Informations

Comment sécréter une protéine recombinante à partir d'E. coli ?

Comment sécréter une protéine recombinante à partir d'E. coli ?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Quelles sont les voies de sécrétion qui peuvent être utilisées pour sécréter une enzyme bactérienne recombinante à partir d'E. coli ?

J'ai une protéine recombinante (29kDa) que je vais exprimer dans des cellules E. coli BL21. Pour l'instant, j'ai soniqué E. coli pour extraire l'enzyme, mais à l'avenir, j'aimerais qu'E. coli sécrète l'enzyme.


Selon l'équipe iGEM Kyoto 2012 :

La voie de translocation jumelle d'arginate (TAT) est un système de sécrétion [endogène] chez E. coli. Ce système peut porter des protéines qui ont des séquences d'acides aminés signal torA à l'extrémité N terminale. TatA, TatB, TatC et TatD composent le complexe Tat sur la membrane interne. Le complexe Tat reconnaît le peptide signal torA et transporte ensuite la protéine (avec torA) du cytoplasme au périplasme. De plus, la protéine qui a traversé la voie TAT a coupé le signal torA. Les protéines qui sont sécrétées par ce système n'ont pas d'étiquette qui obstrue l'activation de la protéine.

L'équipe a créé une cassette avec les gènes TAT ​​pour augmenter l'expression de la voie et a également inclus le gène Kil, qui perfore la membrane externe, aidant éventuellement la diffusion externe de la protéine sécrétée. Ils ont noté, plutôt ironiquement, que

Inutile de dire que la fonction de la membrane externe en tant que membrane est essentielle à la survie d'E. coli. En d'autres termes, la surexpression de Kil provoque la mort cellulaire. Pour cette raison, nous devons trouver une quantité appropriée d'expression.

Noter: selon leur cahier de laboratoire, l'équipe n'a jamais observé de GFP extracellulaire via un microscope confocal (recherchez sur cette page « confocal »). Donc. Il faut se méfier :)

Leur page de projet comprend également des références à la littérature suivante :

  • Tracy Palmer et Ben C. Berks "La voie d'exportation de la protéine de translocation jumelle d'arginine (Tat)"
  • J.H. Choi. S. Y. Lee "Production sécrétoire et extracellulaire de protéines recombinantes à l'aide d'Escherichia coli"
  • G. Miksch · E. Fiedler · P. Dobrowolski · K. Friehs "Le gène kil du plasmide ColE1 d'Escherichia coli contrôlé par un promoteur dépendant de la phase de croissance médie la sécrétion d'une protéine périplasmique hétérologue pendant la phase stationnaire"
  • Brad A. Seibel* et Patrick J. Walsh « Accumulation d'oxyde de triméthylamine chez les animaux marins : relation avec le stockage d'acylglycérol »

Production de protéines recombinantes extracellulaires à partir de Escherichia coli

Escherichia coli est l'hôte le plus couramment utilisé pour la production de protéines recombinantes et l'ingénierie métabolique. La production extracellulaire d'enzymes et de protéines est avantageuse car elle pourrait réduire considérablement la complexité d'un bioprocédé et améliorer la qualité du produit. La production extracellulaire de protéines est nécessaire pour les applications d'ingénierie métabolique dans lesquelles les substrats sont des polymères tels que les lignocelluloses ou les xénobiotiques, car l'absorption adéquate de ces substrats est souvent un problème. Le dogme qui E. coli ne sécrète aucune protéine a été contestée par la reconnaissance à la fois de sa capacité naturelle à sécréter des protéines dans des souches de laboratoire courantes et de sa capacité accrue à sécréter des protéines dans des cellules modifiées. L'existence même de cette revue dédiée à la production extracellulaire est un témoignage des réalisations exceptionnelles réalisées collectivement par la communauté à cet égard. Quatre stratégies ont émergé pour concevoir E. coli cellules pour sécréter des protéines recombinantes. Dans certains cas, des niveaux de sécrétion impressionnants, plusieurs grammes par litre, ont été atteints. Ce niveau de sécrétion est comparable à d'autres systèmes d'expression eucaryotes. Au milieu de l'optimisme, il est important de reconnaître que des défis importants subsistent, en particulier lorsque l'on considère que le succès ne peut être prédit a priori et implique beaucoup d'essais et d'erreurs. Cette revue donne un aperçu des développements récents en ingénierie E. coli pour la production extracellulaire de protéines recombinantes et une analyse des avantages et des inconvénients de chaque stratégie.

Ceci est un aperçu du contenu de l'abonnement, accessible via votre institution.


Das, A. 1990. Surproduction de protéines dans Escherichia coli: Vecteurs, hôtes et stratégies. Méthodes en enzyme. 182: 93–112.

Holland, B., Kenny, B., Steipe, B. et Plückthun, A. 1990. Sécrétion de protéines hétérologues dans Escherichia coli. Méthodes en Enzymol. 182: 132–143.

Marston, F. et Hartley, D. 1990. Solubilisation d'agrégats de protéines. Méthodes en Enzymol. 182: 264–276.

Uhlen, M. et Moks, T. 1990. Fusions de gènes à des fins d'expression : une introduction. Méthodes en enzyme. 185: 129–143.

Bollag, D.M. et Edelstein, S.J. 1990. Méthodes de protéines, p. 32-33. Wiley-Liss, New York.

Ybe, J.A. et Hecht, M.H. 1994. Fractionnement périplasmique de Escherichia coli donne de la plastocyanine recombinante malgré l'absence d'une séquence signal. Expression et purification des protéines 5: 317–323.

Rojas, N. et Hecht, M.H. résultats non publiés.

Nikkila, H., Gennis, R.B. et Sligar, S.G. 1991. Clonage et expression du gène codant pour le cytochrome soluble b 562 de Escherichia coli. EUR. J. Biochem. 202: 309–313.

Brunet, A.P., Huang, E.S., Huffine, M.E. Loeb, J.E. Weltman, R.J. et Hecht, M.H. 1993. Le rôle des tours dans la structure d'une protéine -hélicoïdale. La nature 364: 355–358.

Franks, F. 1981. Biophysique et biochimie des basses températures et du gel, p. 3–20. Dans: Effets des basses températures sur les membranes biologiques. Morris, G.J., Clarke, A. (éd.). Presse académique, NY.

Lee, B., McKenna, K. et Bramhall, J. 1985., Études cinétiques du rescellement de la membrane érythrocytaire humaine. Biochimica et Biophysica Acta 815: 128–134.

Morris, G.J. 1981. Les liposomes en tant que système modèle pour étudier les blessures dues au gel, p. 241-262. Dans: Effets des basses températures sur les membranes biologiques. Morris, G.J., Clarke, A. (éd.). Presse académique. NEW YORK.

Hecht, M.H., Richardson, J.S., Richardson, D.C. et Ogden, R.C. 1990. De novo conception, expression et caractérisation de felix: Une protéine de faisceau à quatre hélices de séquence native similaire. Science 249: 884–891.

Kamtekar, S., Schiffer, J.M., Xiong, H., Babik, J.M. et Hecht, M. H. 1993. Conception de protéines par structuration binaire d'acides aminés polaires et non polaires. Science 262: 1680–1685.

Studier, F.W. et Moffatt, B.A. 1986. Utilisation de l'ARN polymérase du bactériophage T7 pour diriger l'expression sélective de haut niveau de gènes clonés. J. Mol. Biol. 189: 113–130.

Amman, E., Brosius, J. et Ptashne, M. 1983. Vecteurs portant un hybride trp-lac promoteur utile pour l'expression régulée de gènes clonés dans Escherichia coli. Gène 25: 167–178.


Production sécrétoire et extracellulaire de protéines recombinantes à l'aide de Escherichia coli

Escherichia coli est l'un des hôtes les plus largement utilisés pour la production de protéines recombinantes. Cependant, il y a souvent des problèmes pour récupérer des rendements substantiels de protéines correctement repliées. Une approche pour résoudre ces problèmes consiste à avoir des protéines recombinantes sécrétées dans l'espace périplasmique ou le milieu de culture. La production sécrétoire de protéines recombinantes présente plusieurs avantages, tels que la simplicité de la purification, l'évitement de l'attaque par la protéase et l'extension Met N-terminale, et une meilleure chance de repliement correct des protéines. En plus du système Sec bien établi, le système de translocation à double arginine (TAT) a récemment été utilisé pour la sécrétion efficace de protéines repliées. Diverses stratégies de production extracellulaire de protéines recombinantes ont également été développées. Pour la production sécrétoire de protéines complexes, les chaperons périplasmiques et la protéase peuvent être manipulés pour améliorer les rendements des protéines sécrétées. Cette revue traite des avancées récentes dans la production sécrétoire et extracellulaire de protéines recombinantes à l'aide de E. coli.

Ceci est un aperçu du contenu de l'abonnement, accessible via votre institution.


4. Résultats

4.1. Isolement du plasmide

L'ADN plasmidique de S. simulans a été extrait et la concentration a été ajustée à 4 μg/μL qui ont été utilisés comme matrice pour l'amplification du gène codé lysostaphin.

4.2. Construction du plasmide recombinant pET-lys

Le résultat du séquençage a été confirmé par comparaison avec la base de données à l'aide du logiciel de base de l'outil de recherche d'alignement local (BLAST). La procédure de digestion enzymatique, le test PCR et le résultat du séquençage ont montré que le gène cible a été inséré correctement dans le plasmide recombinant pET-lys (les données ne sont pas présentées).

4.3. Expression et purification de la lysostaphine mature recombinante

Le plasmide recombinant positif a été transformé dans l'hôte, E. coli BL21 (DE3). L'ajout d'IPTG a induit la surexpression d'une protéine recombinante de poids moléculaire d'environ 42 kDa. La protéine exprimée a été purifiée avec succès par chromatographie d'affinité en utilisant une résine Ni-NTA (figure 1). Le processus de purification et de dialyse a donné un rendement d'environ 30 mg de protéine purifiée à partir de 1 L de E. coli Culture BL21 (DE3) + pET-lys.

Les gels SDS-PAGE montrent un extrait cellulaire non induit de E. coli BL21 (DE3) + PET-lys pendant une heure (piste 1) et deux heures (piste 2), extrait cellulaire induit pendant deux heures (piste 3) et quatre heures (piste 4), et protéines extraites après chromatographie d'affinité Ni-NTA ( voie 5). Un marqueur de poids moléculaire élevé est affiché à gauche (piste M).


Conclusion

Nous avons conçu des LARD sur la base d'une modélisation comparative de P. fluorescens lipase et les a attachés génétiquement à la GFP et à l'EGF. Deux LARD différents (LARD0 et LARD1) contenaient une structure à rouleaux β et soit un lieur Pro-Gly, soit un site de facteur Xa entre les protéines de fusion et les LARD. Nous avons également attaché génétiquement la lipase entière (TliA) à GFP, EGF et CTP. Les protéines fusionnées avec la lipase entière ont été sécrétées dans E. coli avec le transporteur ABC et a montré une activité lipase sous forme de forme fusionnée intacte dans le surnageant. La GFP et l'EGF fusionnés avec des LARDs ou TliA ont été exportés dans le milieu extracellulaire en E. coli contenant le transporteur ABC de P. fluorescens et E. chrysanthémi. Dans ce rapport, seuls E. coli a été explorée en tant qu'hôte d'expression pour la possibilité d'un transporteur ABC pour la production de protéines recombinantes. L'expression sécrétoire des protéines de fusion dans E. coli s'étendra à ceux qui P. fluorescens dans lequel les transporteurs ABC TliDEF sont mieux exprimés [13]. P. fluorescens supplémenté avec TliDEF produit de la lipase extracellulaire jusqu'à environ 15 % de protéines totales [13]. Une usine de fabrication de protéines efficace devrait être construite en utilisant Pseudomonas en tant qu'hôte.


ABSTRAIT

Protocoles de culture standard pour les cultures à haute densité cellulaire de recombinants E. coli compter sur l'enrichissement de l'air avec de l'oxygène pour éviter la limitation de l'oxygène. Cette façon d'augmenter l'approvisionnement en oxygène a un impact sur l'économie du procédé en raison du coût élevé de l'oxygène pur. La pressurisation du réacteur est une approche alternative pour améliorer le transfert de masse d'oxygène. Dans la présente étude, la performance du bioréacteur à air comprimé sous pression dans la croissance rE. coli cellules a été évaluée. Les expériences ont été réalisées dans un bioréacteur à airlift à boucle interne (ALB) pressurisé et dans un réacteur à cuve agitée non pressurisé (STR), tous deux d'un volume utile de 5 L, équipés d'un système de contrôle et de surveillance automatique de la pression, de la température, du pH, et l'oxygène dissous. La pressurisation s'est avérée cruciale pour améliorer les performances de l'ALB dans la formation de la biomasse (29 gDCW L −1 ) et la production de protéines (201 mgprotéine gDCW −1 ), ce qui entraîne une productivité protéique (240 mgprotéine −1 h −1 ) et efficacité énergétique (11 gprotéine kWh −1 ) similaire à celui obtenu en STR (200 mgprotéine L -1 h -1 et 13 gprotéine kWh -1 , respectivement). En raison du coût élevé de l'oxygène pur, l'enrichissement de l'air s'est révélé économiquement irréalisable pour l'ALB. En pressurisant le bioréacteur jusqu'à 0,41 MPa, sans apport d'oxygène pur, une augmentation de 8,7 fois l'efficacité économique est estimée, ce qui montre le potentiel de cette stratégie innovante pour les cultures aérobies.


Conditions de culture et suivi de la croissance

Changer les conditions de la culture est le moyen le plus simple de modifier la croissance de E. coli et a un impact direct sur le rendement volumétrique de la protéine recombinante. Les chercheurs négligent souvent les bénéfices de l'optimisation des facteurs externes (hormis la température de la culture après induction). Auparavant, nous avions alerté que le milieu Luria-Bertani (LB) (sans doute le milieu le plus populaire pour la culture E. coli) est loin d'être le milieu le plus adapté à la surproduction de protéines. 4 Le simple passage à des bouillons plus riches (comme Terrific Broth) conduit à des densités cellulaires finales plus élevées. En outre, les milieux d'auto-induction ont gagné en popularité et de nombreux exemples de production de protéines réussie en cultivant E. coli dans les milieux d'auto-induction abondent dans la littérature. Les milieux d'auto-induction sont constitués d'au moins deux sources de carbone : le glucose et le lactose (du glycérol est également ajouté pour augmenter les rendements). 62 Le glucose est la source de carbone préférée, et une fois épuisé (généralement pendant la croissance exponentielle), le lactose commence à être consommé. Ceci, à son tour, induit la production de protéines à partir de systèmes basés sur la lac promoteur. L'utilisation de milieux d'auto-induction présente plusieurs avantages : des densités bactériennes plus élevées sont atteintes, le moment de l'induction est hautement reproductible et l'arrêt de la culture pour l'ajout d'IPTG n'est plus nécessaire. Briand et al. ont montré que l'auto-induction peut également être obtenue en modifiant de manière interne le métabolisme cellulaire. Ils ont découvert par hasard que la production de Hsp70 humaine dans E. coli interfère en quelque sorte avec la fonction de l'enzyme endogène glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase, conduisant indirectement et par conséquent à l'élimination de LacI et à l'expression subséquente du gène d'intérêt, si sous l'influence du promoteur à base de lac. 63 Cette plateforme (nommée SILEX, Selfe-jenducibLe Expression) permet l'auto-induction sans aucune adaptation du milieu et fonctionne dans de nombreuses conditions de culture.

Les milieux complexes offrent une disponibilité abondante de nutriments mais peu de contrôle sur l'état métabolique des cellules en culture. La production de protéines est favorisée en abaissant le taux de croissance afin que l'équilibre entre la synthèse et le repliement puisse être atteint. La température de culture est le moyen le plus simple de manipuler le taux de croissance. Cependant, dans les grands bioréacteurs, le contrôle de la température peut augmenter les coûts de production de manière exponentielle, de sorte que d'autres moyens de contrôle du taux de croissance sont utilisés. Nous partageons le point de vue de Krause et al. qu'il existe une déconnexion entre les principes appliqués à la production de protéines recombinantes dans les cultures fed-batch et les cultures en flacons agités. 64 Dans le premier cas, le degré d'aération et le taux d'alimentation en glucose sont étroitement surveillés, car ces paramètres sont de la plus haute importance pour atteindre des rendements élevés. Cependant, à l'échelle du laboratoire, cela est rarement pris en compte. Heureusement, les avancées dans ce domaine montrent des résultats prometteurs qui conduiront à leur adoption. Par exemple, un apport contrôlé de source de carbone dans des flacons à agitation a été obtenu par une libération contrôlée de glucose par sa diffusion à partir de billes de silicone 65 ou une dégradation in situ de polysaccharides. 66 La disponibilité de l'oxygène peut être modulée par une conception de flacon appropriée 67 ou par l'ajout d'huiles oxygénées non miscibles. 68 Enfin, des dispositifs de contrôle de ces paramètres et d'autres ont été adaptés aux cultures en microplaques et en flacons agités afin de trouver les meilleures conditions de production de protéines recombinantes. 69 Cependant, étant donné que la surveillance des conditions de culture à l'échelle des flacons agités implique du matériel spécialisé, elle n'est toujours pas largement utilisée.

Enfin, la lumière pourrait bientôt devenir un autre paramètre à ajuster pendant la culture avec l'introduction des T7RNAPs inductibles par la lumière bleue (Opto-T7RNAPs). 70 Pour créer l'Opto-T7RNAP, la polymérase a été divisée en deux parties, qui ont ensuite chacune été fusionnées à des dimériseurs photo-inductibles. Lors de l'éclairage de la culture avec des LED émettant de la lumière bleue, les dimérisations interagissent et un T7RNAP fonctionnel est généré. Ainsi, la lumière bleue agit comme un inducteur d'expression. De plus, Opto-T7RNAP se dissocie dans l'obscurité, permettant ainsi un contrôle dynamique et précis de la production de protéines. Les systèmes lumière bleue/Opto-T7RNAP peuvent remplacer l'IPTG en tant qu'inducteur, ce qui est une caractéristique intéressante, en particulier dans les fermentations à grande échelle.


Production, collecte et purification de protéines recombinantes

Plusieurs protéines ont été produites par des vecteurs d'expression mammifères. Le rendement de la synthèse protéique dans certains cas, est augmenté en insérant un intron entre le promoteur et le gène cloné. Cependant, la raison de ceci n'est pas claire.

Expression coordonnée:

En coordonnant l'expression d'un gène cloné et d'un marqueur sélectionné, la production de protéine recombinante peut être augmentée. L'expression coordonnée de DHFR (marqueur) et d'un gène cloné est illustrée sur la figure 11.5. Le gène DHFR est inséré à proximité d'un gène cloné et tous deux sont sous le contrôle d'un seul promoteur et de séquences de terminaison (polyadénylation). Le gène DHFR est flanqué d'une séquence d'élimination des introns. Au fur et à mesure que les gènes sont exprimés, la DHFR est synthétisée par un transcrit primaire tandis que la protéine recombinante est formée à partir d'ARNm épissé.

Expression de deux gènes clonés:

Certaines protéines sont composées de deux ou plusieurs sous-unités. Par exemple, l'hémoglobine est un tétramère avec deux copies de chaque sous-unité, c'est-à-dire α2??2. Chaque sous-unité peut être synthétisée séparément par le gène cloné correspondant, et elles sont ensuite mélangées pour former la protéine multimère in vitro. Cette méthode n'est pas très satisfaisante car l'assemblage in vitro de protéines multimères n'est pas efficace. Des techniques ont été développées ces dernières années pour produire simultanément deux protéines différentes (c'est-à-dire des sous-unités d'une protéine multimère) dans la même cellule.

Système d'expression à deux vecteurs :

Deux vecteurs d'expression, portant chacun un gène cloné pour chaque sous-unité, sont co-transfectés dans des cellules hôtes (Fig. 11.6). Ces gènes codent pour les sous-unités protéiques correspondantes. Ils s'assemblent ensuite pour former une protéine fonctionnelle. Le système d'expression à deux vecteurs présente certaines limites — perte d'un vecteur, surexpression du gène cloné dans l'un des vecteurs. Cela provoque un déséquilibre dans la formation et l'assemblage des sous-unités.

Vecteur d'expression à deux gènes:

Un seul vecteur portant deux gènes clonés est utilisé pour surmonter le problème ci-dessus. Les deux gènes peuvent être placés sous le contrôle indépendant de promoteurs et de séquences de polyadénylation (Fig. 11.7) pour produire la protéine assemblée avec deux sous-unités. Cette méthode, cependant, ne garantit pas la production de quantités égales de deux sous-unités.

Vecteur d'expression dicistronique:

Un vecteur dicistronique peut être construit avec deux gènes clonés réunis à une petite séquence d'ADN qui contient un site d'entrée ribosomique interne (IRES). Les IRES, trouvés dans les virus de mammifères, permettent une transcription et une traduction simultanées pour produire la protéine assemblée (Fig. 11.8). La transcription du gène-IRES-gène est sous le contrôle d'un seul promoteur et de signaux de terminaison. En utilisant un vecteur d'expression dicistronique, la synthèse de quantités égales de sous-unités protéiques peut être réalisée.

Collecte et purification de protéines recombinantes:

Au fur et à mesure que les protéines recombinantes sont produites par les gènes clonés, elles commencent à s'accumuler. La tâche suivante consiste à collecter et à purifier le produit génique spécifique, c'est-à-dire la protéine requise. Ce n'est pas une tâche facile car la protéine recombinante est souvent étrangère à la cellule hôte qui possède une machinerie enzymatique pour dégrader les protéines extérieures.

Ainsi, l'insuline humaine produite dans les cellules hôtes bactériennes peut être dégradée par les protéases. Ce problème peut être résolu en utilisant des souches bactériennes (par exemple, E. coli) déficientes en protéases. Mais il y a un inconvénient puisque les protéases sont des enzymes défensives et donc les nouvelles souches dépourvues de ces enzymes sont susceptibles d'être facilement détruites.

Dans une approche alternative, les protéines recombinantes sont fusionnées avec les protéines hôtes natives. Les protéines de fusion sont résistantes à l'activité protéase. Parfois, les protéines étrangères s'accumulent sous forme d'agrégats dans l'organisme hôte, minimisant la dégradation de la protéase. Le problème avec les agrégats de protéines est que l'activité biologique peut être perdue lors de l'extraction de la protéine des agrégats.

Exportation et sécrétion de protéines recombinantes:

Le rendement de production de protéines recombinantes est efficace si elles sont rapidement exportées et sécrétées dans l'environnement (milieu environnant). En outre, la récupération et la purification des protéines étrangères sont plus faciles à partir des protéines exportées. Des efforts sérieux ont été faits pour développer des procédés pour augmenter l'exportation de protéines recombinantes.

Certaines espèces de la bactérie Bacillus subtilis sécrètent normalement de grandes quantités de protéines extracellulaires. Une courte séquence d'ADN, appelée séquence signal de ces espèces, est introduite dans d'autres B. subtilis. Ces bactéries produisent de l'ADN recombinant marqué avec un peptide signal, qui favorise l'exportation et la sécrétion (Fig. 11.9). Le peptide signal peut être éliminé après purification de la protéine étrangère.

La séquence signal et le peptide signal ont en fait été utilisés efficacement pour la production d'insuline recombinante.

Purification des protéines recombinantes:

Il existe plusieurs techniques utilisées pour la purification de protéines recombinantes à partir d'un mélange de protéines sécrétées.

Protéines de fusion et purification:

La production de protéine de fusion a été décrite. En plus de réduire la dégradation, les protéines de fusion simplifient la purification des protéines recombinantes. Quelques techniques de purification sont brièvement décrites ci-dessous.

Marquage d'affinité:

Dans cette technique, une petite séquence d'ADN codant pour un peptide (une courte séquence d'acides aminés) est ligaturée au gène cloné. Ce peptide, à son tour, a une affinité pour se lier à un composé ou une macromolécule ou même un élément. La séquence d'acides aminés étiquetée, qui fait partie de la protéine recombinante, agit comme une étiquette d'affinité ou une étiquette d'identification. L'utilisation de l'étiquette hexahistidine est brièvement décrite dans la colonne suivante.

La séquence d'ADN qui code pour six résidus histidine (His6) est lié à un gène cloné. La protéine de fusion (c'est-à-dire la protéine recombinante marquée avec His6) peut être isolé en faisant passer le mélange d'extrait cellulaire à travers une colonne garnie de billes d'agarose nickel-acide triacétique.

La protéine recombinante souhaitée par ses résidus hexahistidine se lie aux ions nickel (Ni 2+ ). Le reste des protéines peut être facilement élué de la colonne. Les protéines de fusion liées peuvent ensuite être éluées en abaissant le pH de la solution tampon. En variante, les protéines de fusion peuvent être sélectivement éliminées par liaison du marqueur heaxahistidine à un composé compétiteur tel que l'imidazole.

L'étape suivante consiste à retirer l'étiquette d'hexahistidine. Cela peut être fait par digestion avec des protéases qui agissent spécifiquement au site de l'étiquette. Il est nécessaire d'éliminer les résidus d'hexahistidine uniquement si la protéine recombinante est utilisée comme agent thérapeutique. Pour toutes les autres fins, le marqueur hexahistidine est acceptable, car il n'interfère pas dans la structure et la fonction normales des protéines.

Purification par immunoaffinité:

La technique de purification chromatographique par immunoaffinité des protéines de fusion avec une référence particulière à l'interleukine-2 humaine est décrite. Le gène de l'interleukine-2 joint à une petite séquence d'ADN codant pour un peptide marqueur (qui synthétise 8 acides aminés, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) produit une protéine de fusion chez la levure (S. cerevisiae). Le peptide marqueur a une double fonction : il réduit la dégradation de l'interleukine-2, en plus d'aider à sa purification.

La protéine de fusion, l'interleukine-2 jointe à un peptide marqueur peut être purifiée par chromatographie d'immunoaffinité (Fig. 11.10). Les anticorps monoclonaux (MAb) spécifiques contre le peptide marqueur sont immobilisés sur un support en polypropylène. Ces MAb servent de ligand (anticorps anti-peptide marqueur) et se lient sélectivement aux protéines de fusion marquées avec le peptide marqueur. Cependant, les protéines restantes passent à travers la colonne d'immunoaffinité. Les protéines de fusion immuno-purifiées peuvent être éluées plus tard de la colonne.


7 étapes impliquées dans la préparation d'un ADN recombinant

Les points suivants mettent en évidence les sept étapes impliquées dans la préparation d'un ADN recombinant. Les étapes sont : 1. Sélection de l'ADN cible 2. Sélection d'un ADN vecteur de clonage approprié ou d'un ADN véhicule 3. Sélection des endonucléases de restriction 4. Procédure de production d'ADN recombinant (ADNr) 5. Introduction de l'ADNr dans une cellule hôte 6. Sélection des cellules transformées/transfectées et 7. Isolement de la cellule contenant l'ADNr vecteur d'insertion contenant le gène d'intérêt

Étape # 1. Sélection de l'ADN cible :

L'ADN cible est sélectionné en tenant compte des points suivants :

(a) Il devrait être facilement extractible de sa source d'existence naturelle.

(b) Il doit pouvoir être incorporé dans le vecteur à un endroit où il peut être répliqué, transcrit et traduit comme souhaité.

(c) Le produit génique (protéine) produit doit être soit commercialement important, soit important à des fins de recherche.

(d) L'ADN étranger (gène) d'intérêt peut être viral, bactérien, d'origine végétale ou animale.

Les gènes des protéines suivantes sont généralement clonés, c'est-à-dire insérés dans l'ADN vecteur et les ADN recombinants produits et la protéine extraite pour un usage humain.

Étape # 2. Sélection d'un ADN vecteur de clonage ou d'un ADN véhicule approprié :

Le vecteur de clonage est la molécule d'ADN dans laquelle l'ADN cible est introduit, produisant la molécule d'ADN recombinante. Un bon véhicule de clonage est un véhicule qui n'a qu'un seul site de coupure par une endonucléase de restriction particulière. Il existe différents types de vecteurs qui peuvent être utilisés pour cloner des fragments d'ADN étranger et les propager (cloner) dans un hôte approprié.

Plasmide:

Ce sont des éléments génétiques extra-chromosomiques trouvés dans une variété d'espèces bactériennes. Ce sont des molécules d'ADN circulaires fermées à double brin dont la taille varie de 1 kb à 200 kb. Souvent, les plasmides contiennent des gènes codant pour des enzymes qui, dans certaines circonstances, sont avantageuses pour l'hôte bactérien.

Les phénotypes conférés par différents plasmides sont :

je. Résistance aux antibiotiques.

ii. Fabrication d'antibiotiques.

iii. Dégradation de composés organiques complexes.

iv. Production de colicines.

v. Production d'entérotoxines.

vi. Production d'enzymes de restriction et de modification.

Pour être utile comme vecteur de clonage, le plasmide doit posséder plusieurs propriétés, comme :

je. Il doit porter un ou plusieurs marqueurs sélectionnables pour permettre l'identification des transformants et pour maintenir le plasmide dans la population bactérienne.

ii. Il doit contenir un site de reconnaissance unique pour une ou plusieurs enzymes de restriction dans les régions du plasmide qui ne sont pas essentielles pour la réplication.

iii. Il doit être relativement petit et doit se répliquer de manière détendue.

iv. De préférence, ces sites de restriction, dans lesquels l'ADN étranger peut être inséré, doivent être situés dans les gènes codant pour des marqueurs sélectifs, de sorte que l'insertion d'un fragment d'ADN étranger inactive le gène.

Certains plasmides couramment utilisés comme vecteurs pour la préparation d'ADN recombinant sont-pMB-9, pBR-322, pBR-325, pKC-7, pAC-4, C-184, pAC-105, pMK-16, pMF-3, pBRHI, pUB-110 et pCB-16.

Bactériophages :

Les bactériophages sont communément appelés phages. Ce sont les virus qui infectent les bactéries. Semblables à d'autres virus, les phages sont très simples et contiennent une enveloppe protéique appelée capside, renfermant des molécules d'ADN ou d'ARN en tant que génome. Les gènes de ce génome comprennent le gène de réplication de l'ADN/ARN du phage et le gène de l'enveloppe protéique.

Bactériophage Lambda (λ) :

L'infection est causée par la particule du phage en attaquant à l'extérieur de la bactérie et en injectant son chromosome d'ADN dans la cellule. Cet ADN, d'environ 50 kb, linéaire-double brin, avec des extrémités complémentaires simple brin de 12 nucléotides de long (extrémités cohésives), s'arrange en cercle dans la cellule hôte par appariement d'extrémités cohésives et est transcrit sous forme de molécule circulaire, au cours de la phase précoce d'infection. Au cours de cette phase, le phage peut adopter soit une phase lytique, soit une phase lysogène.

Au cours de la phase lytique, l'ADN du phage reste indépendant dans la cellule, se réplique, code pour les protéines de la capside et forme un grand nombre de particules de phage dans la cellule, entraînant la lyse (rupture) de la cellule bactérienne et libérant ainsi la particule de phage. Au cours de la phase lysogène, l'ADN du phage est incorporé dans le chromosome bactérien et existe ainsi pour de nombreuses divisions cellulaires, tout en synthétisant les composants de la capside et en libérant occasionnellement des particules de phage. Cela peut se transformer en phase lytique à tout moment.

Bactériophage M13 :

C'est un très petit phage à ADN simple brin de 10 Kb. L'injection d'une molécule d'ADN M13 dans un E. coli se fait via le pilus c'est-à-dire la structure qui relie deux cellules lors de la conjugaison sexuelle. À l'intérieur de la cellule, l'ADN synthétise un brin complémentaire et devient l'intermédiaire double brin connu sous le nom de forme réplicative (RF).

Le brin d'origine est le brin (+) et le brin complémentaire est le brin (-) fabriqué dans la bactérie. Seul le brin (+) est emballé dans les nouvelles couches de phage. RF de Ml3 agit comme un plasmide, qui peut être facilement obtenu à partir de cellules E. coli et utilisé pour la technologie de l'ADNr. Certains des vecteurs M13 sont M13 mp2, M13 mp5, fdlOl, fdl07, fd-tet.

Cosmides :

Cosmid est un vecteur de clonage constitué du site cos lambda (extensions cohésives monocaténaires aux extrémités de la molécule d'ADN) inséré dans un plasmide, utilisé pour cloner des fragments d'ADN jusqu'à 40 Kb. La taille maximale de l'ADN pouvant être introduit dans n'importe quel plasmide est de 5 kb et celle du bactériophage Ml3 est inférieure à 3 Kb.

Par conséquent, il deviendra difficile d'insérer et de cloner de grands gènes, en particulier ceux de l'ADN eucaryote. Ex. Le gène du collagène alpha-2 du poulet est de 38 Kb. Ainsi, le génome du bactériophage lambda a été modifié par Collins et John en 1978 en supprimant certaines bases et en introduisant des séquences d'extension complémentaires simple brin aux extrémités de sa molécule d'ADN appelée site Lambda Cos, afin de faciliter l'insertion et le clonage de grosses molécules d'ADN.

En raison de leur capacité à contenir des ADN de grande taille, les cosmides sont utilisés pour construire une bibliothèque génomique, c'est-à-dire un ensemble de gènes recombinants contenant l'intégralité de l'ADN présent dans un organisme individuel. La construction de bibliothèques dans des vecteurs bactériophages X s'est avérée être un moyen efficace d'isoler des segments d'ADN à partir de génomes eucaryotes complexes.

Les cosmides sont identifiés par :

1. Un marqueur de résistance aux médicaments et une origine plasmidique de réplication.

2. Un ou plusieurs sites de restriction uniques pour le clonage.

3. Un fragment d'ADN qui porte les extrémités cohésives ligaturées (site cos) pour le bactériophage X.

4. Petite taille afin d'accueillir les fragments d'ADN eucaryotes de 40-45 kb de longueur.

Étape # 3. Sélection des endonucléases de restriction :

Ce sont des endonucléases (enzymes) qui ne coupent les molécules d'ADN qu'à un nombre limité de séquences nucléotidiques spécifiques qui sont des palindromes non méthylés. L'action de certaines endonucléases donne des fragments d'ADN avec des extrémités collantes/cohésives tandis que d'autres donnent des fragments d'ADN à extrémités franches. Quelques endonucléases de restriction sont représentées sur la figure.

Étape # 4. Procédure de production d'ADN recombinant (ADNr) :

(a) Préparation des constructions d'ADN d'insertion de vecteur de clonage :

L'ADN cible est extrait de l'organisme source qui peut être soit une bactérie, un champignon, une plante ou un ADN cellulaire animal, par diverses méthodes analytiques pour lesquelles les cellules sont d'abord brisées pour libérer le contenu soit par rupture mécanique (broyage de matière congelée) soit par l'utilisation de produits chimiques comme le lysozyme, l'EDTA, le détergent-dodécyl sulfate de sodium (SDS), etc., seuls ou en combinaison avec un ou plusieurs produits chimiques.

Puis l'ADN est purifié à partir de l'extrait cellulaire pour lequel l'extrait est traité par des protéases et des endonucléases puis les protéines précipitées au phénol et au chloroforme et enfin centrifugées. L'ADN sera mesuré dans un spectrophotomètre à 260 nm, à cette longueur d'onde l'absorbance (A260) de 1,0 correspond à 50 pg d'ADN double brin/ml.

Cette absorbance ultraviolette peut également être utilisée pour vérifier la pureté d'un ADN dans lequel le rapport d'absorbance de l'ADN à 260 nm et 280 nm (A260/UNE280) is 1.8. The ratio less than 1.8 indicates that the preparation is contaminated, either with protein or phenol. Similar procedure is followed to extract the DNA from the vectors. The target DNA is then inserted into the vector DNA, by various procedures.

Two of them are described below:

(i) rDNA formation by the use of restriction endonuclease creating sticky ends:

To join together two duplex DNAs from different species, the two DNAs are separately acted upon by the same restriction endonuclease (BamHI) giving staggered (cohesive/sticky) two stranded cut. Therefore the staggered ends of the two DNAs will be complementary in sequence. Then the two cut DNAs are heated, mixed and cooled, so the sticky ends will base-pair to produce a new kind of recombinant DNA which is joined by DNA ligase.

(ii) rDNA formation by use of restriction endonuclease creating blunt ends:

Both the target DNA and the vector DNA are acted Upon by the same restriction endonuclease (Haelll) producing blunt ends. Poly ‘G’ tails are added at the 3′ ends on both strands of the target duplex DNA and poly ‘C’ tails at the 3′ end of the vector DNA by the use of enzyme terminal transferase. Since these two added tails are complementary to each other, they will enable the two DNAs to be paired with the created cohesive ends upon heating and cooling. The nicks are joined by the enzyme ligase.

(b) Preparation of Complementary DNA (cDNA):

It is a cloning technique which involves the con­version of purified mRNA to DNA, prior to its insertion into a vector. Depending upon the source of mRNA its purification procedure varies and in fact many methods for purification of mRNA are avail­able.

The mRNA of interest i.e. beta-globin gene mRNA is obtained by lysing the reticulocytes and the polyribosomes are collected by centrifugation and treated with antibody specific for this protein. The antibody will attach to the just complete protein on the polyribosome and precipitate it. From this precipitate the mRNA is obtained by affinity column chromatography.

The mRNA obtained so, is used as a template and a complementary DNA (cDNA) is made with the enzyme reverse transcriptase. All eukaryotic mRNAs contain poly ‘A’ tails at the 3′ end. Therefore a poly T nucleotide is added, which base pairs with the poly ‘A’ tail of mRNA. This serves as the primer for the enzyme reverse transcriptase that now tran­scribes the mRNA to make a new complementary strand of cDNA.

The mRNA is then removed and the single stranded cDNA is now replicated by DNA polymerase-I to yield a ‘hairpin’ double stranded DNA. The hair pin and poly A & T tails are cleaved by nucleases. Thus a synthetic double stranded cDNA, specific for the protein beta-globin is produced.

The complimentary DNA prepared above is inserted into a vector (plasmid, phage-DNA etc.). For insertion, a poly ‘A’ tail is added to the opposite 3′ ends of the two strands of the duplex cDNA by terminal transferase. Then the plasmid or vector is opened at a single point to yield the linear DNA by the action of restriction endonuclease producing flush/blunt ends.

Conversely, poly ‘T’ tails are attached to the two 3′ ends of the linear plasmid vector. The tailed linear plasmid and the tailed DNA are allowed to undergo base pairing by heating, mixing and cooling, thereby forming an enlarged circular plasmid containing the new gene i.e. the rDNA. The ends are joined by ligase.

(c) Construction of a DNA Probe:

If the amino acid sequence of a protein/peptide is known then a DNA probe can be chemically synthesized and used to prepare a rDNA and thus clone it in a suitable host. This DNA probe can also be used to screen the gene for this particular protein/peptide in the genomic library.

The DNA probe obtained by this method is not the exact sequence as present naturally in the genomic DNA, because the genetic code is degenerate i.e. more than one codon exists for some of the amino acids. Hence all the possible coding sequences for a given amino acid sequence have to be prepared.

Supposing the following is the amino acid sequence of a part of a peptide:

The nucleotide sequence obtained in any one of the mentioned sequences above, will serve the purpose of formation of rDNA and it’s cloning, resulting in the production of the same desired protein/peptide.

Étape # 5. Introduction of the rDNA into a Host Cell:

The rDNA produced in the 4 th step above can be cloned (made into many copies) and/or its gene product expressed by introducing it into a suitable host. Various methods are adopted for introduction of the different vectors into different hosts. Any DNA molecule can be introduced into any living cell and the process is called transformation. Transfection is a process of introduction of purified phage DNA.

(a) When the DNA molecule is kept in close proximity of bacterial cells, most species of bacteria are able to take up DNA molecules from the medium without any difficulty.

(b) Some species of bacteria cannot take DNA easily hence they have to be treated physically and/ or chemically in order to make them competent to take up DNA molecules.

(c) E. coli cells incubated with ice-cold solution of 50 mM calcium chloride at 4°C for 30 minutes, become competent to take up DNA molecules, wherein the DNA molecules get attached to the cell exterior. Later the DNA molecules enter the cell upon incubation at 42°C for 2 minutes.

(d) Even after the above mentioned physical/and/or chemical treatment, only 0.01% of the bacterial cells in the same culture gets transformed. Hence the transformed cells have to be selected from non-transformed cells.

(e) Transfection of phage DNA into bacterial cells is also done by the same procedure as that of plasmid introduction into E. coli cells, described above (a) to (d).

(f) Transfection can also be done by packaging the phage DNA into the mature lambda phage particle and then infecting the bacterial cells with it.

(g) The yeast cells of Saccharomyces cerevisiae are transformed by treatment with lithium chloride or lithium acetate.

(h) Calcium phosphate, DEAE dextran and protoplast fusion are used to introduce DNA into the ani­mal cells.

(i) The cell wall of fungal and plant cells are broken by enzymes to get the intact protoplast, which can easily take up DNA. In some cases, the transformation of protoplast is stimulated by a special technique called electroporation. The transformed protoplast reforms the cell wall, divide and regenerate a transformed organism.

(j) An alternative method of introducing any DNA into any of the living cells is by microinjection, using a fine syringe, DNA molecules are directly injected into the nucleus of the cell to be transformed.

Étape # 6. Selection of the Transformed/Transfected Cells:

All the cells, incubated in the same culture with the rDNA do not take up the DNA even after physical and/or chemical treatment. Only 0.01% of the total cells incubated becomes competent and takes up DNA to be inserted. Rest of the cells remain without taking up the DNA. Therefore there should be some procedure by which the cells that have taken up the external DNA can be sorted out from those cells which have not taken up the external DNA.

There are various methods for distinguishing the transformed cells from the non-transformed cells, which depends upon the type of vector used and the type of the cell transformed. The basic principle in all these methods is the use of a ‘marker’ i.e. either the vector or the transformed cell will either be resistant or sensitive to an antibiotic and/or will synthesize or be devoid of an enzyme acting on a metabolite and converting it into some recognizable product. Thus the ‘markers’ are the antibiotics and/or enzymes to which the transformed cells respond.

One of the example based on which all the above phenotypic markers are selected, is that of the plasmid cloning vector pBR322. E. coli cells are normally sensitive to the antibiotic ampicillin and tetracycline i.e. they die if the medium in which they are grown is supplied with these antibiotics.

E. coli cells which take up the plasmid vector pBR 322 become resistant to ampicillin and tetracycline antibiotics because pBR 322 has two sets of genes, one set of gene that codes for P-lactamase enzyme that modifies ampicillin into a form that is non-toxic to the bacterium and a different set of genes that codes for enzymes that detoxify tetracycline.

So, those E. coli cells which have taken pBR322 (i.e. transformed cells) can be sorted out from the cells which have not taken pBR322 (i.e. non-transformed cells) by growing all the cells in medium containing ampicillin and tetracycline wherein the cells containing the plasmid pBR322, survive, whereas the cells devoid of pBR322 die.

This is to say that the E. coli cells have transformed from ampicillin and tetracycline sensitive (amp s -tet s ) to ampicillin and tetracycline resistant (amp R -tet R ) cells. rDNA prepared using the plasmid pBR322, when entered into an E. coli cell exhibits only ampicillin resistance but not tetracycline resistance, because the restriction endonuclease (Bam-II) used, cleaves pBR322 in the gene for tetracycline resistance, hence this gene gets inactivated.

Étape # 7. Isolation of the Cell Containing Insert-vector rDNA Holding the Gene of Interest:

In the 6 th step the transformed cells i.e. those cells that have taken up the rDNA are sorted out. Now from these cells the cell containing the gene of interest has to be isolated. The complete human genomic DNA is cleaved into about 7,00,000 pieces by the action of the restriction endonuclease and all of these DNA fragments can be inserted into a cosmid and such an insert containing all the genomic DNA of an organism is called genomic library.

An E. coli genomic library contains all E. coli genes and likewise human genomic library contains all human genes, so on and so forth. From this gene library any one gene, which is commercially important i.e. for example insulin gene, beta-globin gene, growth hormone gene etc., has to be isolated. For this each cell is cloned separately and different procedures are adopted to select the desired clone.

All these procedures are based on two basic themes:

1. Direct Selection of the Desired Gene:

This is just like marker selection procedure, described above, where selection occurs directly in the culture plate itself by the detection of the presence of the protein product of that gene.

2. Identification of the Clone from a Genomic Library:

In this an initial “shot gun” cloning is done to clone all the genes in the genomic library and each gene clone is identified separately by one of the following methods:

(a) By analysing the expression of the gene product.

(b) A DNA probe can be synthesized chemically with a complementary sequence to the desired gene and used to hybridize the DNA from each clone.

(c) A complementary DNA (cDNA) can be prepared from mRNA for a particular gene and then hybridized with the DNA insert.

Hybridization of DNA with another DNA can be done or DNA with RNA or RNA can be hybrid­ized with another RNA, for which different methods are developed.

A few among them are:

je. When DNA-DNA hybridization is made then it is known as southern blotting.

ii. When DNA-RNA hybridization occurs, it is known as northern blot.

iii. When RNA-RNA hybridization occurs, it can be called eastern blot. Actually eastern blot is named for hybridization between protein and ginseng (plant glycoside) so as to identify small molecules like cholesterol, phospholipids etc.

iv. When protein-protein hybridization takes place, it is known as western blotting.

Southern and northern blot hybridization:

DNA is fragmented by restriction endonuclease and then separated by electrophoresis. The DNA is then denatured and filtered on nitrocellulose. To this filter is added radio labelled 32 P-DNA probe, with base sequence complementary to the DNA (gene) of interest, which will hybridize (stick/base pair/anneal) to the complementary DNA. The position of hybridization is detected by autoradiography. The radiolabelled probe specific for gene under study can be purified RNA, a cDNA, or a segment of DNA cloned in E. coli.

In AIDS diagnosis, the component protein of HIV-virus are separated in polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and trans blotted onto nitrocellulose strips, which are then incubated with individual’s serum. Any HIV antibodies present, bind to viral proteins contained on test strip. The bound antibody visualized by using a conjugate enzyme and chromogenic.

Dot-blot hybridization:

The procedure is the same as southern/northern blotting, but the only difference is that the DNA fragments are not separated by electrophoresis, instead they are directly applied as a dot on nitrocellulose and hence it is known as dot-blot hybridization.

Uses of rDNA technology/gene cloning:

The uses of rDNA technology/gene cloning are enormous and wide spread in all the fields of biological sciences. rDNA technology is being implemented in newer and newer fields of application.

To quote a few uses of rDNA in use at present are:

(1) By the use of rDNA technology, genes of interest can be inserted, so as to treat various diseases.

(2) Hereditary diseases can be diagnosed in the fetus itself.

(3) rDNA and gene cloning helps in the sequencing of DNA/gene.

(4) Various genes in the chromosomes can be located and the integrated viral genes can be traced out in it.

(5) Mechanism of gene regulation can be studied.

(6) Desired proteins like insulin, hormones, interferon’s, vitamins can be manufactured in bacteria on an industrial basis.

(7) Improved antibiotics can be produced from mixtures of genes from different bacteria.

(8) Recombinant vaccines can be produced by rDNA technology.

Synthesis of human insulin (humulin) using rDNA technology:

Diabetic patients, whose elevated sugar levels are due to impaired insulin production, have been treated with insulin derived from the pancreatic glands of abattoir animals. Though bovine and porcine insulin are similar to human insulin, their composition is slightly different. Consequently, a number of patients’ immune systems produce antibodies against it, neutralizing its actions and resulting in inflammatory responses at injection sites.

This led to synthesizing human insulin i.e. ‘humulin’ by inserting the insulin gene into a suitable vector, the E. coli bacterial cell, to produce insulin that is chemically identical to its naturally produced counter­part. Le code génétique de l'insuline se trouve dans l'ADN au sommet du bras court du onzième chromosome. It contains 153 nitrogen bases (63 in the chain A and 90 in the chain B).

Manufacturing humulin:

DNA with specific nucleotide sequences for A and B polypeptide chains of insulin are synthesized chemically. 63 nucleotides are required for synthesizing the chain A and 90 for the B chain, plus a codon at the end of each chain, signalling the termination of protein synthesis.

An anticodon, incorporating the amino acid methionine, is then placed at the beginning of each chain which allows the removal of the insulin protein from the bacterial cell’s amino acids. The synthetic A and B chain ‘genes’ are then separately inserted into the gene for a bacterial enzyme β-galactosidase, which is carried in the vector’s plasmid. Insertion of the A gene is carried out by use of the restriction enzyme EcoRl and for B gene Hind-III is used. The recombinant plasmids are then introduced into E. coli cells. The insulin gene is expressed as it replicates with the P-galactosidase as the cell multiplies.


Affiliations

UC Davis Genome Center, University of California, Davis, USA

Martin Dragosits & Ilias Tagkopoulos

Department of Biomedical Engineering, University of California, Davis, USA

Department of Computer Science, University of California, Davis, USA

Department of Chemistry, University of Natural Resources and Life Sciences, Vienna, Vienna, Austria

Martin Dragosits, Daniel Nicklas & Ilias Tagkopoulos

You can also search for this author in PubMed Google Scholar

You can also search for this author in PubMed Google Scholar

You can also search for this author in PubMed Google Scholar

Auteur correspondant