éléments tels que des cahiers et des stylos.
    • Établissez une "zone post-PCR" qui est utilisée pour la PCR, la purification de l'ADN amplifié par PCR, la mesure de la concentration d'ADN, l'exécution de gels d'agarose et l'analyse des produits PCR.

    L'équipement doit également être limité à ces zones. La machine PCR et l'appareil d'électrophorèse doivent être situés dans la zone post-PCR. Il est fortement recommandé d'avoir des pipettes et des pointes de pipette avec des filtres aérosols dédiées à la préparation d'échantillons d'ADN et de mélanges réactionnels uniquement. Les recommandations supplémentaires incluent :

    • Disposer d'ensembles séparés de pipettes et d'embouts de pipettes, de blouses de laboratoire, de boîtes à gants et de corbeilles à déchets pour les zones pré-PCR et post-PCR.
    • Étiquetage des articles pré- et post-PCR, afin qu'ils ne soient pas retirés de leur zone de travail désignée.
    • Suivre la règle d'or de la PCR : NE JAMAIS ramener de réactifs, d'équipements ou de pipettes utilisés dans une zone post-PCR dans la zone pré-PCR.
    • Préparer et stocker séparément les réactifs pour la PCR et les utiliser uniquement aux fins prévues. Les réactifs doivent être aliquotés en petites portions et stockés dans des zones désignées selon qu'ils sont utilisés pour des applications pré-PCR ou post-PCR. Les aliquotes doivent être conservées séparément des autres échantillons d'ADN.

    Une réaction de contrôle qui omet l'ADN matrice doit toujours être effectuée pour confirmer l'absence de contamination. De plus, le nombre de cycles de PCR doit être réduit au minimum, car les tests très sensibles sont plus sujets aux effets de la contamination.

    Comment puis-je décontaminer si j'ai une contamination PCR ?

    1. Laissez les pipettes sous la lumière UV dans la hotte de culture cellulaire pendant la nuit. L'irradiation UV favorise la réticulation des résidus de thymidine, endommageant l'ADN résiduel.
    2. Vaporisez les postes de travail/équipements/pipettes avec de l'eau de Javel à 10 %, puis essuyez.
    3. Changer de poste de travail déplacez la zone pré-PCR vers un autre emplacement pré-nettoyé.
    4. N'utilisez pas d'instruments ou de pipettes que vous avez déjà utilisés.

    Que puis-je faire si la PCR génère des erreurs ?

    Pour éviter les erreurs lors de la PCR, nous vous recommandons d'utiliser une enzyme haute fidélité (voir guide de sélection). De plus, veillez à éviter les éléments suivants :

    1. Surcyclage
      Surcyclage des réactions PCR souvent :
      • Modifie le pH de la réaction d'une manière qui déstabilise l'ADN.
      • Augmente la quantité de produit PCR, réduisant ainsi l'efficacité de la polymérase et favorisant les erreurs.
      • Diminue la quantité de dNTP, augmentant ainsi la probabilité d'une mauvaise incorporation de la base en raison de la concentration de dNTP déséquilibrée. (Si vous utilisez les enzymes PCR de Takara Bio, la concentration de dNTP est optimisée à 200 nM, l'augmentation de la concentration de dNTP entraîne une mauvaise incorporation.)
      • Provoque l'accumulation d'ADN simple brin et double brin.
    2. Concentration élevée en Mg 2+
      La concentration de Mg 2+ varie de 1 à 5 mM. L'utilisation d'une concentration élevée en Mg 2+ peut augmenter le rendement, mais peut également avoir un impact sur l'activité de relecture des enzymes. Cependant, la concentration en Mg 2+ doit toujours être supérieure à la concentration en dNTP.
    3. Dommages à l'ADN modèle
      Limitez le temps d'exposition aux UV lors de l'analyse ou de l'excision des produits PCR des gels.

    Que sont les inhibiteurs de PCR ?

    Les impuretés qui interfèrent avec l'amplification par PCR sont appelées inhibiteurs de PCR. Les inhibiteurs de la PCR sont présents dans une grande variété de types d'échantillons et peuvent entraîner une diminution de la sensibilité de la PCR ou même des résultats PCR faussement négatifs. Les inhibiteurs de PCR peuvent avoir des origines inorganiques et organiques (Schrader 2012).

    Les inhibiteurs de PCR inorganiques comprennent :

    • Calcium ou autres ions métalliques qui concurrencent le magnésium
    • EDTA qui se lie au magnésium, réduisant sa concentration

    Certains inhibiteurs de PCR organiques comprennent :

    • Polysaccharides et glycolipides qui imitent la structure des acides nucléiques, interférant avec les amorces se liant à la matrice
    • Mélanine et collagène qui forment un complexe réversible avec l'ADN polymérase
    • Acides humiques qui interagissent avec l'ADN matrice et la polymérase, empêchant la réaction enzymatique, même à de faibles concentrations
    • Urée pouvant conduire à la dégradation de la polymérase

    D'autres composés organiques qui peuvent inhiber la PCR comprennent :

    • Hémoglobine, lactoferrine et IgG dans les échantillons de sang, de sérum ou de plasma
    • Anticoagulants tels que l'héparine
    • Polyphénols, pectine et xylane de plantes
    • Éthanol, alcool isopropylique, phénol ou détergents tels que SDS

    Si des inhibiteurs sont présents dans la préparation de matrice, une dilution de 100 fois de la matrice de départ peut suffisamment diluer l'inhibiteur et permettre l'amplification. Alternativement, la précipitation à l'éthanol de la matrice peut être nécessaire pour résoudre le problème.

    Les références

    Schrader, C., et al. Inhibiteurs de PCR et occurrence, propriétés et élimination. J Appl Microbiol. 113:1014&ndash1026 (2012).

    Qu'est-ce que le surcyclage PCR ? Comment savoir si mon produit est surcyclé ?

    Le surcyclage PCR se produit lorsque le cycle dépasse la phase exponentielle d'amplification. Le surcyclage se produit lorsque les événements suivants se produisent pendant la PCR :

    • Épuisement des substrats (dNTP ou amorces).
    • Les réactifs (dNTP ou enzymes) ne sont plus stables à la température de dénaturation.
    • La PCR polymérase est inhibée par le produit (pyrophosphate, ADN duplex).
    • Compétition pour les réactifs (dNTP et amorces) par des produits non spécifiques.
    • Abaissement du pH de la réaction.
    • Dénaturation incomplète/séparation des brins des produits à des concentrations élevées de produits.

    L'indicateur de surcyclage PCR est un frottis de fond intense avec des bandes indiscernables lorsque la réaction est résolue sur un gel d'agarose. Il est toujours recommandé d'effectuer un test préliminaire pour déterminer le nombre minimal de cycles PCR nécessaires pour obtenir un produit suffisant. Le produit PCR reste dans la phase linéaire d'amplification si le rendement en produit est sensiblement augmenté tous les 3&ndash5 cycles. On trouve que surcyclé L'ADNc ne produit pas de modèle approprié pour une application en aval.

    Quels types de mutations peuvent être causés par la PCR ?

    Les polymérases PCR peuvent introduire différents types de mutations, y compris des substitutions, des délétions et des insertions à base unique. Les substitutions de bases sont généralement causées par une mauvaise incorporation d'un dNTP incorrect lors de la synthèse d'ADN.

    Les polymérases peuvent générer des mutations à des emplacements où un ou plusieurs nucléotides sont perdus ou gagnés. La fréquence de ce type de mutation peut dépendre de la séquence et peut être plus élevée dans les séquences hautement répétitives. La mutation la plus courante est la perte d'un seul nucléotide, qui pourrait être le résultat d'un désalignement matrice-amorce au sein d'une séquence homopolymère répétitive. Des réarrangements d'ADN peuvent également se produire lorsque la polymérase termine la synthèse sur un brin d'ADN et continue la synthèse après que l'amorçage se soit produit sur un brin complémentaire (c'est-à-dire, une PCR à commutation de brin ou à saut). Ce type de mutation a lieu lorsqu'il existe une forte homologie entre différentes régions de l'ADN. Une matrice d'ADN excessive dans la réaction peut également favoriser ce type de mutation.

    Quels facteurs contribuent aux mutations introduites par PCR ?

    Les facteurs suivants peuvent contribuer aux mutations introduites par PCR :

    • Concentrations de dNTP déséquilibrées
      Des quantités inégales des quatre dNTP peuvent augmenter la substitution de base jusqu'à huit fois. L'utilisation de concentrations égales des quatre dNTP est essentielle pour réduire le taux d'erreur de la polymérase.
    • Concentration élevée en enzymes
    • Longs temps d'incubation
    • Absence d'activité exonucléase 3'&rarr5'
    • Concentration de magnésium
      La fidélité est maximale lorsque la concentration de Mg 2+ est équimolaire à la concentration totale des dNTP. La fidélité diminue lorsque la concentration de cations divalents libres augmente.
    • pH de la réaction
      L'abaissement du pH de la réaction de trois unités peut augmenter les substitutions de bases jusqu'à 60 fois. Un pH bas (<6.0) peut entraîner une perte spontanée de purine.
    • Dommages à l'ADN
      Des dommages à l'ADN peuvent se produire à des températures élevées, augmentant éventuellement le taux de mutation. Une mutation fréquente est la désamination de la cytosine pour produire de l'uracile.
    • La présence d'étirements A dans les séquences d'amorces
    • Surcyclage
      Le taux d'erreur est augmenté lorsque la concentration d'ADN est augmentée pendant les cycles de PCR finaux. Le nombre total de cycles doit être réduit au minimum pour produire le produit PCR souhaité sans erreurs.

    Que sont les artefacts PCR ?

    Les artefacts PCR courants sont les suivants :

    • Dimères d'amorces
      Les dimères d'amorces sont formés par auto-complémentarité à l'extrémité 3' des amorces d'amplification. Les dimères d'amorces sont suspectés si le produit est produit dans une réaction sans matrice (témoin négatif). Pour éviter les dimères d'amorces, les amorces ne devraient pas avoir de complémentarité à leurs extrémités 3'.
    • Produits PCR chimériques
      Les produits de PCR chimériques peuvent être causés par un modèle incomplètement étendu. En d'autres termes, une matrice simple brin qui n'a pas été complètement répliquée en raison d'une terminaison prématurée de la polymérase peut s'hybrider à une matrice partiellement homologue. Cela crée des produits PCR chimériques. Pour minimiser les chimères, utilisez le moins de cycles d'amplification PCR possible.
    • Biais PCR
      Le biais de PCR se produit lorsque certaines séquences sont amplifiées plus efficacement que d'autres en raison de la liaison préférentielle par les amorces de PCR. Si une séquence est amplifiée 10 % de plus qu'une autre dans un cycle, elle sera 17,4 fois plus abondante après 30 cycles. Pour réduire le biais de PCR, utilisez un taux de rampe élevé entre les étapes de dénaturation et de recuit et utilisez des températures de recuit basses. Les longues périodes d'extension (>180 sec) doivent être évitées.
    • dérive de la PCR
      La dérive de la PCR est due à la fluctuation stochastique des interactions des réactifs PCR, en particulier dans les premiers cycles lorsqu'une très faible concentration de matrice existe. Cet artefact est observé dans les dosages multiplex, où une perte de sensibilité est causée par les interactions entre différents ensembles d'amorces. Il est important de concevoir soigneusement des amorces pour ces types d'essais.
    • La PCR génère des produits de poids moléculaire élevé qui migrent à peine à travers le gel d'agarose
      Il n'y a pas de bonne explication pour cet artefact. La plupart des chercheurs supposent que cela est dû au surcyclage, car dans les derniers stades de la PCR, les molécules simple et double brin s'accumulent. L'accumulation de telles molécules simple brin peut créer des hétéroduplex en compétition avec les amorces. Une dénaturation incomplète dans les étapes ultérieures, lorsqu'il y a une forte concentration de produits PCR, empêche la séparation des brins d'ADN, et ainsi un amplicon nouvellement formé peut rester lié à la matrice précédemment faite. Ce processus pourrait se répéter, piégeant les produits PCR dans un réseau de molécules.

    Une autre explication de l'origine des frottis de poids moléculaire élevé est l'extension partielle des matrices au cours des cycles de PCR initiaux. Des extensions partielles pourraient être générées en sautant des artefacts lorsqu'une amorce ou un ADN simple brin s'hybride et s'étend à partir d'un site d'amorçage, puis s'hybride partiellement à un segment homologue ailleurs (voir Produits de PCR chimérique, ci-dessus). Les molécules partiellement étendues peuvent agir comme de nouvelles amorces, car elles contiennent un 3'-OH libre, et pourraient générer des molécules chimériques qui combinent le site d'amorçage initial et le site de "saut".

    Enfin, ce type d'artefact peut également être généré lorsqu'un modèle brut est utilisé pour la PCR. Les produits amplifiés directement à partir de tissus animaux ou végétaux peuvent se retrouver piégés dans les débris cellulaires, ce qui les empêche de migrer dans le gel. Ce problème peut être résolu par digestion à la protéinase K du produit de PCR amplifié :

    • Avant de charger vos échantillons sur un gel, ajoutez 1 µl du tampon de chargement contenant de la protéinase K à 4 µl de la réaction PCR.

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    Réaction en chaîne par polymérase (PCR) | Biotechnologie

    L'article mentionné ci-dessous fournit un guide du débutant sur la réaction en chaîne par polymérase (PCR). Après avoir lu cet article, vous découvrirez : 1. Histoire de la PCR 2. Le principe de la réaction en chaîne par polymérase 3. Exigences de la PCR 4. Le cycle de réaction PCR 5. Analyse des produits PCR 6. Candidatures 7. Précautions et Inconvénients 8. Modifications.

    1. Histoire de la PCR
    2. Le principe de la réaction en chaîne par polymérase
    3. Exigences de la PCR
    4. Le cycle de réaction PCR
    5. Analyse des produits PCR
    6. Applications de la PCR
    7. Précautions et inconvénients
    8. Modifications

    1. Historique de la PCR :

    L'idée de la PCR est attribuée à Kary-Mullis qui était chercheur dans les années 1980 dans une société de biotechnologie californienne appelée Cetus. Mullis et cinq autres chercheurs du département de génétique humaine de Cetus ont démontré que des amorces oligonucléotidiques pouvaient être utilisées pour amplifier spécifiquement des segments définis d'ADN génétique (ou ADNc). Mullis a été co-lauréat du prix Nobel de chimie en 1993.

    2. Le principe de la réaction en chaîne par polymérase :

    La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une amplification enzymatique induite par une amorce de séquences d'ADN spécifiquement clonées ou génomiques. Dans ce processus, nous prenons l'ADN avec une séquence cible que nous voulons amplifier, le dénaturons en augmentant la température, puis utilisons une amorce spécifique à la séquence pour l'amplification de notre séquence cible à l'aide d'une ADN polymérase thermostable.

    Dans cette technique, nous essayons de reproduire un environnement artificiel dans des conditions in vitro dans lesquelles la séquence d'ADN cible subit plusieurs cycles de réplication pour produire une énorme copie de notre gène cible.

    Le processus PCR comporte trois étapes fondamentales :

    Étape 1:

    Dénaturation de la matrice d'ADN double brin en augmentant la température à 94 – 98°C pendant 30 secondes pendant 2 minutes.

    Étape 2:

    Recuit de deux amorces oligonucléotidiques sur la plaque simple brin en abaissant la température à 50 - 65°C.

    Étape 3:

    Extension enzymatique des amorces pour produire des copies pouvant servir de modèles dans les cycles suivants.

    3. Exigences de la PCR :

    (a) Modèle d'ADN :

    La molécule d'ADN originale qui doit être copiée est appelée matrice d'ADN et le segment de celle-ci qui sera réellement amplifié est connu sous le nom de séquence cible. Une trace de la matrice d'ADN est suffisante. Ceci peut être obtenu par l'une quelconque des techniques d'isolement d'ADN discutées précédemment.

    (b) Amorces PCR :

    Deux amorces PCR sont nécessaires pour initier la synthèse d'ADN. Ce sont de courts morceaux d'ADN simple brin qui correspondent aux séquences à chaque extrémité du segment d'ADN cible. Les amorces PCR sont fabriquées par synthèse chimique d'ADN.

    Il existe plusieurs programmes informatiques disponibles pour suggérer des amorces appropriées pour le processus de PCR, et certains des guides généraux sont répertoriés ci-dessous :

    Les amorces plus courtes ont tendance à s'hybrider à la séquence non cible de la matrice d'ADN. Cela se traduira par la production de copies d'ADN ayant une séquence non cible. Plus la complexité de l'ADN matrice est grande, plus cela a de chances de se produire.

    Ainsi, une amorce courte peut offrir une spécificité suffisante lors de l'amplification à l'aide d'une matrice simple telle qu'un petit plasmide, mais une amorce longue peut être requise lors de l'utilisation d'ADN génomique eucaryote comme matrice. En pratique, 20 à 30 nucléotides sont généralement satisfaisants.

    Les amorces n'ont pas besoin de correspondre complètement à la matrice, bien que l'extrémité 3 & 8242 de l'amorce doive être correctement appariée à la matrice, sinon la polymérase ne pourra pas l'étendre. Il est souvent avantageux d'avoir C ou G comme nucléotide terminal 3 & 8242. Cela rend la liaison de l'extrémité 3 & 8242 de l'amorce au modèle plus stable qu'elle ne le serait avec A ou T à l'extrémité 3 & 8242.

    3. Température de fusion :

    Les températures auxquelles les deux amorces peuvent s'associer à la matrice doivent être relativement similaires pour s'assurer qu'elles se lient toutes les deux à peu près en même temps que les températures sont en train de baisser pendant le recuit. La similitude des températures de fusion signifie probablement que les amorces ont une composition nucléotidique similaire.

    4. Structure secondaire interne :

    Ceci doit être évité afin d'éviter que l'apprêt ne se replie sur lui-même et ne soit pas disponible pour se lier au modèle.

    5. Recuit amorce-amorce :

    Il est également important d'éviter que les deux amorces puissent s'hybrider l'une à l'autre. L'extension par l'ADN polymérase de deux prim­ers auto-annelés conduit à la formation d'un dimère d'amorce.

    (c) ADN polymérase thermostable :

    L'enzyme ADN polymérase est nécessaire pour fabriquer les copies d'ADN. Le fragment de Klenow a été la première enzyme ADN polymérase utilisée en PCR. Le fragment de Klenow est un grand fragment de protéine produit lorsque l'ADN polymérase I d'E. coli est clivée enzymatiquement par la protéase subtilisine.

    Après modification enzymatique, il conserve l'activité polymérase 5′-3′ et l'activité exonucléase 3′ → 5′ pour le re­moval des nucléotides pré-codants et la preuve­reading, mais perd son activité exonucléase 5′ → 3′.

    Le fragment de Klenow n'a pas réussi à jouer un rôle efficace en tant qu'enzyme polymérase pour son manque de stabilité à haute température. Comme nous savons que la procédure PCR implique plusieurs étapes de température, dans cette situation, nous avons dû reconstituer le frag­ment Klenow au cours de chaque cycle.

    Pour résoudre ce problème, une ADN polymérase résistante à la chaleur était nécessaire. Cela provenait à l'origine de bactéries résistantes à la chaleur vivant dans des sources chaudes à des températures allant jusqu'à 90 ° C. Aujourd'hui, la Taq poly­merase de Thermusaquaticus est l'enzyme ADN polymérase PCR la plus largement utilisée. Il est généralement produit par expression du gène dans E. coli.

    La thermo-stabilité de l'enzyme Taq aide à sa purification après expression dans E. coli, car les protéines contaminantes d'E. coli peuvent être désactivées par chauffage. L'enzyme a des activités d'ADN polymérase 5′-3′ et 5′-3′ d'exonucléase. Il polymérisera environ 50-60 nucléotides par seconde. Cependant, l'en­zyme a un certain nombre de propriétés qui peuvent être désavantageuses.

    1. La Taq Polymerase n'a pas d'activité de lecture d'épreuves (exonucléase 3′-5′) :

    Par conséquent, environ un nucléotide sur 104 incorporé est incorrect et les produits individuels de la PCR seront une population hétérogène.

    2. La Taq Polymerase a une processivité relativement faible :

    Cela signifie qu'il est susceptible de se dissocier de la matrice avant d'avoir synthétisé un long morceau d'ADN.

    3. La Taq Polymerase n'est pas entièrement stable à la chaleur :

    Il a une demi-vie d'environ 40 min à 95°C, ce qui signifie qu'il y aura une perte d'activité significative sur les 30 cycles environ utilisés dans une expérience PCR typique. Il peut donc être nécessaire d'ajouter plus d'enzyme au cours d'un exercice.

    4. La Taq Polymerase incorpore un résidu ex­tra :

    Ceci est incorporé à l'extrémité 3 & 8242 de la molécule synthétisée et n'est pas codé par modèle. Un certain nombre de polymérases sont disponibles à partir d'autres espèces de Thermus. Ceux-ci comprennent les enzymes Tfl et Tth de Thermusflavus et Thermusthermophilus respectivement.

    Ceux-ci n'ont généralement pas d'activité de relecture 3′-5′. Les polymérases sont également disponibles à partir d'autres genres de bactéries (y compris les archaebactéries), et bon nombre de ces enzymes ont une activité de relecture 3 & 8242-5 & 8242 (ce qui signifie également qu'elles n'ajoutent généralement pas de nucléotides terminaux qui ne sont pas dirigés par une matrice).

    Les enzymes de relecture incluent Tli de Thermococcuslitoraiis et Pfu de Pyrococcusfuriosus. Ces bactéries marines se développent généralement à des températures encore plus élevées que Thermusaquaticus, et les polymérases sont plus thermostables que l'enzyme Taq.

    (d) Désoxy nucléotides triphosphates :

    Un apport de quatre désoxynucléotides triphos­phates, dATP, dCTP, dGTP et dTTP, est nécessaire à la polymérase pour fabriquer le nouvel ADN.

    (e) Machine PCR :

    Enfin, nous avons besoin d'une machine PCR pour continuer à changer la température. Le processus de PCR nécessite un cycle à travers plusieurs températures différentes. Pour cette raison, les machines PCR sont parfois appelées thermo-cycleurs.

    4. Le cycle de réaction PCR :

    La PCR est une réaction en chaîne car les brins d'ADN nouvellement synthétisés serviront de matrice pour une synthèse d'ADN ultérieure au cours du cycle suivant. Après 25 cycles de synthèse d'ADN, les produits de la PCR comprendront, en plus de l'ADN de départ, environ 10 5 copies de la séquence cible spécifique.

    La PCR consiste en une série de cycles de trois réactions successives :

    Étape de dénaturation :

    Cette étape est le premier cycle régulier et consiste à chauffer la réaction à 94-98°C pendant 20-30 secondes. Il provoque la fusion de la matrice d'ADN en perturbant les liaisons hydrogène entre les bases complémentaires, produisant des molécules d'ADN simple brin.

    Étape de recuit :

    La température de réaction est abaissée à 50-65°C pendant 20-40 secondes permettant l'annelage des amorces à la matrice d'ADN simple brin. En règle générale, la température de recuit est d'environ 3 à 5 degrés Celsius en dessous du Tm des amorces utilisées.

    Le Tm peut être déterminé expérimentalement ou calculé à partir de la formule suivante :

    Tm = (4 x [G + C]) + (2 x [A + T])°C

    Des liaisons hydrogène ADN-ADN stables ne se forment que lorsque la séquence d'amorce correspond très étroitement à la séquence matrice. La poly­merase se lie à l'hybride amorce-matrice et commence la synthèse d'ADN.

    Étape d'extension/d'allongement :

    La température à cette étape dépend de l'ADN polymérase utilisée. La Taq polymérase a sa température d'activité optimale à 75-80°C, et couramment une température de 72°C est utilisée avec cette enzyme. À cette étape, l'ADN polymérase synthétise un nouveau brin d'ADN complémentaire au brin de matrice d'ADN en ajoutant des dNTP complémentaires à la matrice dans la direction 5 & 8242 à 3 & 8242.

    Le temps d'extension dépend à la fois de l'ADN polymérase utilisée et de la longueur du fragment d'ADN à amplifier. En règle générale, à sa température optimale, l'ADN polymérase polymérase mille bases par minute.

    Dans des conditions optimales, c'est-à-dire s'il n'y a pas de limitations dues à des substrats ou des réactifs limitants, à chaque étape d'extension, la quantité d'ADN cible est doublée, conduisant à une amplification exponentielle (géométrique) du fragment d'ADN spécifique.

    Par exemple, si l'on part d'une seule molécule d'ADN double brin, après 20 cycles, le nombre de molécules synthétisées par PCR devient 1吆 6 , et après 30 cycles, le nombre de molécules d'ADN augmente à 1吆 9 .

    Ce nombre peut être calculé à l'aide de la formule suivante :

    où MF est le nombre final de molécules d'ADN produites par PCR, MF est la quantité initiale de molécules d'ADN, et n est le nombre de cycles PCR.

    Allongement final :

    Cette étape unique est occasionnellement effectuée à une température de 70 à 74 °C pendant 5 à 15 minutes après le dernier cycle de PCR pour s'assurer que tout ADN simple brin restant est complètement étendu.

    5. Analyse des produits PCR :

    La PCR est souvent utilisée comme technique pour obtenir des informations sur la matrice d'ADN portant une séquence cible spécifique. La recherche en biotechnologie dépend largement de la PCR dans diverses situations. Il existe donc plusieurs méthodes pour analyser les produits de la PCR.

    Les trois techniques suivantes sont importantes :

    (a) Électrophorèse sur gel des produits PCR :

    Les résultats finaux de la plupart des expériences de PCR sont confirmés en soumettant une partie du mélange réactionnel amplifié à une électrophorèse sur gel d'agarose. Cela peut nous renseigner sur la validité de l'expérience PCR. Si la bande attendue lors de la visualisation du gel est absente, ou si des bandes supplémentaires sont présentes, quelque chose s'est mal passé et l'expérience doit être répétée.

    Dans certains cas, l'électrophorèse sur gel d'agarose est utilisée non seulement pour déterminer si une expérience PCR a fonctionné, mais également pour obtenir des informations supplémentaires. Nous pouvons également déterminer la présence d'un site de restriction dans l'ADN matrice en soumettant le produit de PCR à une endonucléase de reshystriction avant l'électrophorèse.

    Ce protocole est un type d'analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP) qui a une importance immense dans la construction de cartes génomiques et l'étude des maladies génétiques. L'analyse électrophorétique du produit PCR peut également nous aider à identifier la mutation d'insertion ou de déshyletion dans la région amplifiée.

    (b) Clonage de produits PCR :

    Au cours de l'expérience de clonage, nous utilisons directement l'aide de la PCR. Si le gène de l'intérêt est en très petite quantité, alors nous devons l'amplifier. Cela se fait à l'aide de la PCR qui produit suffisamment de copies de notre ADN cible pour que nous puissions nous permettre de commencer l'expérience.

    (c) Séquençage des produits PCR :

    Le séquençage du produit PCR est effectué à l'aide d'un séquenceur automatisé. Il n'y a pas besoin de radio-étiquetage et d'autoradiographie. Il s'agit d'un moyen amélioré de séquencer l'ADN en raison de sa vitesse et parce qu'il peut être analysé par ordinateur plutôt que par une personne.

    La PCR a un certain nombre d'applications, en particulier lorsque la vitesse et le nombre d'échantillons à traiter sont importants ou lorsque la quantité d'ADN disponible est très limitée. Voici quelques-unes des applications.

    Une. Séquençage ADN:

    La PCR en présence de di-désoxynucléoside triphosphates (ddNTP), utilisée pour le séquençage de l'ADN, permet aux réactions de séquençage de l'ADN d'être exécutées avec succès avec de très petites quantités de matrice.

    B. Diagnostique:

    La PCR est utile en tant qu'outil de diagnostic, par exemple, dans l'identification de traits génétiques spécifiques ou pour la détection de pathogènes ou de contaminants alimentaires. L'une des premières applications de la PCR au diagnostic génétique a été l'anémie falciforme.

    C. Légal:

    La capacité d'amplifier l'ADN de régions du génome hautement polymorphes (et variables d'un individu à l'autre) en commençant par des échantillons contenant de très petites quantités d'ADN (p. applications dans le travail médico-légal.

    Ré. Génétique des populations actuelle :

    Il permet de déterminer les fréquences d'allèles particuliers dans une grande collection d'individus. Un avantage particulier de l'utilisation de la PCR dans les études de génétique des populations est que, avec des amorces spécifiques conçues de manière appropriée, il peut être possible d'amplifier l'ADN d'un organisme qui ne peut pas être séparé des autres, comme une souche bactérienne particulière dans une population mixte.

    (Ces amorces s'hybrideront à l'ADN cible de l'organisme d'intérêt, mais pas à l'ADN des autres.)

    E. Archéologie et évolution :

    La PCR peut être utilisée avec du matériel ancien ainsi qu'avec des échantillons plus résistants, et il est souvent possible d'amplifier l'ADN ancien à partir de spécimens de musée et de vestiges archéologiques. On utilise principalement de l'ADN mitochondrial ou de l'ADN chloroplastique. Cela permet de faire des inférences sur les origines de populations ou d'espèces particulières.

    7. Précautions et Inconvénients :

    Je. Taille:

    La taille des fragments qui peuvent être amplifiés est limitée par la processivité de la polymérase utilisée. L'utilisation d'un mix­ture de polymérases qui inclut une enzyme de preuve­reading augmente la taille du pro­duct qui peut être obtenu (jusqu'à 10 kpb ou plus), car les nucléotides mal incorporés peuvent être éliminés plutôt que de provoquer une terminaison de chaîne.

    Ii. Amplification de la mauvaise séquence :

    La PCR dépend de la capacité des amorces à s'hybrider à la séquence correcte, et cela dépend des conditions d'hybridation (concentration ionique, température, etc.) et de la séquence réelle (ou des séquences si des sites mixtes sont inclus) des amorces.

    Il est possible que les amorces s'hybrident au “mauvais” partie de l'ADN cible, par complémentarité aléatoire. Si cela se produit et que les amorces s'hybrident dans la bonne orientation les unes aux autres (c'est-à-dire en dirigeant la synthèse l'une vers l'autre) et sur des sites qui ne sont pas trop éloignés, le résultat est l'amplification d'une séquence autre que celle souhaitée.

    La possibilité d'un annelage incorrect peut être évitée en utilisant des amorces plus longues, qui seront plus spécifiques dans leurs sites d'hybridation. L'augmentation de la température et l'ajustement de la concentration en ions magnésium (qui stabilisent la liaison amorce-modèle) peuvent être utilisés pour augmenter la spécificité de la liaison amorce.

    Iii. Contamination:

    En raison de la sensibilité extraordinaire de la PCR, il existe un risque particulier de contaminer l'échantillon d'ADN à amplifier avec du matériel étranger. Ceci est particulièrement important lors de l'utilisation de matériaux ne contenant que de petites quantités d'ADN, comme pour les travaux archéologiques.

    La contamination peut être d'origine de laboratoire (par exemple, à partir d'aérosols créés par pipetage de solutions contenant des séquences d'ADN apparentées, y compris du matériel préalablement amplifié par PCR) ou d'origine externe (peut-être par contamination bactérienne, fongique ou humaine du tissu de l'échantillon).

    La contamination en laboratoire peut être minimisée par des précautions telles que l'utilisation et la conception prudentes des pipettes, la séparation des étapes pré-PCR et post-PCR d'une expérience dans différentes pièces. La contamination par d'autres sources peut être réduite en manipulant et en préparant soigneusement un échantillon avant l'amplification.

    Iv. Hétérogénéité de la séquence :

    L'amplification peut donner lieu à un mélange de molécules de séquences légèrement différentes.

    Un mélange peut survenir pour plusieurs raisons :

    Si l'ADN matrice provient d'un individu hétérozygote au locus en question, chacun des allèles présents doit être représenté en quantités similaires dans les produits PCR.

    (b) Hétérogénéité de la population :

    Si l'ADN du modèle provient de plusieurs individus plutôt que d'un seul, l'hétérogénéité de la population peut entraîner une hétérogénéité des produits.

    (c) Dommages à l'ADN et erreur de polymérase :

    L'hétérogénéité peut également résulter de dommages à l'ADN avant l'amplification, surtout si l'échantillon n'a pas été soigneusement conservé. Par conséquent, cela est particulièrement susceptible d'être un problème avec le matériel archéologique et médico-légal.

    V. PCR sautée :

    Lorsque l'ADN dégradé est amplifié, il se peut qu'une molécule d'échantillon donnée ne soit pas assez longue pour couvrir toute la distance entre les deux sites d'amorçage. Le résultat du premier cycle de synthèse serait l'extension de l'amorce jusqu'à l'extrémité d'une molécule fragmentée, mais pas jusqu'au deuxième site d'amorce.

    Cependant, lors d'un cycle de synthèse ultérieur, le produit d'amplification tronqué peut s'hybrider à un fragment d'ADN différent qui contient la région restante intacte. Cela permettrait alors la synthèse du produit PCR complet. C'est ce qu'on appelle le saut PCR. Il est donc parfois possible de générer des produits PCR plus longs que n'importe quelle molécule modèle individuelle. Cela peut être avantageux lors de l'amplification d'un ADN très dégradé.

    8. Modifications :

    Une. PCR de démarrage à chaud :

    Dès que les réactifs PCR ont tous été mélangés, il est possible que l'ADN polymérase commence la synthèse. Cela peut se produire pendant que le mélange de réaction est chauffé pour la première fois et qu'il est à une température suffisamment basse pour permettre un recuit non spécifique de l'amorce à la matrice, générant une gamme de produits non spécifiques.

    Ce problème serait prévenu si la synthèse de l'ADN ne pouvait avoir lieu avant que le premier cycle n'ait atteint sa température maximale. C'est la base de la PCR hot-start. Dans la forme la plus simple, l'ADN polymérase n'est pas ajoutée aux tubes de réaction jusqu'à ce qu'ils aient atteint la température de fusion de l'ADN du premier cycle. Ceci est satisfaisant lorsque de petits nombres d'échantillons sont traités, mais pas avec de grands nombres.

    B. PCR Touch-Down :

    La température d'annelage utilisée dans la PCR conventionnelle est généralement de plusieurs degrés en dessous du maximum auquel les amorces peuvent rester liées à la plaque, pour assurer une liaison stable. Cependant, cette utilisation d'une température plus basse permet une petite quantité de mésappariement entre les amorces et la matrice, ce qui peut permettre aux amorces de se lier à des sites incorrects et de générer des produits parasites.

    Les effets de ceci peuvent être réduits avec la PCR touch-down. Dans ce cas, une température de recuit élevée est initialement utilisée (à laquelle même une liaison et une fermeture correctes peuvent ne pas être possibles). La température de recuit est réduite dans les tours suivants. Il viendra donc un moment où un recuit amorce-modèle correctement apparié est juste possible, mais l'appariement incorrect ne l'est pas et les produits souhaités seront les plus abondants.

    C. PCR imbriquée :

    Ici, deux PCR successives sont réalisées. La première PCR utilise un modèle conventionnel. Les produits de la première PCR sont ensuite utilisés comme matrice pour la seconde PCR, avec des amorces conçues pour s'hybrider dans le produit souhaité de la première PCR.

    Bien que la première PCR puisse générer des produits non spécifiques en plus des produits souhaités, il est peu probable que les produits non spécifiques contiennent également des sites d'hybridation pour les deux amorces utilisées dans la seconde PCR. Ainsi, seuls les produits souhaités de la première PCR sont susceptibles d'être des matrices appropriées pour la seconde.

    Ré. PCR inverse :

    Il est possible d'organiser l'amplification de séquences en dehors des amorces, dans une technique appelée PCR inverse (IPCR). Dans cette technique, l'échantillon d'ADN est d'abord coupé avec une enzyme en dehors de la région dont la séquence est déjà connue.

    Les molécules linéaires résultantes sont ensuite circularisées, par ligature dans des conditions favorisant les réactions intermoléculaires. Une seconde digestion de restriction est ensuite effectuée, en utilisant une enzyme de coupure dans la région de séquence connue.

    Le résultat est maintenant que le premier fragment contenant cette séquence a été retourné à l'envers, laissant la séquence connue à l'extérieur et le matériel qui la flanquait auparavant à l'intérieur. Des amorces complémentaires à la séquence connue à l'extérieur de la molécule peuvent maintenant être utilisées pour amplifier la région d'intérêt entre elles.

    E. PCR transcriptase inverse :

    Il est souvent pratique d'amplifier des molécules d'ARN, peut-être comme précurseur de leur clonage, ou d'estimer l'abondance d'un ARNm particulier dans un échantillon. Cela se fait généralement en ayant un cycle de transcription inverse, en utilisant une enzyme transcriptase inverse et une seule amorce, pour fabriquer un seul brin d'ADNc avant la PCR elle-même.

    L'amorce pour la transcription inverse pourrait être oligo-dT pour la synthèse générale d'ADNc à partir de messages polyadénylés, ou elle pourrait être spécifique à un message particulier.

    F. PCR in situ :

    Il est possible d'effectuer une PCR en utilisant des tissus perméabilisés, tels que des coupes minces sur une lame de microscope. Cela nécessite une machine PCR spécialement adaptée pour accueillir la lame. Si le produit de PCR peut être détecté (peut-être par hybridation, également in situ), alors cela permet d'identifier où dans le tissu se trouve l'acide nucléique cible.

    G. PCR asymétrique :

    En réduisant la quantité de l'une des deux amorces, il est possible d'organiser une amplification préférentielle de l'un des brins, résultant en une préparation d'ADN simple brin, qui a un certain nombre d'utilisations en biologie moléculaire. L'amplification préférentielle d'un brin de cette manière est connue sous le nom de PCR asymétrique.

    H. PCR ancrée :

    La PCR ancrée est appliquée lorsqu'un seul morceau de séquence (et par conséquent, un site d'amorçage) pour la région d'intérêt est connu. Le but est d'attacher la région à amplifier à un morceau de séquence connue puis de l'utiliser comme deuxième site d'amorçage.

    Il y a deux façons de le faire le plus facilement. L'une consiste à fragmenter l'ADN échantillon et à le ligaturer à des molécules de séquence connue, telles qu'un vecteur. Cette séquence connue sert de base à la conception de l'une des deux amorces PCR. La deuxième méthode consiste à ajouter des queues par voie enzymatique à l'échantillon d'ADN ou aux molécules produites après le premier cycle de synthèse.

    Je. PCR en émulsion :

    Dans une PCR classique, les réactions sont effectuées à l'intérieur de tubes en plastique. Il est possible d'incorporer tous les réactifs à l'intérieur de gouttelettes lipidiques et d'effectuer une PCR à une échelle beaucoup plus petite. Cela présente certains avantages. Il est possible d'augmenter et de diminuer la température des petites gouttelettes très rapidement.

    De plus, si chaque gouttelette contient une seule molécule matrice au départ, alors tous les produits d'une gouttelette individuelle résultent de l'am­plification d'une seule molécule matrice. La méthode est également appelée PCR en gouttelettes.

    J. Amplification isotherme :

    Le chauffage et le refroidissement répétés requis par la PCR limitent la rapidité avec laquelle le processus peut être effectué. L'amplification isotherme à médiation par boucle (LAMP) a été développée, qui permet aux matrices d'être amplifiées à une température constante (généralement autour de 65°C).

    Il utilise une ADN polymérase avec une activité de déplacement de brin et évite le besoin de chauffer à des températures élevées. Cette méthode est utilisée pour la détection d'agents pathogènes en dehors des laboratoires spécialisés.

    K. Pcr en temps réel:

    Il est possible d'utiliser la PCR pour estimer l'abondance d'une molécule d'acide nucléique particulière dans un échantillon. Cela peut être fait par PCR en temps réel. Ceci peut être fait de deux façons.

    Dans le premier, un colorant fluorescent de liaison à l'ADN double brin (ADNdb) (tel que le vert SYBR) est présent dans la PCR. Au fur et à mesure que le produit d'ADNdb s'accumule, la quantité de fluorescence du colorant augmente, ce qui peut être désactivé.

    L'expérience nécessite une machine PCR qui est également équipée d'une installation de mesure de fluorescence. Étant donné que la méthode détecte simplement l'ADNdb, elle mesure la quantité de produit PCR à un moment donné, qu'il provienne ou non de la bonne région.

    La seconde approche de la PCR en temps réel permet la détection d'un produit spécifique, plutôt que l'ADNdb en général, et utilise un oligonucléotide sonde spécialement synthétisé.Cette sonde est conçue pour s'hybrider dans la région à amplifier et porte un colorant reporter fluorescent à une extrémité et un extincteur à l'autre extrémité de la molécule.

    Si l'extincteur et le rapporteur sont à proximité (c'est-à-dire attachés au même oligonucléotide), alors l'extincteur arrête la fluorescence du rapporteur.

    Au cours de la PCR, la sonde s'hybridera à l'ADN simple brin dans la région cible. Lorsque la poly­merase rencontre la sonde recuite, l'activité exonucléase 5&8242-3&8242 de l'enzyme dégrade la sonde, libérant le rapporteur de l'extincteur. Ainsi, le rapporteur fluorescent s'accumule au cours de la PCR. Ce type de mécanisme de PCR est illustré dans le schéma ci-dessus.


    PCR (réaction en chaîne par polymérase)

    Disons que vous avez un échantillon biologique contenant des traces d'ADN. Vous voulez travailler avec l'ADN, peut-être le caractériser par séquençage, mais il n'y a pas grand-chose avec quoi travailler. C'est là qu'intervient la PCR. La PCR est l'amplification d'une petite quantité d'ADN en une plus grande quantité. C'est simple, rapide et automatisé. De plus grandes quantités d'ADN signifient des résultats plus précis et plus fiables pour vos techniques ultérieures.

    La PCR peut être utilisée pour créer une « empreinte digitale » ADN qui est unique à chaque individu. Ces empreintes génétiques peuvent être utiles dans des applications réelles liées à la paternité/maternité, à la parenté et aux tests médico-légaux.

    La technique a été développée par le biochimiste lauréat du prix Nobel Kary Mullis en 1984 et est basée sur la découverte de l'activité biologique à haute température des ADN polymérases trouvées dans les thermophiles (bactéries qui vivent dans les sources chaudes).

    La plupart des ADN polymérases (enzymes qui fabriquent un nouvel ADN) ne fonctionnent qu'à basse température. Mais à basse température, l'ADN est étroitement enroulé, de sorte que les polymérases n'ont pas beaucoup de chance d'atteindre la plupart des parties des molécules.

    Mais ces ADN polymérases thermophiles fonctionnent à 100°C, température à laquelle l'ADN est dénaturé (sous forme linéaire). Cette ADN polymérase thermophile est appelée Taq polymérase, du nom de Thermus aquaticus, la bactérie dont il est dérivé.

    La Taq polymérase, cependant, n'a aucune capacité de relecture. D'autres polymérases thermiquement stables, telles que Vent et Pfu, ont été découvertes pour fonctionner à la fois pour la PCR et pour la relecture.

    Vous aurez besoin de quatre éléments pour effectuer la PCR sur un échantillon :

    1. L'échantillon cible. Il s'agit de l'échantillon biologique à partir duquel vous souhaitez amplifier l'ADN.

    2. Un apprêt. Brins courts d'ADN qui adhèrent au segment cible. Ils identifient la portion d'ADN à multiplier et fournissent un point de départ pour la réplication.

    3. Taq polymérase. C'est l'enzyme qui est chargée de répliquer l'ADN. C'est la partie polymérase du nom de réaction en chaîne par polymérase.

    4. Nucléotides. Vous devrez ajouter des nucléotides (dNTP) pour que l'ADN polymérase ait des blocs de construction avec lesquels travailler.

    La PCR comporte trois étapes principales et elles sont répétées encore et encore, généralement 25 à 75 fois. C'est là que l'automatisation est la plus appréciée.

    1. Votre échantillon cible est chauffé. Cela dénature l'ADN, le déroule et brise les liaisons qui maintiennent les deux brins de la molécule d'ADN, vous laissant avec de l'ADN simple brin (ADNsb).

    2. La température est réduite et l'apprêt est ajouté. Les molécules d'amorce ont maintenant la possibilité de se lier (hybrider) aux morceaux d'ADNsb. Cela marque les portions d'ADN à amplifier et fournit un point de départ pour la réplication.

    3. De nouveaux morceaux d'ADN ss sont fabriqués. La Taq polymérase catalyse la génération de nouveaux morceaux d'ADNsb qui sont complémentaires aux portions marquées par les amorces. Le travail de la Taq polymérase est de se déplacer le long du brin d'ADN et de l'utiliser comme matrice pour assembler un nouveau brin complémentaire à la matrice. C'est la réaction en chaîne dans le nom de réaction en chaîne par polymérase.

    La PCR est si efficace car elle multiplie l'ADN de façon exponentielle pour chacun des 25 à 75 cycles. Un cycle ne prend qu'une minute environ et chaque nouveau segment d'ADN qui est fabriqué peut servir de modèle pour de nouveaux.

    La chose la plus importante à retenir est peut-être d'être très conscient de la contamination. Si, par exemple, vous enlevez sans le savoir un morceau de peau dans votre échantillon, alors ton L'ADN peut être amplifié dans la réaction PCR. Voici quelques autres facteurs pour optimiser vos résultats avec la PCR :

    1. Température de recuit. Commence par le bas de ce que vous pensez fonctionner, puis montez si nécessaire. Si la température est trop basse, les amorces feront plus d'erreurs et vous obtiendrez trop de bandes lorsque vous passerez votre échantillon sur un gel. Si la température est trop élevée, vous n'obtiendrez aucun résultat et votre gel sera blanc. Vous voulez être environ 3C à 5C en dessous de la température de fusion (Tm). Une formule approximative pour déterminer Tm est Tm=4(G + C) + 2(A + T).

    2. Concentration de magnésium. Vous voulez que votre concentration en Mg2+ soit d'environ 1,5 mM à 3 mM. Si vous allez trop haut, la polymérase fera plus d'erreurs.

    3. Réfléchissez bien à la conception de l'apprêt. Les deux amorces doivent avoir approximativement la même Tm afin qu'elles s'hybrident toutes les deux à la même température. Deux bases sur trois à l'extrémité 3' doivent être G ou C pour obtenir une bonne hybridation (G et C ont trois liaisons H donc vous obtenez une meilleure polymérisation). Enfin, évitez les dimères d'amorces, qui se produisent lorsque les amorces ont des extrémités qui s'hybrident les unes aux autres. Cela ne produira AUCUN produit.

    4. Plus n'est pas nécessairement mieux. Plus de polymérase produit plus de produits non spécifiques, alors ne vous contentez pas de jeter négligemment un tas de polymérase. De plus, les réactions PCR ne fonctionnent pas s'il y a trop d'ADN.

    La Taq polymérase ne fonctionne pas sur les échantillons d'ARN, la PCR ne peut donc pas être utilisée pour amplifier directement les molécules d'ARN. L'incorporation de l'enzyme transcriptase inverse (RT), cependant, peut être combinée avec la PCR traditionnelle pour permettre l'amplification des molécules d'ARN. Après avoir ajouté votre échantillon d'ARN à la machine PCR, ajoutez une amorce d'ADN comme d'habitude et laissez-la s'hybrider à votre molécule cible. Ajoutez ensuite la RT avec les dNTP, ce qui allongera l'amorce d'ADN et fera une copie d'ADNc des molécules d'ARN et exécutera la réaction PRC comme d'habitude. Le produit de la RT-PCR est une molécule d'ADN double brin analogue au segment cible de la molécule d'ARN.


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