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Spectrométrie de masse versus western blot pour validation


J'ai des données de spectrométrie de masse (LC-MS/MS) provenant de cortex de rat sous traitement médicamenteux ou témoin. Les résultats ont été réalisés en triple (trois paires de rats, médicament ou contrôle par paire). En plus de certaines des analyses bioinformatiques que je fais, je devrai valider certains des changements de pli de la spectrométrie de masse par Western blot afin de publier mes résultats.

Certaines des protéines que j'ai choisies pour valider très bien le travail par Western blot qui capture la même tendance que la spectrométrie de masse. Cependant, d'autres protéines que j'ai tenté de valider vont exactement dans la direction opposée.

Mes questions:

  1. En général, quelle est la précision de la spectrométrie de masse par rapport au transfert Western ?
  2. Est-il inhabituel d'avoir beaucoup de variabilité entre les résultats des deux méthodes ? Je crains de devoir essayer plusieurs protéines avant de voir les résultats reproduits et cela me semble problématique. Cela m'amène à la troisième question.
  3. A quel résultat dois-je me fier ?

Autres informations - Certaines des protéines que j'ai choisies pour la validation proviennent du bas de la liste où moins de fragments peptidiques ont été détectés. Dans certains cas, des fragments ont été détectés dans seulement 2 des 3 réplicats biologiques. Je n'ai pas choisi de valider les protéines où les 2 ou 3 réplicats variaient considérablement dans les valeurs de comptage spectral normalisées, donc je m'attendrais à ce que ces lectures soient précises. De plus, la partie spectrométrie de masse de l'expérience a été réalisée par un laboratoire réputé qui a filtré des données erronées à l'aide de seuils FDR. Il existe une forte corrélation globale entre les trois réplicats pour un traitement particulier et une faible erreur standard entre les échantillons de la population, donc, statistiquement, je fais confiance aux résultats de la spécification de masse.

Si vous avez besoin de plus d'informations, veuillez demander - je ne sais pas exactement ce qui sera utile pour répondre à mes questions.

ÉDITER :

Cet article traite de la justification de l'utilisation du Western Blot pour valider les résultats de la spécification de masse. Il suggère d'utiliser comme alternative des tests de surveillance des réactions sélectionnés. Certains des points soulevés par les commentateurs de ce fil sont réitérés dans cet article.


Il est courant de prouver un résultat à l'aide d'une technique orthogonale. Comme RNAseq suivi de qRT-PCR etc.

Le transfert de Western n'est pas une technique robuste et les comparaisons croisées sont difficiles en raison de la différence dans les avidités/affinités des différents anticorps. Ainsi, les comparaisons ne peuvent être faites qu'avec une paire protéine-contrôle dans des conditions différentes.

La LC-MS est plus sensible et moins biaisée (IMO). Donc, l'astuce générale est de ne pas faire de westerns pour toutes les protéines, de signaler simplement celles qui se comportent bien (disons que vous les « avez choisies » parce qu'elles sont importantes). Je sais que c'est une mauvaise pratique et je ne devrais pas la préconiser. Pour votre propre validation scientifique, essayez-le avec une autre technique MS ; si vous avez utilisé ESI-Quadrupole/ion-Trap etc, essayez avec MALDI-TOF ou iTRAQ. Certains luddites continueront de s'accrocher aux westerns.

Je pense qu'il vaut mieux ne pas tester les protéines qui ont un faible nombre de peptides. Voir ce qu'on appelle l'intrigue MA. Ceci est fréquemment utilisé pour les puces à ADN. IciMdénote le changement de pli etUNEdésigne l'expression totale dans les deux échantillons. Ne choisissez pas des protéines dont l'expression est faible dans les deux échantillons ; ils pourraient ne pas être significatifs. Par exemple si vous avez2molécules deXet100molécules deOuien condition de contrôle et5molécules deXet200molécules deOuien test; puis le changement de pli dansXsemblerait important; cependant, ce changement peut ne pas être pertinent et peut être le résultat d'une fluctuation stochastique/d'une erreur de mesure. Si vous avez de nombreux échantillons, vous pouvez voir si quelque chose est stochastique ou non, mais la limitation est le nombre d'échantillons.

Remarque : je ne dis pas que l'incrément de 2 → 5 molécules devrait être dénué de sens. Mais pour savoir s'ils ont un sens ou non, il faudrait des modèles plus complexes ; mieux vaut les éviter en ce moment.


Protéomique par spectrométrie de masse : approches, avancées et applications

La spectrométrie de masse (MS) est l'outil le plus complet et le plus polyvalent en protéomique à grande échelle. Dans cette revue, nous disséquons le cadre général de l'expérience MS en ses composants clés. Nous discutons des principes fondamentaux des analyses protéomiques ainsi que des développements récents dans les domaines des méthodes de séparation, de l'instrumentation et de la conception expérimentale globale. Nous soulignons à la fois les forces et les limites inhérentes à la protéine MS et proposons un guide approximatif pour la sélection d'une conception expérimentale basée sur les objectifs de l'analyse. Nous soulignons la polyvalence de l'Orbitrap, un nouvel analyseur de masse qui présente une résolution élevée (jusqu'à 150 000), une précision de masse élevée (2 à 5 ppm), une plage de masse à charge de 6 000 et une plage dynamique supérieure à 10 ( 3). La précision de masse élevée de l'Orbitrap élargit l'arsenal des approches d'acquisition et d'analyse de données par rapport à un instrument à faible résolution. Nous discutons de diverses techniques chromatographiques, y compris la séparation multidimensionnelle et la chromatographie liquide ultra-performante. La technologie d'identification multidimensionnelle des protéines (MudPIT) implique une préparation d'échantillons en continu, des séparations orthogonales et des solutions MS et logicielles. Nous discutons de plusieurs aspects des applications MudPIT à la phosphoprotéomique quantitative. L'application MudPIT à l'analyse à grande échelle des phosphoprotéines comprend (a) une procédure de fractionnement pour l'enrichissement spécifique au motif des phosphopeptides, (b) le développement d'outils informatiques pour l'interrogation et la validation des données de phosphopeptides de fusil de chasse, et (c) une analyse approfondie des données pour détermination simultanée de l'expression des protéines et des niveaux de phosphorylation, analogue aux mesures de western blot. Nous illustrons l'application de MudPIT à la phosphoprotéomique quantitative de la voie bêta-adrénergique. Nous discutons de plusieurs découvertes biologiques faites via des pipelines de spectrométrie de masse en mettant l'accent sur la protéomique de la signalisation cellulaire.


Validation de la mesure des protéines carbonyles : une étude multicentrique

Les carbonyles de protéines sont largement analysés comme mesure de l'oxydation des protéines. Plusieurs méthodes différentes existent pour leur détermination. Une étude précédente avait décrit des ordres de grandeur de variance qui existaient lorsque les carbonyles de protéines étaient analysés dans un seul laboratoire par ELISA en utilisant différents kits commerciaux. Nous avons davantage exploré les causes potentielles de la variance dans l'analyse des carbonyles dans une étude en anneau. Une fraction protéique soluble a été préparée à partir de foie de rat et exposée à 0, 5 et 15 min d'irradiation UV. Des préparations lyophilisées ont été distribuées à six laboratoires différents qui procédaient régulièrement à des analyses de carbonyle des protéines à travers l'Europe. Les techniques ELISA et Western blot ont détecté une augmentation de la formation de carbonyle de protéine entre 0 et 5 min d'irradiation UV, quelle que soit la méthode utilisée. Après 15 min d'irradiation, moins d'oxydation a été détectée par la moitié des laboratoires qu'après 5 min d'irradiation. Trois des quatre résultats ELISA carbonyle se situaient dans des intervalles de confiance à 95 %. Des erreurs probables dans le calcul des valeurs absolues de carbonyle peuvent être attribuées à des différences de normalisation. Sur un maximum de 88 protéines identifiées comme contenant des groupes carbonyle après clivage tryptique des protéines hépatiques irradiées et témoins, seules sept étaient courantes dans les trois préparations hépatiques. Les résidus de lysine et d'arginine modifiés par des carbonyles sont susceptibles d'être résistants à la protéolyse tryptique. L'utilisation d'un cocktail de protéases peut augmenter la récupération des peptides oxydés. En conclusion, la normalisation est essentielle pour l'analyse des carbonyles et les protéines fortement oxydées peuvent ne pas être analysées efficacement par aucune technique existante.

Mots clés: Sonde réactive à l'aldéhyde Carbonyl ELISA Spectrométrie de masse Protéine oxydée Western blot Oxydation des protéines.

Copyright © 2015. Publié par Elsevier B.V.

Les figures

Carbonyles de protéines primaires et secondaires…

Carbonyles de protéines primaires et secondaires et leur dérivatisation par la DNPH.

Calcul pour la quantification du carbonyle par…

Calcul pour la quantification du carbonyle par analyse des adduits DNP.

Protéine hépatique soluble semi-quantitative carbonyl…

Teneur en carbonyle des protéines hépatiques solubles semi-quantitatives après irradiation UV de 0 à 15 min. (A) Coomassie…

Quantification des protéines carbonyles…

Quantification des carbonyles de protéine dans l'extrait de foie de rat de protéine soluble. Analyse densitométrique…

Carbonylation des protéines dans le foie de rat…

Carbonylation des protéines dans la fraction protéique soluble du foie de rat après augmentation de l'irradiation par…


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Nouvelles approches de validation d'anticorps utilisant l'immunoprécipitation et la spectrométrie de masse

Les anticorps sont utilisés dans un large éventail d'applications de recherche et de diagnostic pour l'enrichissement, la détection et la quantification des protéines et de leurs modifications. Des centaines de milliers d'anticorps sont disponibles dans le commerce contre des milliers de protéines et leurs modifications. Malheureusement, de nombreux anticorps sont mal caractérisés, ce qui entraîne une perte de temps et d'argent ainsi que des conclusions de recherche potentiellement erronées. Pour vérifier les performances et la spécificité des anticorps Thermo Scientific, nous avons créé un flux de travail complet pour évaluer la spécificité des anticorps en utilisant l'immunoprécipitation combinée à la spectrométrie de masse (IP-MS). Dans des expériences préliminaires, nous avons criblé plus de 500 anticorps dirigés contre près de 100 protéines clés de signalisation du cancer exprimées dans 12 lignées cellulaires tumorales en culture. Environ 70 % des anticorps précédemment validés pour l'immunocapture pourraient être utilisés pour capturer et identifier la cible visée, les protéines en interaction et les cibles non ciblées, et

40% des anticorps non préalablement validés pour IP étaient positifs par IP-MS. Pour démontrer l'efficacité de ces anticorps, nous avons utilisé un ensemble de ces anticorps pour immunocapturer simultanément douze protéines dans la voie Akt/mTOR, puis quantifié les protéines et leur phosphorylation dans quatre lignées cellulaires stimulées par l'IGF en utilisant une quantification ciblée basée sur MS. L'analyse comparative de ces tests IP-MS multiplexés a montré une corrélation modérée avec la quantification avec des tests Western blot, ELISA et Luminex plus traditionnels.


Résumé

Les carbonyles de protéines sont largement analysés comme mesure de l'oxydation des protéines. Plusieurs méthodes différentes existent pour leur détermination. Une étude précédente avait décrit des ordres de grandeur de variance qui existaient lorsque les carbonyles de protéines étaient analysés dans un seul laboratoire par ELISA en utilisant différents kits commerciaux. Nous avons davantage exploré les causes potentielles de la variance dans l'analyse des carbonyles dans une étude en anneau. Une fraction protéique soluble a été préparée à partir de foie de rat et exposée à 0, 5 et 15 min d'irradiation UV. Des préparations lyophilisées ont été distribuées à six laboratoires différents qui procédaient régulièrement à des analyses de carbonyle des protéines à travers l'Europe. Les techniques ELISA et Western blot ont détecté une augmentation de la formation de carbonyle de protéine entre 0 et 5 min d'irradiation UV, quelle que soit la méthode utilisée. Après 15 min d'irradiation, moins d'oxydation a été détectée par la moitié des laboratoires qu'après 5 min d'irradiation. Trois des quatre résultats ELISA carbonyle se situaient dans des intervalles de confiance à 95 %. Des erreurs probables dans le calcul des valeurs absolues de carbonyle peuvent être attribuées à des différences de normalisation. Sur un maximum de 88 protéines identifiées comme contenant des groupes carbonyle après clivage tryptique des protéines hépatiques irradiées et témoins, seules sept étaient courantes dans les trois préparations hépatiques. Les résidus de lysine et d'arginine modifiés par des carbonyles sont susceptibles d'être résistants à la protéolyse tryptique. L'utilisation d'un cocktail de protéases peut augmenter la récupération des peptides oxydés. En conclusion, la normalisation est essentielle pour l'analyse des carbonyles et les protéines fortement oxydées peuvent ne pas être analysées efficacement par aucune technique existante.


Introduction

La plupart des processus biologiques impliquent l'action et la régulation de complexes multiprotéiques. Dans de nombreux cas, des propriétés distinctes telles que la localisation subcellulaire, l'activité catalytique et la spécificité de substrat sont déterminées par différents polypeptides dans un complexe holoenzymatique, et des partenaires d'interaction protéique spécifiques peuvent être présents en quantités non stoechiométriques. Par exemple, des sous-unités catalytiques telles que la protéine phosphatase 1 (PP1) peuvent interagir avec un éventail de partenaires protéiques alternatifs, qui se lient ainsi de manière non stoechiométrique pour générer une gamme d'holoenzymes avec différentes spécificités (pour une revue, voir Moorhead et al., 2007). Cela peut rendre difficile la distinction des protéines interagissant spécifiques mais de faible abondance du plus grand nombre de protéines contaminantes de faible affinité, mais abondantes, qui sont inévitablement récupérées à l'aide de méthodes couramment utilisées telles que les stratégies de pull-down ou d'immunoprécipitation. Un objectif clé dans la plupart des domaines de la biologie cellulaire est donc la caractérisation des composants protéiques des complexes multiprotéiques grâce à l'identification fiable de partenaires d'interaction protéiques spécifiques.

Tout partenaire d'interaction putatif identifié par purification par affinité ou fractionnement biochimique doit être validé pour confirmer sa pertinence physiologique. Ces expériences de validation en aval, impliquant une caractérisation moléculaire détaillée, sont à la fois coûteuses et longues et il est donc impératif de concentrer les ressources sur ces sous-ensembles d'interactions potentielles avec une forte probabilité d'importance biologique. L'amélioration continue de la sensibilité et de la résolution de la technologie de spectrométrie de masse pour l'identification des protéines, par exemple, permet l'identification d'un nombre toujours plus grand de protéines dans des expériences d'immunoaffinité et de pull-down. Cependant, en plus des partenaires d'interaction de bonne foi, ces listes en expansion comprennent un nombre accru de protéines contaminantes, y compris celles qui se lient de manière non spécifique à la matrice d'affinité. Le problème de la liaison non spécifique ne peut pas être surmonté de manière satisfaisante en utilisant des méthodes de purification à haute stringence, bien que cela puisse réduire le niveau de liaison non spécifique, cela éliminera inévitablement également les protéines partenaires spécifiques de faible abondance et de faible affinité. La stratégie la plus efficace doit donc préserver tous les événements d'interaction spécifiques, ce qui entraîne inévitablement un grand nombre de protéines non spécifiques également copurifiantes qui doivent être identifiées et rejetées.

Pour résoudre ce problème, nous et d'autres avons démontré qu'une approche quantitative basée sur la spectrométrie de masse combinée à un marquage isotopique peut aider à distinguer laquelle des nombreuses protéines identifiées dans une expérience de pull-down ou d'immunoprécipitation représente une liaison spécifique. Cela se fait par l'inclusion d'un contrôle négatif, qui fournit un arrière-plan de protéines contaminantes qui se lient de manière non spécifique à la matrice d'affinité et/ou à l'étiquette de fusion, contre laquelle les protéines qui se lient spécifiquement à la protéine d'intérêt se démarquent clairement (pour la revue, voir Vermeulen et al., 2008). Par exemple, en utilisant une combinaison de protéomique quantitative basée sur les acides aminés en culture cellulaire (SILAC) (Ong et al., 2002) avec une immunoprécipitation de protéines de fusion marquées par GFP, nous avons révélé des différences dans les partenaires de liaison pour deux isoformes différentes. de la protéine nucléaire phosphatase, PP1 (Trinkle-Mulcahy et al., 2006). D'autres groupes ont utilisé une approche similaire basée sur des protéines d'appât étiquetées pour cartographier le spectre des protéines interagissant avec le protéasome 26S humain (Wang et Huang, 2008) et pour détecter les membres dynamiques des complexes de facteurs de transcription (Mousson et al., 2008). Des approches quantitatives basées sur les isotopes ont également été utilisées pour définir des complexes protéiques marqués dans la levure (Ranish et al., 2003 Tackett et al., 2005) et des complexes protéiques marqués et endogènes dans les cellules de mammifères (Blagoev et al., 2003 Cristea et al. ., 2005 Selbach et Mann, 2006).

Bien que la stratégie de marquage isotopique utilisée dans une approche de purification par affinité SILAC offre une grande aide pour séparer les interacteurs spécifiques des intéracteurs non spécifiques, l'expérience montre que toutes les interactions spécifiques ne peuvent pas être déterminées sans ambiguïté, en particulier près du niveau seuil où les rapports signal sur bruit sont proches du bruit de fond. . Nous décrivons ici une nouvelle stratégie de spectrométrie de masse basée sur SILAC qui aborde spécifiquement ce problème, en incorporant des méthodes pour augmenter le signal, c'est-à-dire l'abondance de complexes protéiques purifiés, tout en réduisant ou en filtrant le bruit, c'est-à-dire les protéines qui se lient de manière non spécifique à l'affinité. matrice, marqueur et/ou anticorps.

L'efficacité de la détection des partenaires d'interaction repose sur l'épuisement efficace du complexe ciblé. Ici, nous montrons que les protéines marquées GFP peuvent être presque épuisées quantitativement en utilisant le liant GFP récemment développé (Rothbauer et al., 2008). Le liant GFP est un Escherichia coli–protéine de 16 kD exprimée dérivée d'un anticorps à chaîne lourde de lama qui se lie avec une affinité et une spécificité élevées à la GFP. Cela souligne l'utilité d'utiliser la GFP comme double étiquette pour la purification par affinité et la microscopie à fluorescence in vivo. De plus, la caractérisation des protéines qui se lient de manière non spécifique à trois des matrices d'affinité les plus couramment utilisées, dans des extraits de cellules entières, nucléaires ou cytoplasmiques de cellules de mammifères, fournit un filtre de « protéome en billes ». Cela facilite la distinction entre les protéines de liaison spécifiques et non spécifiques et permet ainsi une hiérarchisation objective des cibles appropriées pour une caractérisation moléculaire détaillée.

En résumé, nous présentons ici un flux de travail puissant et fiable qui peut être appliqué pour analyser des complexes protéiques purifiés par affinité isolés à l'aide de protéines de fusion étiquetées ou par immunoprécipitation de protéines endogènes.


Matériaux et méthodes

Matériaux biologiques

Dans cette étude, des bibliothèques d'ADNc, des vecteurs d'expression pET-30a (Novagen) et pET30a-GST, une version contenant une étiquette glutathion S-transférase (GST) de pET30a, créée dans notre laboratoire (Cao et al., 2010) et des souches bactériennes (DH5α, BL21 et ER2566) ont été utilisées. Les enzymes de restriction BamSALUT, XhoJE, ÉcoRI, HindIII, l'ADN ligase T4 et l'ADN polymérase Ex Taq ont été achetées auprès de TAKARA.

Échantillons de riz

Quatre types d'échantillons de riz ont été collectés et utilisés pour l'analyse western blot dans cette étude : (i) 10 échantillons de plantule (pousse et racine), tallage (feuille et tige), botte (feuille étendard et jeune panicule), floraison feuille et panicule) et les stades de remplissage (feuille étendard et graine) de la variété de riz 93-11 (Oryza sativa L.) (ii) sept échantillons de feuilles prélevés à des intervalles de 4 h à partir de 12 h en une seule journée (iii) huit échantillons de feuilles de la lignée de riz transgénique homozygote 4021-3 avec le gène de résistance à la brûlure bactérienne Xa21 ( Xiang et al., 2006), inoculé avec la race philippine incompatible 6 de Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) à 0, 1, 2, 4 et 8 h, et 1, 3 et 5 jours et (iv) quatre échantillons de blé, maïs, coton et A. thaliana feuilles pendant la période de croissance. Tous les matériaux ont été congelés à l'aide d'azote liquide et conservés à -70 °C jusqu'à utilisation.

Prédiction de peptide antigénique et conception d'amorces

Le logiciel BEPITOPE ( Odorico et Pellequer, 2003) a été utilisé pour prédire les fragments antigéniques à partir desquels ceux qui étaient uniques dans le génome du riz, une fois vérifiés par BLASTP, ont été choisis comme antigène pour générer des anticorps spécifiques contre les protéines cibles. Logiciel PrimerCE (Cao et al., 2010) a été utilisé pour concevoir les amorces basées sur la séquence codante (CDS) téléchargée à partir de la base de données TIGR (http://rice.plantbiology.msu.edu/) comme indiqué ci-dessous. Les lettres soulignées sont des sites de reconnaissance d'enzymes de restriction. Les positions détaillées dans l'ADNc complet et les séquences peptidiques sont répertoriées dans le tableau 1. Os09g30418.1F, 5′-CG GGATCC TTCGCCTTCCAGGCCGAGAT-3′ Os09g30418.1R, 5′-CCG CTCGAG CTCCTCAAGGTATTCCAGCTGA-3′ Os05g04510.1F, 5′ -G GAATTC CTTGGCGCTCGTCTTACGGAGG-3′ Os05g04510.1R, 5′-CCC AAGCTT GCCACTAGCAACAATGCTCTTGG-3′ Os06g46770.2F, 5′-G GAATTC ATGCAGATCTTTGTGAAGACCC-3′ Os06g46770.2R, 5′-CCTGAGCC AAGCTT Os06g46770.2R, 5′-CCTGAGCC AAGCTG0,1F 5′-G GAATTC AAGAACGTTGCGGTGAAGG-3′ Os03g08020.1R, 5′-CCC AAGCTT TCATTTCTTCTTGGCGGCAG-3′ Os03g50890.1F, 5′-G GAATTC ACCATTGGTGCTGAGCGTTTC-3′ Os03g50890.1RCACGA, 5′-CCC AAATTTCTT TTAG.

Protéines candidates de référence du riz

Nom du gène Numéro de lieu Annotation Mol. poids (kDa) Antigène Longueur du fragment (position)/séquence peptidique
HSP Os09g30418.1 Protéine de choc thermique 94 Protéine exprimée 182 acides aminés (8-189)
UBQ Os06g46770.2 Polyubiquitine contenant 7 monomères d'ubiquitine 60 Protéine exprimée 150 acides aminés (1-150)
BAIGNOIRE Os01g59150.1 Chaîne de tubuline bêta-4 50 Peptide synthétisé QYQDATADEEGEYEDEEQQ
eEF-1α Os03g08020.1 Facteur d'allongement 1-α 49 Protéine exprimée 148AA (301-448)
eIF-4α Os02g05330.1 Facteur d'initiation eucaryote 4-α 47 Peptide synthétisé DAKHYDSKMQELLHQGDNEE
SAMS Os05g04510.1 S-Adénosylméthionine synthétase 1 43 Protéine exprimée 150 acides aminés (151-300)
ACTE Os03g50890.1 Actine-1 42 Protéine exprimée 128 acides aminés (251-378)
GAPDH Os04g40950.1 Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase, cytosolique 37 Peptide synthétisé DLVSTDFQGDNRSSIFDAKAGI
UBC Os02g42314.2 Enzyme de conjugaison de l'ubiquitine E2 18 Peptide synthétisé PDSPLNCDSGNLLRSGDIRGY
Nom du gène Numéro de lieu Annotation Mol. poids (kDa) Antigène Longueur du fragment (position)/séquence peptidique
HSP Os09g30418.1 Protéine de choc thermique 94 Protéine exprimée 182 acides aminés (8-189)
UBQ Os06g46770.2 Polyubiquitine contenant 7 monomères d'ubiquitine 60 Protéine exprimée 150 acides aminés (1-150)
BAIGNOIRE Os01g59150.1 Chaîne de tubuline bêta-4 50 Peptide synthétisé QYQDATADEEGEYEDEEQQ
eEF-1α Os03g08020.1 Facteur d'allongement 1-α 49 Protéine exprimée 148AA (301-448)
eIF-4α Os02g05330.1 Facteur d'initiation eucaryote 4-α 47 Peptide synthétisé DAKHYDSKMQELLHQGDNEE
SAMS Os05g04510.1 S-Adénosylméthionine synthétase 1 43 Protéine exprimée 150 acides aminés (151-300)
ACTE Os03g50890.1 Actine-1 42 Protéine exprimée 128 acides aminés (251-378)
GAPDH Os04g40950.1 Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase, cytosolique 37 Peptide synthétisé DLVSTDFQGDNRSSIFDAKAGI
UBC Os02g42314.2 Enzyme de conjugaison de l'ubiquitine E2 18 Peptide synthétisé PDSPLNCDSGNLLRSGDIRGY

Protéines candidates de référence du riz

Nom du gène Numéro de lieu Annotation Mol. poids (kDa) Antigène Longueur du fragment (position)/séquence peptidique
HSP Os09g30418.1 Protéine de choc thermique 94 Protéine exprimée 182 acides aminés (8-189)
UBQ Os06g46770.2 Polyubiquitine contenant 7 monomères d'ubiquitine 60 Protéine exprimée 150 acides aminés (1-150)
BAIGNOIRE Os01g59150.1 Chaîne de tubuline bêta-4 50 Peptide synthétisé QYQDATADEEGEYEDEEQQ
eEF-1α Os03g08020.1 Facteur d'allongement 1-α 49 Protéine exprimée 148AA (301-448)
eIF-4α Os02g05330.1 Facteur d'initiation eucaryote 4-α 47 Peptide synthétisé DAKHYDSKMQELLHQGDNEE
SAMS Os05g04510.1 S-Adénosylméthionine synthétase 1 43 Protéine exprimée 150 acides aminés (151-300)
ACTE Os03g50890.1 Actine-1 42 Protéine exprimée 128 acides aminés (251-378)
GAPDH Os04g40950.1 Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase, cytosolique 37 Peptide synthétisé DLVSTDFQGDNRSSIFDAKAGI
UBC Os02g42314.2 Enzyme de conjugaison de l'ubiquitine E2 18 Peptide synthétisé PDSPLNCDSGNLLRSGDIRGY
Nom du gène Numéro de lieu Annotation Mol. poids (kDa) Antigène Longueur du fragment (position)/séquence peptidique
HSP Os09g30418.1 Protéine de choc thermique 94 Protéine exprimée 182 acides aminés (8-189)
UBQ Os06g46770.2 Polyubiquitine contenant 7 monomères d'ubiquitine 60 Protéine exprimée 150 acides aminés (1-150)
BAIGNOIRE Os01g59150.1 Chaîne de tubuline bêta-4 50 Peptide synthétisé QYQDATADEEGEYEDEEQQ
eEF-1α Os03g08020.1 Facteur d'allongement 1-α 49 Protéine exprimée 148AA (301-448)
eIF-4α Os02g05330.1 Facteur d'initiation eucaryote 4-α 47 Peptide synthétisé DAKHYDSKMQELLHQGDNEE
SAMS Os05g04510.1 S-Adénosylméthionine synthétase 1 43 Protéine exprimée 150 acides aminés (151-300)
ACTE Os03g50890.1 Actine-1 42 Protéine exprimée 128 acides aminés (251-378)
GAPDH Os04g40950.1 Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase, cytosolique 37 Peptide synthétisé DLVSTDFQGDNRSSIFDAKAGI
UBC Os02g42314.2 Enzyme de conjugaison de l'ubiquitine E2 18 Peptide synthétisé PDSPLNCDSGNLLRSGDIRGY

Clonage de gènes, expression de protéines et purification de protéines

La PCR a été réalisée en utilisant des plasmides des banques d'ADNc de riz comme matrices. Les enzymes de restriction indiquées ont été utilisées pour digérer les amplicons et les vecteurs, qui ont ensuite été purifiés sur gel. Ensuite, les produits ligaturés ont été transformés en E. coli DH5α, et les recombinants ont été vérifiés par analyse de séquence (Beijing Genomics Institute, Pékin, Chine). Les recombinants ont été transformés en E. coli souche d'expression ER2566 ou BL21, et cultivée pendant une nuit dans du milieu LB supplémenté en kanamycine (50 g ml -1 ) à 37°C. Les cultures ont été diluées au 1:100 avec du milieu Luria-Bertani frais (milieu LB) additionné de kanamycine (50 g ml -1 ) et de glucose à 1 %, et cultivées à 37 °C jusqu'à la DO600 0,6-0,8. Ensuite, de l'isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG 0,4 µM) a été ajouté pendant 3 h pour induire l'expression de protéines de fusion. Les cellules bactériennes ont été récoltées, rompues par sonication et purifiées par chromatographie sur colonne de nickel. Les protéines cibles ont ensuite été séparées par SDS-PAGE et colorées au bleu de Coomassie.

Génération d'anticorps

Les anticorps polyclonaux ont été générés en immunisant des lapins sains en utilisant les protéines de fusion purifiées ou les peptides synthétisés comme antigènes. Les conjugaisons de protéines, les immunisations et les purifications d'antisérums ont été réalisées par BPI (Beijing Protein Innovation Co., Ltd, Pékin, Chine).

Extraction des protéines de riz et détermination de leur concentration

Le tissu de riz a été broyé en une fine poudre dans de l'azote liquide. Une aliquote de 800 l de tampon d'extraction [62,5 mM de TRIS-HCl (pH 7,4), 10 % de glycérol, 0,1 % de SDS, 2 mM d'EDTA, 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), 5 % (v/v) de β-mercaptoéthanol] a été ajouté à chaque échantillon de poudre de 300 mg. Le mélange a été vortexé puis refroidi sur de la glace pendant 10 min. Les échantillons ont été centrifugés à 12 000 tr/min pendant 10 minutes à 4 °C, et le surnageant a été collecté et conservé à –70 °C. Les concentrations en protéines des échantillons de riz ont été déterminées à l'aide de la méthode de Bradford ( Bradford, 1976). Une quantité égale de protéines de riz a été chargée et séparée par SDS-PAGE puis colorée au bleu de Coomassie.

Western blot et analyse de quantification du signal

Des quantités égales de protéines de riz provenant de différents tissus/organes ont été séparées par SDS-PAGE et électrotransférées sur une membrane PVDF (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA) à 100 V pendant 60 min. La membrane a été immergée dans du lait écrémé à 5 % dans une solution de TTBS [TRIS-HCl 0,2 M (pH 7,6), NaCl 1,37 M, Tween-20 0,1 %] pendant 1 h à température ambiante. Les protéines ont été incubées avec les anticorps polyclonaux dans du lait écrémé à 5% dans une solution de TTBS pendant 3 h à température ambiante et soumises à trois rinçages de 5 min dans une solution de TTBS. La membrane a ensuite été incubée avec un anticorps anti-lapin de chèvre conjugué à la peroxydase de raifort (Zhongshan Goldenbridge Biotechnology Co., Ltd, Pékin, Chine) pendant 1 h à température ambiante, et soumise à trois rinçages de 5 min dans une solution de TTBS. Le transfert a été développé avec un kit SuperECL Plus (Applygen, Pékin, Chine) et le signal a été exposé avec un film radiographique.

Les images ont été numérisées et l'intensité de chaque bande a été capturée à l'aide d'un ImageMaster 2D Platinum version 5.0 (GE Healthcare Amersham Bioscience). L'intensité de chaque bande a été standardisée en pourcentage de l'intensité totale et les résultats ont été appelés volume relatif qui représente l'abondance d'expression relative du gène dans les échantillons testés. L'abondance relative de l'expression a été utilisée pour évaluer la stabilité de l'expression des protéines. Western blot et analyse de quantification ont été effectuées dans au moins trois réplications biologiques.

Analyse de la stabilité de l'expression des protéines

La stabilité de l'expression de la protéine a été évaluée par geNorm v.3.5 (http://medgen.ugent.be/∼jvdesomp/genorm/) (Vandesompele et al., 2002) et le logiciel Microcal Origin 6.0 (Microcal Software, Northampton, MA, USA). Les valeurs d'expression relative des protéines ont été importées dans geNorm, qui calcule la stabilité de l'expression génique [valeur M ou la moyenne de la variation standard d'un gène candidat donné par rapport à tous les autres gènes dans l'ensemble d'échantillons donné ( Murthi et al., 2008 Silveira et al., 2009)] pour classer les protéines dans divers échantillons de tissus. Plus la valeur M est basse, plus l'expression de la protéine est stable. De plus, les valeurs relatives de l'expression des protéines ont été importées dans Microcal Origin 6.0, qui génère une boîte à moustaches pour estimer la stabilité de l'expression des protéines de référence potentielles.

Génération de courbes étalons western blot et détermination de la concentration de protéines de référence dans le riz

La concentration de protéines recombinantes a été tracée en fonction du signal de western blot généré par les anticorps correspondants afin d'estimer la gamme linéaire de détection et les limites inférieures de détection des protéines recombinantes. Ensuite, une série de protéines recombinantes diluées et de protéines totales de riz ont été dosées dans la même membrane de western blot pour générer la courbe standard. La courbe standard a été utilisée pour calculer la concentration en protéines et le pourcentage de protéines de référence dans le riz. Une série de dilutions de protéines totales de riz a également été analysée par western blot afin de déterminer les limites inférieures de détection des protéines de référence du riz.

Analyse transcriptionnelle des gènes de référence du riz

Les données transcriptionnelles sur les feuilles, les racines, les tiges, les panicules et les graines de riz ont été téléchargées à partir du MPSS (http://mpss.udel.edu/rice/) (Nakano et al., 2006) et les bases de données EST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/dbEST/) (Boguski et al., 1993). Le niveau transcriptionnel a été divisé en quatre grades en fonction de l'intensité du signal d'expression afin de le comparer aux résultats du western blot.


La base du Western Blot

Il existe de nombreuses techniques de « blot » en biologie moléculaire telles que le transfert sud, le transfert nord, le transfert oriental et le transfert occidental. Le principe et le processus de ces techniques de transfert sont similaires. Le Southern et le Northern blot sont des techniques de transfert d'acide nucléique, dont le Southern blot sert à détecter une séquence d'ADN spécifique dans des échantillons d'ADN et le Northern blot sert à étudier l'expression génique par détection d'ARN (ou d'ARNm isolé) dans un échantillon. Eastern blot est utilisé pour analyser les modifications post-traductionnelles des protéines (PTM) telles que les lipides, les phosphomoies et les glycoconjugués.

Différente de ces techniques de transfert décrites ci-dessus, le transfert de western, également appelé immunoblot de protéine, est une technique analytique utilisée pour détecter des protéines spécifiques dans un échantillon donné telles que des lysats cellulaires, un homogénat ou un extrait de tissu. Il est largement utilisé en biologie moléculaire. Les bases de l'identification par western blot sont deux propriétés distinctives : le poids moléculaire et la spécificité de liaison aux anticorps. Il utilise l'électrophorèse sur gel (généralement SDS-PAGE) pour séparer les protéines natives par structure 3-D ou les protéines dénaturées par la longueur du polypeptide. Et ensuite transféré l'échantillon de protéine sur une membrane (généralement de la nitrocellulose ou du PVDF), où ils sont sondés avec des anticorps marqués et colorés avec des colorants pour la visualisation et directement identifiés par séquençage N-terminal, spectrométrie de masse ou immunodétection. L'immunodétection implique l'identification d'une protéine par sa réaction avec un anticorps spécifique. Grâce à la résolution spatiale, cette méthode fournit des informations sur le poids moléculaire des protéines individuelles et distingue les isoformes, les produits de traitement alternatifs et d'autres formes modifiées après la traduction.

2. Principe de base du western blot

Le principe de base du western blot est l'électrophorèse des protéines et l'ELISA. L'électrophorèse est une méthode couramment utilisée pour séparer les protéines sur la base de la taille, de la forme ou de la charge. Les protéines sont de grosses molécules chargées, elles peuvent migrer dans les gels de polyacrylamide sous champ électrique. The migrating speed depends on the molecular weight of proteins: heavy proteins move slower than light proteins. This is just like the runners running through a jungle, the polyacrylamide molecule in the gel is like the branches along the sideline, which could slow the runner down. The bulky runner would be affected more by the “branches” than the small runner so that they runs slower. That’s why we could separate those runner proteins. If we load the mixed protein samples on one side of the gel, add a constant electric field on the gel, and let the protein migrating on the gel for a period of time, the mixed protein sample could be separated into different bands on gel (Figure 1). If we put several proteins with known molecular weight under the same electrophoresis condition along with the tested samples as control, we may further measure the molecular weight of proteins within the tested samples by compare the location of sample proteins with control proteins. These control proteins are commonly known as molecular weight marker or protein ladders.

Figure 1. Protein electrophoresis: proteins separated under electric fields based on different molecular weight.

When the proteins were successfully separated, we still use an electric field to transfer the protein bands onto another polyvinylidene fluoride (PVDF) or nitrocellulose (NC) membrane for the following detection. After the proteins band transferred onto PVDF/NC membrane, we use anti specific protein primary antibodies to probe the sample protein, and then use a labeled secondary antibody for further visualization (Figure 2). This procedure is basically an indirect ELISA process (know more about indirect ELISA at ELISA Guide).

Creative Diagnostics provides a variety of high quality primary antibodies and secondary antibodies for western blot use.

Figure 2. Indirect ELISA procedure. To probe and visualize the separated protein bands.

3. The experimental equipment of western blot

As western blot is a very mature technology in molecular biology, there are a full set of commercialized reagent and equipment that support the experiment of WB (Figure 3). Here we list several frequently used tools and materials for western blot:

  1. Gel: usually made of polyacrylamide, need precast before western blot.
  2. Gel comb: used for toothing one side of the gel as sample loading area.
  3. Gel cassette: used for gel formation.
  4. Gel knife: help to move the gel from cassette.
  5. Electrode chamber: used for holding the gel cassette and cathode buffer.
  6. Electrophoresis tank: used for holding the electrode chamber and anode buffer
  7. Power source: provide a constant electric field
  8. Cassette: clamp the multilayer films when doing protein transfer
  9. Sponges: protect the gel and membrane, keep a wet and conductive condition.
  10. Filter paper: protect the gel and membrane, keep a wet and conductive condition.
  11. PVDF/NC membrane: receive the proteins.
  12. Rolling brush: exclude bubbles within the multilayer membrane.
  13. Washing dish: hold the membrane for washing.

Other general equipment such as shaker/incubator for antibody incubation and imager for display the gel result are not listed here but also important for western blot experiment.

Figure 3. Western blot equipments.

Western blot is often used in research to separate and identify proteins. In this technique a mixture of proteins is separated based on molecular weight through gel electrophoresis. These results are then transferred to a membrane producing a band for each protein. The membrane is then incubated with labeled antibodies specific to the protein of interest. The unbound antibody is washed off leaving only the bound antibody to the protein of interest. The bound antibodies are then detected by developing the film. As the antibodies only bind to the protein of interest, only one band should be visible. The thickness of the band corresponds to the amount of protein present thus doing a standard can indicate the amount of protein present. The general process of western blot includes at least 9 steps as following:

Detailed information of each steps are discussed in Western blot protocols.

Although western blot is relatively an old, mature technology, there are still researchers working on it to upgrade this technique. Hughes et al. from University of California (UC) Berkeley, successfully couple western blotting with single-cell analysis, which enables the simultaneous analysis of

2,000 individual cells. Single-cell protein analysis techniques lack resolution, sensitivity or specificity, or require protein tagging. Western blotting avoids these pitfalls but is not amenable to single-cell analysis. This progress enable us use western blot to investigate single cell proteins.

Their array-based technique uses a slide coated with polyacrylamide gel and patterned with thousands of micro wells, into which a cell suspension is seeded by gravity-driven cell settling, resulting in single-cell occupancy in 40–50% of the wells. Intracellular proteins are then solubilized in the wells, subjected to thin-gel electrophoresis and immobilized. Subsequently, the serial stripping and re-probing of antibodies enables multiplexed analyses of proteins.


Antibody Validation

Antibodies are one of the important reagents in life sciences and clinical medicine. Although antibodies have been widely used, there is a lack of established criteria to guide how they should be validated before use. As a result, many commercial antibodies have not been fully validated prior to use and/or lack of further confirmation resulting in failed or unreplicable results, even projects being abandoned, resulting in significant time, money and sample loss. Therefore, the establishment of antibody verification standards has become an urgent need.

What Is Antibody Validation?

Antibody validation consists primarily of the following components: demonstrating specificity (the ability of antibodies to distinguish between different antigens), proving affinity (intensity of antibody binding epitopes), and finally demonstrating reproducibility. However, although this definition of antibody validation is reasonable, there are still some problems with the widespread application or implementation of validation standards.

The task of verifying the antibody should have been done by the antibody supplier. However, although the seller is responsible for the quality of the reagents sold, antibody performance may be affected by a number of other factors. For example, antibodies may change during transport due to improper storage at low temperatures, or although they can be successfully validated in a general biologically relevant system, end users need to use it in their own experimental systems. Therefore, the end user also needs to perform secondary verification of the antibody.

By taking a few small steps, the researcher can effectively reduce the risk of the experiment in subsequent experiments. First, the researcher should be aware of the usage information provided in the product specification, including the application that has been validated for it, the appropriate protocol and the recommended dilution.

How Can Antibodies Be Validated?

There are also different methods for antibody validation for specific applications, including Western blot (WB), immunohistochemistry (IHC), immunocytochemistry (ICC), immunofluorescence (IF), ELISA, immunoprecipitation (IP), chromatin immunoprecipitation. (ChIP) and peptide arrays, etc. In terms of verification, each assay has its advantages and disadvantages (Table 1).

Table 1. Advantages and disadvantages of several antibody validation methods.

Essai Avantage Désavantage
Western Blot Easy and simple assay
Ideal for denatured proteins
Difficult to optimize
Time-consuming
A small number of antibodies can be tested per run
ELISA Quantitative assay
High throughput
Does not determine if the antibody is specific or cross-react
IHC/ICC Routinely available and relatively inexpensive Difficult standardization
Epitope accessibility can vary in fixed tissues
Difficult to quantitate
IF High throughput
Easy to optimize
Does not determine if the antibody is specific or cross-reacts
siRNA knockdown KD cell lines can be used in all assays (WB, ICC/IHC, Flow cytometry) KD is transient
Difficult to optimize-requires several siRNA sequences
Knockout cell lines and mouse models Best negative controls, since they guarantee no expression of the target gene
May be used in all assays (WB, ICC/IHC, Flow cytometry)
Cell lines for specific genes are not always available or lethal
KO mouse models take over a year to develop and are often non-viable
MME Confirms specificity
High throughput
Requires use of mass spectrometer and trained personnel
SPR Real-time analysis
Label-free
Highly sensitive
Requires immobilization
Requires meticulous experimental design
High sample consumption
MST Rapid assay (KD in 10 min)
Low sample consumption (pM/nM) and small volume (<4 ul)
Immobilization free-in solution measurements
Label-free (optional)
Requires specialized equipment

Which method should be used and how several methods are used to validate antibodies depends not only on sensitivity, specificity and reproducibility, but also on the environment in which the particular antibody is to be used. This means that if a given antibody is only intended for WB, they only need to be tested in this case. However, if you need to use it in other assays, you should also test it again in the application environment. This helps save time and cost associated with the antibody validation process.

Screening for Antibody Specificity

Specificity is a measure of the ability of an antibody to distinguish between different antigens. Even if the antibody may be sensitive to the target protein, it will show a lack of specificity due to cross-reactivity with other proteins. In this sense, it is a basic requirement for a good antibody to confirm that the antibody specifically binds to the target protein.

Several questions need to be identified before analyzing the specificity of a given antibody. The first is what are the types of immunogens that are used to produce this antibody? How is the target protein in the sample to be analyzed constructed? The first question is not easy to answer, especially if the antibody manufacturer does not disclose the type of immunogen. The reason for understanding this information is that the specificity of an antibody depends in part on whether the type of immunogen is a synthetic peptide or a purified protein. Since synthetic peptides do not necessarily summarize the 3-D structure or post-translational modification of native proteins, antibodies produced using synthetic peptides may not recognize native proteins. If the immunogen is a purified protein, the denatured protein is difficult to bind to the antibody. Thus, when the immunogen is a synthetic peptide, the antibody can be applied to WB but not to IP or IHC.

The Preferred Method for Antibody Specific Validation - WB

WB is considered to be the first step in the evaluation of new antibodies because it is the ideal assay for specific validation of denatured protein antibodies. However, in experimental assays where the antigen is in its natural conformation (eg, IHC), it is not the ideal standard method for antibody binding. Because antibodies may recognize a particular epitope in fresh tissue, but different epitopes are recognized in the fixed tissue, the method used to fixed tissue complicates the problem. This happens because unexposed epitopes in natural proteins become accessible after fixed processing and vice versa. If you only need to verify the recognition of the denatured antigen by the antibody or whether it is suitable for WB, then the assay can be used as a first step of verification. The result when the antibody is specific for the selected target is the observation of a band on a target of known molecular weight. If multiple bands are present, they may represent different post-translational modification states, decomposition products or splice variants, or may also be non-specific binding. Therefore, the results of these experiments may appear to be incapable of determining antibody specificity.

Another disadvantage of WB is its low detection throughput because it usually only tests one antibody at a time. However, recently, by converting WB to a capture format, a high-throughput detection method called PAGE-MAP was developed for antibody verification. In this method, a biotinylated protein sample is subjected to PAGE, and then the size-separated protein is incubated with a microsphere-based barcode antibody array for multiplex IP, and the captured protein is labeled with streptavidin for flow through Magnetic cytometry (ie, microsphere affinity) was performed for magnetic bead detection. In addition, size-separated proteins can also be used for parallel readout shotgun mass spectrometry (MS), which can be used to roughly estimate specificity and for selection of antibody target levels sufficient for immunoprecipitation. This new method is powerful, screens thousands of antibodies, recognizes antibodies that bind to the same protein, and provides a means for large-scale antibody validation.

Figure 1. Overview of the western blotting procedure.

In addition to the WB method, the use of blocking peptides to assess antibody specificity is also a common approach, particularly for IHC. These peptides are identical to the peptides used to produce antibodies, and when over-incubated with them, they can be used as immunoneutralizing antibodies. In the validation experiment, the unneutralized antibody was used as a control to stain the sample tissue. If the antibody is specific, incubation with a blocking peptide will result in the disappearance of staining on the tissue. However, this assay has the disadvantage that it does not verify the selectivity of the antibody for the antigen, since the non-specific binding activity of the antibody will also be inhibited by the blocking peptide. Thus, blocking peptides can prove that antibodies are bad, but they do not prove that antibodies must be good.

In the process of antibody validation, the key to demonstrating antibody specificity is the correct use of controls. As in the antibody verification experiments on the cannabinoid CB2 receptor, it has been found that the conventional practice of using only a positive control to verify an antibody is insufficient to ensure the reliability of the antibody. In this validation study, although many techniques (eg, WB, mass spectrometry and blocking peptides) and excellent positive controls were used to obtain a number of positive results indicating the effectiveness of anti-CB2 antibodies. However, when knocking out a negative control to test antibodies, this antibody was found to be non-specific for the CB2 receptor protein. A similar situation may occur due to the similarity of relative epitope regions between proteins, or because antibodies have multiple epitopes. The best negative control is knockout cells/animals that do not express the protein of interest, and closely related proteins can also serve as good negative controls. The best positive control is a cell which non-expression the target protein and transfected with the protein of interest. If knocking out the cells is too difficult to obtain, then siRNA or shRNA knockout cells can be selected as controls. Although negative control is necessary, there is also a need for positive control.

Determination of Antibody Affinity

Antibody binding affinity is another parameter that can be used for antibody validation. It refers to the strength of the binding of an antibody molecule to an epitope. It is usually reported as the equilibrium dissociation constant (KD), which is the ratio of the antibody dissociation rate or kdésactivé (the rate of dissociation from the antigen) to the antibody association rate or antibody binding rate Kau(the rate of binding to the antibody).

Affinity determination of monoclonal antibodies can be performed with high precision because they are selective only for the same epitope, but in the case of polyclonal antibodies, since the epitopes they detect are heterogeneous and are various A mixture of antibodies with different affinities. Therefore, only the average affinity can be obtained. In order to determine antibody affinity, the following methods have existed. These include ELISA-based methods, as well as other biophysical methods such as microscale thermophoresis (MST) and surface plasmon resonance (SPR).

ELISA is the most popular method for studying antibody affinity. They do not require the use of large amounts of antibodies and antigens, nor do they require purification of the protein. In this method, a fixed concentration of antibody is incubated with the antigen in solution until a steady state is reached. Then, the concentration of the unbound antibody was measured by an indirect ELISA. This method requires prior preliminary experiments to determine the concentration of antibody used within the linear range of the ELISA reaction, and only a small fraction of the total free antibody in the solution remains on the plate (so that the measurement does not significantly affect the equilibrium in the solution).

MST is a biophysical method that detects the affinity of antibody molecules over a wide range of concentrations. It judges the affinity between molecules by measuring the movement of molecules along the infrared laser-induced microscopic temperature gradient. This movement depends on many factors, including the hydrated shell, charge and molecular size. These molecules are initially uniformly distributed in solution and free to diffuse. When the infrared laser is turned on, the unbound molecules usually move out of the heating point. The binding of one molecule to another (such as antibodies and antigens) causes the movement of the entire temperature gradient to change. The movement of the molecule can then be followed by fluorescent labeling to derive affinity parameters for the antibody molecule.

Figure 2. Determination of antibody affinity by Microscale Thermophoresis (MST).

SPR is an optical technique for detecting molecular interactions in which one molecule is immobilized in a metal film and the other molecule is mobile. The combination of these molecules changes the refractive index of the film. Therefore, when polarized light strikes the film, the extinction angle of the light changes and can be monitored by an optical detector (Figure 3).

Figure 3. Determination of antibody affinity by Surface Plasmon Resonance (SPR).

Antibody Reproducibility

Finally, verify the reproducibility of the antibody, which is an essential part of antibody detection. A common misconception in antibody testing is to assume that antibodies produce similar results, whether from the same or different batches or from different manufacturers. One of the most shocking examples is David Rim of Yale University. He developed an antibody-based assay to guide the effective treatment of melanoma and is ready to apply the assay to the clinic. However, when he ordered a new set of antibodies from the same company, he could not reproduce the original results and had to give up his work. That is to say, using antibodies from the same supplier over time, even if only the batch is different, will produce different results. Therefore, it is critical for researchers to always test for antibody repeatability. This becomes especially important when using polyclonal antibodies, as products from the same item number from the supplier may mean different antibodies.

In summary, in order to ensure that the antibody meets the specificity and affinity and reproducibility required for its use, it is necessary to perform a secondary verification strictly according to the antibody detection standard. Only in this way can the reliability of the experimental data be guaranteed.


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