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Horloge universelle pour l'homme contenue dans les séquences télomériques ?


Je ne sais pas si cela aurait du sens, mais imaginez que nous ne puissions souffrir que du vieillissement naturel (et non des maladies impliquées). Existe-t-il une estimation de la durée de vie maximale naturelle qu'un être humain peut avoir ?

J'ai appris que les séquences télomériques protègent les informations sensibles dans l'ADN et que les cellules somatiques souffrent d'une coupure de ces séquences à chaque réplication. Je me demande donc s'il s'agit d'une horloge naturelle, et si on a estimé de combien de temps nous disposons naturellement.


Télomères et stress au début de la vie

Stefanie Mayer , . Kathryn K. Ridout , dans Stress : génétique, épigénétique et génomique , 2021

Facteurs affectant la longueur des télomères

La longueur des télomères est affectée par des interactions complexes entre les expositions environnementales et les processus cellulaires, y compris les dommages oxydatifs, le stress de réplication de l'ADN, les changements épigénétiques et les polymorphismes génétiques. Les nucléotides de la guanine (G), qui constituent 50 % de la séquence des télomères, ont un faible potentiel de réduction et sont donc particulièrement sensibles aux dommages oxydatifs. 15 Dans les états de stress oxydatif, lorsque les espèces réactives de l'oxygène sont plus nombreuses que les mécanismes antioxydants, l'oxydation peut induire un raccourcissement des télomères, une sénescence cellulaire et la mort cellulaire. 16 L'exposition aux rayonnements ionisants ou à des substances cancérigènes peut entraîner des dommages à l'ADN des télomères. 17 Ces dommages déclenchent des processus de réparation par excision de l'ADN 17 pour aider à restaurer l'intégrité du télomère au prix potentiel d'un raccourcissement des télomères.

Des recherches émergentes suggèrent que les modifications épigénétiques peuvent avoir un impact sur la longueur des télomères. Les modifications épigénétiques permettent l'élaboration du génome au-delà de ce qui est déterminé par l'ADN. Ces modifications sont reportées au cours de la division cellulaire, mais ne modifient pas la séquence d'ADN. La méthylation est l'une des formes les plus courantes de modification épigénétique 18 et peut altérer l'état de la chromatine des télomères. Une faible méthylation des télomères peut entraîner une signalisation inappropriée des voies de réparation de l'ADN, des erreurs de séquence et un raccourcissement de l'ADN des télomères. 19

Des études d'association pangénomique (GWAS) ont identifié des loci génétiques pouvant contribuer à la variation de la longueur des télomères. Dans une étude de sujets ayant des antécédents de longévité familiale, Lee et al. 20 ont trouvé trois loci (4q25, 17q23.2 et 10q11.21) associés à la longueur des télomères. Mangino et al. 21 ont identifié un locus sur le chromosome 18q12.2 associé à la longueur des télomères, et dans leur méta-analyse, Mangino et al. 22 ont identifié de nouvelles régions génomiques associées à la variation de la longueur des télomères (17p13.1 et 19p12) et confirmé les associations entre la longueur des télomères des leucocytes et les loci 3q26.2 et 10q24.33. 21, 23, 24

Les polymorphismes génétiques semblent avoir un rôle important dans la régulation de la longueur des télomères en relation avec le risque psychopathologique. Par exemple, les syndromes télomériques dus à des mutations génétiques héréditaires de la machinerie d'entretien des télomères sont associés à des séquelles neuropsychiatriques caractéristiques. 12 La longueur et la longévité des télomères ont également été associées à des polymorphismes spécifiques à un seul nucléotide (SNP) dans les gènes qui produisent la télomérase. 25, 26 Le SNP rs2736100—situé dans le gène qui code pour la transcriptase inverse de la télomérase humaine (hTERT)—est associé à des télomères plus courts. Une étude récente portant sur 2026 personnes a révélé que les homozygotes rs2736100 présentaient des taux de dépression plus élevés que les porteurs hétérozygotes ou les homozygotes pour l'allèle protecteur. 27 Cette association ne s'est produite que chez des sujets sans antécédent de SLA, ce qui suggère que les effets du SLE sur la longueur des télomères peuvent être suffisamment importants pour masquer les influences génétiques.


5.4 : Cladistique

Par conséquent, plus il y a de différences dans les séquences biologiques, plus le temps s'est écoulé pour que les différences s'accumulent. Plus le temps s'est écoulé depuis que les organismes ont partagé un ancêtre commun, moins les organismes sont liés évolutivement les uns aux autres.

Les traits homologues peuvent être utilisés pour regrouper les organismes en clades. Les traits partagés entre les espèces ou les groupes dans un ensemble de données ont tendance à former des modèles imbriqués qui fournissent des informations sur le moment où les événements de ramification se sont produits dans la lignée.

Les papillons, les mites et les mouches sont tous également apparentés aux coléoptères.

Les guêpes sont plus étroitement liées aux papillons, aux mites et aux mouches qu'aux coléoptères.

En 1735, Linnaeus a publié Systema Naturae dans lequel il a proposé un système de catégorisation et de nommage des organismes en utilisant un format standard afin que les scientifiques puissent discuter des organismes en utilisant une terminologie cohérente. L'arbre de vie de Linné ne contenait que deux branches principales pour tous les êtres vivants : les règnes animal et végétal.

En 1866, Haeckel proposa un autre royaume, Protista, pour les organismes unicellulaires. Il proposa plus tard un quatrième règne, Monera, pour les organismes unicellulaires dont les cellules manquent de noyau, comme les bactéries.

En 1969, Whittaker a proposé d'ajouter un autre royaume, les champignons, dans l'arbre de vie. L'arbre des cinq royaumes de Whittaker a été considéré comme la norme pendant de nombreuses années.

Dans les années 1970, Woese a créé un arbre avec trois domaines au-dessus du niveau du royaume : Archaea, Bacteria et Eukarya.


<p>Cette section fournit toutes les informations utiles sur la protéine, principalement des connaissances biologiques.<p><a href='/help/function_section' target='_top'>Plus. </a></p> Fonction i

Se lie à la répétition télomérique double brin 5'-TTAGGG-3' et joue un rôle central dans l'entretien des télomères et la protection contre la fusion de bout en bout des chromosomes. En plus de son rôle de liaison à l'ADN télomérique, il est nécessaire de recruter un certain nombre de facteurs et d'enzymes nécessaires à la protection des télomères, notamment le complexe de l'abritine, TERF2IP/RAP1 et DCLRE1B/Apollo. Composant du complexe de l'abritine (télosome) impliqué dans la régulation de la longueur et de la protection des télomères. Shelterin s'associe à des matrices de répétitions 5'-TTAGGG-3' double brin ajoutées par la télomérase et protège les extrémités des chromosomes sans son activité protectrice, les télomères ne sont plus cachés de la surveillance des dommages à l'ADN et les extrémités des chromosomes sont traitées de manière inappropriée par les voies de réparation de l'ADN. Avec DCLRE1B/Apollo, joue un rôle clé dans la formation de la boucle télomérique (boucle T) en générant un surplomb monocaténaire 3' au niveau des télomères d'extrémité : les boucles T ont été proposées pour protéger les extrémités des chromosomes de la dégradation et de la réparation. Nécessaire à la fois pour recruter DCLRE1B/Apollo aux télomères et activer l'activité exonucléase de DCLRE1B/Apollo. Se lie de préférence à l'ADN superenroulé positif. Avec DCLRE1B/Apollo, requis pour contrôler la quantité d'ADN topoisomérase (TOP1, TOP2A et TOP2B) nécessaire à la réplication des télomères pendant le passage de la fourche et empêcher la topologie aberrante des télomères. Recrute TERF2IP/RAP1 aux télomères, participant ainsi à la répression de la réparation dirigée par homologie (HDR), qui peut affecter la longueur des télomères.

<p>Informations organisées manuellement pour lesquelles il existe des preuves expérimentales publiées.</p> <p><a href="/manual/evidences#ECO:0000269">Plus. </a></p> Assertion manuelle basée sur l'expérience dans i


Figure 2

Figure 2. TPP1 et différents états télomériques. a) TPP1 médie les interactions entre POT1, TIN2 et la télomérase (4). OB = pli de liaison oligonucléotide/oligosaccharide RD = domaine de recrutement, également appelé PBD (4) S/T = région riche en sérine/thréonine TID = domaine d'interaction TIN2. La nomenclature provient de la référence 5. b) États télomériques. (i) État non extensible. POT1 est lié à l'extrémité télomérique 3', empêchant l'allongement par la télomérase. Le télomère est représenté ici sous une forme linéaire. La boucle t doit également correspondre à un état non extensible (voir texte). (ii) État extensible. Des mécanismes inconnus peuvent dissocier ou déplacer le POT1 lié à l'extrémité télomérique, ou l'empêcher de se lier, pour permettre l'accès à la télomérase. La télomérase peut être enrichie au niveau des télomères passant par TPP1, qui se lie indirectement au tractus télomérique double brin. (iii) État en extension. Au cours de l'extension, l'activité et la processivité de la télomérase sont stimulées par la TPP1 liée à des molécules POT1 plus internes.

Le complexe d'abritine à six composants est connu depuis un certain temps pour être impliqué dans le contrôle de la longueur des télomères (1, 2). Par exemple, l'inhibition de TRF1 conduit à l'allongement des télomères, tandis que la surexpression de TRF1 provoque un raccourcissement des télomères dans les cellules humaines positives pour la télomérase sans affecter l'activité de la télomérase. La réduction des niveaux de protéine TIN2 ou la surexpression d'allèles mutants qui perturbent l'interaction de TIN2 avec TPP1 conduit à l'allongement des télomères (13, 14). La suppression de TPP1 par ARN interférence ou la perturbation de l'interaction TPP1-POT1, qui s'accompagne de la perte du signal POT1 au niveau des télomères, entraîne également un allongement des télomères (7, 8). Ainsi, le renforcement du complexe de l'abritine semble inhiber la télomérase. Des télomères plus longs chargent plus de complexes d'abri, ce qui peut fournir un mécanisme de détection de la longueur (1). De plus, l'abritine, en particulier la TRF2, favorise la formation de boucles en t dans lesquelles le surplomb télomérique 3' est rentré dans la partie double brin du télomère (15). Cela peut séquestrer le surplomb 3' des facteurs de réparation de l'ADN ainsi que de la télomérase. De plus, l'abritine peut favoriser la liaison de POT1 à l'extrémité télomérique 3', ce qui inhibe également la télomérase (16). En effet, in vitro des études démontrent que POT1, lorsqu'il est lié à l'extrémité télomérique 3', interdit la liaison et l'extension par la télomérase (Figure 22, panneau b, état i) (12, 17). Ainsi, le complexe de l'abritine a été jusqu'à présent principalement lié à l'inhibition de la télomérase. Cependant, les télomères doivent passer d'états non extensibles à des états extensibles, au moins dans les cellules positives pour la télomérase (3, 18).

Maintenant, les deux nouveaux articles renforcent l'idée que les composants de l'abritine ont également une fonction d'activation de la télomérase. Une interaction physique entre la TPP1 et la télomérase humaine est démontrée par la co-immunoprécipitation de la TPP1 et de la télomérase exprimée dans le lysat de réticulocytes de lapin et dans des extraits cellulaires (5). Le pli OB de TPP1 est nécessaire et suffisant pour cette interaction, une indication que TPP1 recrute la télomérase aux télomères par son pli OB (5). Parce que TPP1 ne se lie pas directement à l'ADN télomérique, il pourrait exercer cette fonction lorsqu'il est lié soit au tractus télomérique double brin passant par TIN2/TRF1/TRF2 ou au porte-à-faux 3′ passant par POT1 (5) (Figure 22, panneau b, état ii). Wang et al.(4) effectué détaillé in vitro tests d'activité télomérase en présence de POT1 et TPP1 et découverte de fonctions activatrices, en dehors d'une éventuelle fonction de recrutement. POT1 est connu pour inhiber l'activité de la télomérase lorsqu'il est lié à l'extrémité télomérique 3', et cette inhibition n'est pas surmontée lors de l'association avec TPP1. Par conséquent, Wang et al. liaison forcée de POT1 avec une mutation ponctuelle d'ADN d'amorce à un registre plus en amont, laissant une queue 3' extensible par la télomérase (Figure 22, panneau b, état iii). En effet, dans ces conditions expérimentales, POT1 et TPP1 ont non seulement amélioré l'activité totale de la télomérase, mais ont également augmenté la processivité de la télomérase, un effet nécessitant l'interaction TPP1-POT1. De plus, les deux protéines ensemble ont pu sauver la processivité de la télomérase sur un oligonucléotide formant le G-quadruplex, probablement en raison de la capacité de POT1 à piéger une forme ouverte de cette structure (19).

En résumé, les deux articles identifient TPP1 comme un régulateur intime et direct de la télomérase humaine. TPP1 assure la médiation de la communication entre l'abritine et la télomérase. Il peut également fournir une cible idéale pour réguler l'activité de la télomérase aux extrémités des chromosomes individuels afin de déclencher un recrutement et/ou une activation préférentiels au niveau des télomères courts. Les nouvelles données fournissent un instantané moléculaire de l'effet stimulateur du complexe protéique de liaison aux télomères POT1-TPP1 pendant l'extension médiée par la télomérase. Cependant, la nature moléculaire de cet état et d'autres états télomériques et le mécanisme de leur transition restent à élucider et doivent être étudiés plus en détail. Un modèle possible est que l'abritine délivre POT1 aux extrémités télomériques 3' pour empêcher leur allongement par la télomérase, résultant en un état non extensible (Figure 22, panneau b, état i) (12, 16, 17). Des mécanismes inconnus peuvent dissocier ou déplacer le POT1 lié à l'extrémité télomérique ou l'empêcher de se lier, permettant ainsi l'accès à la télomérase et produisant un état extensible (Figure 22, panneau b, état ii). Cela permettrait la formation d'un état d'extension dans lequel la télomérase est stimulée par la TPP1 liée à des molécules POT1 plus internes (Figure 22, panneau b, état iii). Cette dualité de POT1 rappelle les études chez la levure bourgeonnante, où le surplomb monocaténaire est lié par Cdc13p (cycle de division cellulaire 13), une autre protéine contenant le pli OB qui présente une faible similitude structurelle avec POT1. La protéine Cdc13p recrute l'holoenzyme de la télomérase en phase S passant par une sous-unité de télomérase appelée Est1p (télomère toujours plus court 1) (20). Cette interaction est critique pour le maintien des télomères, car est1 les souches de levure subissent une sénescence cellulaire. Cependant, Cdc13p peut également réguler négativement l'allongement des télomères (21). Néanmoins, la levure bourgeonnante Est1p n'est pas homologue à TPP1, et par conséquent elle peut ne pas remplir une fonction analogue. Dans Saccharomycescerevisiae, les protéines kinases de type phosphatidyl inositol-3 Tel1 et le point de contrôle d'entrée de la mitose 1 (Mec1) (ATM (ataxie télangiectasie mutée) et ATR (ATM et Rad3-related chez l'homme)) semblent également jouer un rôle essentiel dans l'activation préférentielle de la télomérase à télomères courts. Fait intéressant, ces kinases s'associent également aux télomères humains d'une manière dépendante du cycle cellulaire (22), et il sera fascinant de découvrir si des mécanismes similaires régulent la fonction TPP1 et l'activité de la télomérase au niveau des télomères humains.


Quantifier la longueur des télomères

Les techniques les plus couramment utilisées pour mesurer la longueur des télomères sont le transfert de Southern, les techniques basées sur la réaction en chaîne par polymérase (PCR) et l'hybridation in situ. Le transfert de Southern ou l'analyse des fragments de restriction des télomères (TRF) est la méthode traditionnelle et toujours considérée comme le gold standard [22]. Les télomères sont représentés sous forme de frottis, et le poids du frottis est représentatif de la longueur moyenne des télomères. Le principal inconvénient de cette technique réside dans les quantités relativement élevées d'ADN nécessaires. Cette technique n'est donc pas réalisable pour déterminer la longueur des télomères dans des cellules individuelles, ou pour différents chromosomes, ou lorsque la disponibilité de l'ADN est limitée. La méthode basée sur la PCR en temps réel est relativement rapide et ne nécessite que de petites quantités d'ADN génomique. Cette technique est basée sur des amorces PCR modifiées pour éviter autant que possible l'amplification amorce-dimère [13]. La mesure finale sera un rapport quantité de télomères divisé par une quantité de gène de référence (rapport T/S) qui est une mesure relative, parfaitement valable au sein d'une population donnée (car elle classera correctement les sujets) mais plus difficile à comparer entre les populations. L'avantage le plus récent est le développement d'un test multiplex dans lequel le télomère et le gène de référence sont ciblés dans un seul puits [14]. La technique PCR souffre du même inconvénient que la méthode TRF lorsqu'on considère l'analyse d'une cellule unique ou d'un chromosome spécifique. La technique de PCR quantitative a été largement utilisée et acceptée pour estimer la longueur des télomères dans de grandes études de cohorte [10, 15, 86, 93]. Une modification spécifique des techniques précédentes est l'analyse de la longueur des télomères uniques, qui utilise des techniques de transfert de Southern pour séparer les produits amplifiés par PCR, en combinant des amorces et des sondes spécifiques pour les télomères et les régions subtélomériques pour mesurer la longueur des télomères par chromosome [5]. Cette technique est actuellement considérée comme la mesure des télomères la plus précise, mais c'est une technique laborieuse et techniquement difficile qui ne peut être utilisée que pour les chromosomes à partir desquels la région subtélomérique est connue. Les techniques d'hybridation in situ permettent de visualiser les télomères dans des cellules individuelles. L'hybridation quantitative in situ en fluorescence (Q-FISH) utilise un (CCCTAA)3 sonde d'acide nucléique peptidique pour visualiser les télomères. Dans les étalements en métaphase, les télomères sont visibles à l'extrémité des chromosomes et ils peuvent également être quantifiés dans des chromosomes uniques [52]. Une variante importante de cette technique est l'hybridation in situ par fluorescence en flux, ou Flow-FISH. En combinant l'hybridation Q-FISH et l'analyse par cytométrie en flux, il est possible de mesurer la longueur moyenne des télomères dans les cellules en interphase en combinaison avec des anticorps de cytométrie en flux standard pour sélectionner la population cellulaire d'intérêt [71].


Renseignements à l'appui

S1 Fig. Alignement peptidique des homologues Nxf2.

Nous avons utilisé NCBI web BLAST pour rechercher les . melanogaster Séquence peptidique Nxf2 contre la base de données de peptides RefSeq et homologues identifiés dans 22 Drosophile espèce. La région carboxy-terminale de Nxf2 dérive du CDS qui partage une homologie avec le TARTE-A TE (boîte grise). Au niveau peptidique, cette région est conservée jusqu'à . virile, ce qui suggère que, s'il a été acquis à partir d'une insertion du TARTE-A TE, l'insertion se serait produite dans l'ancêtre commun de l'ensemble du genre. CDS, séquence codante TE, élément transposable.

S2 Fig. Vue zoom du dotplot montrant les alignements de ré. melanogaster TARTE-A contre ré. melanogaster nxf2 et ré. yakuba TARTE-A.

Les cases roses montrent les 2 segments d'homologie partagée entre . melanogaster TARTE-A et . melanogaster nxf2. . yakuba TARTE-A s'aligne sur . melanogaster TARTE-A dans les régions directement adjacentes à, mais n'incluant pas, la TART-A/nxf2 homologie partagée. Les données sous-jacentes peuvent être trouvées dans S2 Data.

S3 Fig. Comparaisons intra-espèces de nxf2 contre TARTE-A.

nous avons comparé nxf2 séquences de transcription de . melanogaster (UNE), . yakuba (Bande . sechellie (C) à TARTE-A séquences de la même espèce utilisant mime [106]. Il existe une homologie de séquence entre . melanogaster nxf2 et TARTE-A mais non pour D. yakuba nxf2/TART-A ni pour . sechellia nxf2/TART-A. Les données sous-jacentes peuvent être trouvées dans S2 Data.

S4 Fig. Alignement de nxf2-comme région de 71 ré. melanogaster TARTE-A éléments.

Nous avons identifié 71 TARTE-A éléments avec 3′ UTR à partir de 17 longues lectures . melanogaster assemblages de génomes. Tous les 71 éléments contiennent le nxf2-comme une séquence (boîte grise) suggérant que cette région est présente dans la plupart, sinon la totalité, TARTE-A éléments dans . melanogaster. A noter qu'une partie de la nxf2-like region semble avoir été supprimée dans l'un des TARTE-A éléments.

S5 Fig. Couverture de séquençage Illumina du nxf2-comme la région de TARTE-A à travers la DGRP.

Nous avons comparé la couverture de séquençage génomique pour le nxf2-comme la région de TARTE-A (ombrage bleu) à ses régions flanquantes en amont et en aval (ombrage jaune). Pour chaque souche DGRP, nous avons divisé la couverture de lecture par la couverture médiane de cette souche TARTE-A ORF1 et ORF2 pour contrôler les différences de nombre de copies entre les souches. Nous avons calculé la couverture pour chaque souche dans des fenêtres de 10 pb à travers la région. Chaque case de la figure résume les valeurs de couverture par souche pour un seul segment de 10 pb. A l'intérieur de chaque case, la ligne interne représente la couverture médiane et les charnières correspondent aux 25e et 75e centiles. Les moustaches s'étendent jusqu'à 1,5 fois l'intervalle interquartile. La couverture de la nxf2-like est similaire à la couverture de la région aval, qui sont toutes deux réduites par rapport à la région amont. Ce modèle est cohérent avec la troncature de l'UTR, qui a déjà été décrite pour TARTE [74]. Parce que le nxf2-like est présente dans les deux UTR, la troncature de l'UTR 5', qui est assez courante, devrait réduire la couverture des deux nxf2-like région et la région flanquante en aval d'environ 50% par rapport à la région en amont, qui n'est pas présente dans l'UTR 5' (Fig 1B). Nous avons observé une réduction de la couverture d'environ 30 %, cohérente avec un mélange de TARTE-A copies, certaines avec des UTR 5′ tronqués et d'autres sans. La couverture médiane dans toutes les cases d'une région est indiquée par les barres horizontales colorées. Les données sous-jacentes peuvent être trouvées dans S2 Data. ORF, cadre de lecture ouvert.

S6 Fig. Régulation à la hausse des éléments répétitifs dans nxf2 abattre.

Chaque répétition RepBase pour laquelle nous avons observé l'expression dans les données RNA-seq totales des ovaires féminins est indiquée sur l'axe des y, et le changement de pli de l'expression dans le nxf2 knockdown RNAi versus knockdown de contrôle de la blanche gène est représenté sur l'axe des x avec une échelle log2. Les valeurs d'expression sont la moyenne de 2 réplicats biologiques à la fois pour le knockdown et le contrôle. Pour les rétrotransposons LTR, les LTR sont affichés séparément du reste du TE. Les données sous-jacentes peuvent être trouvées dans S2 Data. LTR, longue répétition terminale TE, élément transposable.

S7 Fig. Corrélation entre les shRNA dans nxf2 abattre.

Nous avons utilisé 2 shRNA qui ciblent différentes régions du nxf2 transcrit et valeurs d'expression calculées pour les gènes ainsi que les TE pour chaque knockdown. Nous avons trouvé que les valeurs d'expression sont fortement corrélées entre les 2 expériences (rho de Spearman = 0,92 [Genes] et 0,94 [TEs]). Les données sous-jacentes peuvent être trouvées dans S2 Data. shRNA, ARN en épingle à cheveux court TE, élément transposable.

S8 Fig. nxf2 produits de clivage à partir des données degradome-seq.

Nous avons analysé les données publiées sur les petits ARN de dégradome-seq et Aub-immunoprécipité pour déterminer s'il y avait nxf2 lectures degradome-seq montrant le chevauchement sens:antisens de 10 pb avec TARTE-A piARN, cohérents avec le clivage par une protéine Piwi. Nous avons identifié 11 emplacements (A–K) dans le TARTE-comme la région de nxf2 où les produits de clivage degradome-seq (rouge) se chevauchent avec les piARN antisens (bleu) de 10 pb à leurs extrémités 5'. Les nxf2 la transcription est représentée en noir. degradome-seq, piARN de séquençage de dégradome, petit ARN interagissant avec Piwi.

S9 Fig. Les gènes régulés à la hausse lors de la perturbation de la voie des piARN montrent une plus grande abondance de piARN alignés.

Nous avons identifié 168 gènes dont le facteur de changement d'expression était supérieur ou égal à nxf2 à travers les knockdowns de l'ARNi de 16 composants de la voie piARN. Ces gènes ont une abondance significativement plus grande de piARN alignés par rapport au reste des gènes exprimés, suggérant que leur expression peut être régulée par les piARN (test de Wilcoxon P = 4.1e-06). Les données sous-jacentes peuvent être trouvées dans S2 Data. piARN, petit ARN ARNi interagissant avec Piwi, interférence ARN.

S10 Fig. Les gènes de la voie PiRNA ne présentent pas de réponse uniforme à la perturbation de la voie piRNA.

Nous avons examiné le facteur de changement dans l'expression de 41 gènes connus de la voie piARN à travers les knockdowns ARNi de 16 composants de la voie piARN, en excluant le gène ciblé de l'analyse pour chaque expérience. Les gènes de la voie PiRNA montrent un changement de pli médian proche de 1 (ligne rouge horizontale) pour la plupart des expériences. Les données sous-jacentes peuvent être trouvées dans S2 Data. piARN, petit ARN ARNi interagissant avec Piwi, interférence ARN.

S11 Fig. La corrélation entre nxf2 expression et TARTE-A le numéro de copie est reproductible.

Nous avons répété l'analyse montrée dans la figure 7A en utilisant un jeu de données de microarray répliqué de [125] et avons trouvé une corrélation similaire (rho de Spearman = -0,49), ce qui suggère que les mesures d'expression de microarray sont hautement reproductibles. Les données sous-jacentes peuvent être trouvées dans S2 Data.

S12 Fig. Expression d'autres gènes de la voie piARN (outre nxf2) n'est pas corrélé avec TARTE-A numéro de copie.

Nous avons pu obtenir des valeurs d'expression pour 39 autres gènes de la voie piARN à partir du même ensemble de données de puces à ADN que nous avons utilisé pour nxf2 expression. Pour chacun de ces gènes, nous avons calculé le coefficient de corrélation de Spearman pour son expression par rapport à TARTE-A numéro de copie. Tous les coefficients de corrélation sont au moins 2 fois plus faibles que ce que nous avons observé pour nxf2. Les données sous-jacentes peuvent être trouvées dans S2 Data. piRNA, petit ARN interagissant avec Piwi.

S13 Fig. Résumé des corrélations entre les gènes de la voie piARN et TARTE-A numéro de copie.

L'histogramme résume les coefficients de corrélation de Spearman entre 39 gènes de la voie piARN et TARTE-A numéro de copie (indiqué dans S12 Fig). La ligne rouge montre le coefficient de corrélation pour nxf2. Les données sous-jacentes peuvent être trouvées dans S2 Data. piRNA, petit ARN interagissant avec Piwi.

S14 Fig. Couverture piARN par souche de nxf2.

Nous avons tracé la profondeur de lecture de piARN (normalisée en tant que RPM mappé) le long de la nxf2 transcrit pour chacune des 16 souches DGRP illustrées à la figure 7. Pour chaque souche, l'abondance de TARTE Les piARN sont répertoriés dans le titre de l'intrigue. Nous avons masqué les emplacements des TARTE/nxf2 homologie partagée (boîtes grises) avant l'alignement pour éviter le croisement de TARTE-piARN dérivés. Les données sous-jacentes peuvent être trouvées dans S2 Data. DGRP, Drosophile Panel de référence génétique piRNA, petit ARN RPM interagissant avec Piwi, lit par million.

S15 Fig. Corrélation entre TARTE-A et nxf2 piARN.

Il existe une forte corrélation positive entre TARTE-des piARN dérivés qui s'alignent sur nxf2 contre le nxf2 piARN en aval de la région d'homologie partagée, à travers 16 souches DGRP (rho de Spearman = 0,88, P < 2.2e-16). Les données sous-jacentes peuvent être trouvées dans S2 Data. DGRP, Drosophile Panel de référence génétique piARN, petit ARN interagissant avec Piwi.

S16 Fig. Les 5 souches DGRP utilisées dans l'expérience RNA-seq ont nxf2 des niveaux d'expression représentatifs de la population DGRP dans son ensemble.

Nous avons utilisé l'ensemble de données microarray de [125] pour sélectionner 5 souches DGRP dont la médiane nxf2 le niveau d'expression est similaire à celui de l'ensemble de la population DGRP. Les données sous-jacentes peuvent être trouvées dans S2 Data. DGRP, Drosophile Panel de référence génétique RNA-seq, séquençage d'ARN.

Tableau S1. Comptes spécifiques d'allèles pour TARTE-des piARN antisens dérivés alignés sur nxf2. piRNA, petit ARN interagissant avec Piwi.

Données S1. Alignement de séquences multiples de nxf2.

Données S2. Données sous-jacentes pour tous les graphiques.

Données S3. Alignement de séquences multiples utilisé pour la figure 2B.

Données S4. fichier FASTA contenant la séquence des ré. simulans TART-A fragment.


G-Quadruplexes télomériques : de l'humain à Tétrahymène Répétitions

Les séquences télomériques et protozoaires humaines ne diffèrent que par une base purique dans leurs répétitions TTAGGG dans les séquences télomériques et TTGGGG dans les séquences protozoaires. Dans cette étude, la relation entre les G-quadruplexes formés à partir de ces répétitions et leurs dérivés est analysée et comparée. La séquence d'ADN télomérique humaine G3(T2AG3)3 et des séquences apparentées dans lesquelles chaque base adénine a été systématiquement remplacée par une guanine ont été étudiées le résultat est Tétrahymène répète. La substitution n'affecte pas la formation de G-quadruplexes mais peut entraîner des différences de topologie. Les résultats montrent également que la stabilité des dérivés substitués augmente dans les séquences avec un plus grand nombre de substitutions. De plus, la plupart des séquences contenant des imperfections dans les répétitions qui ont été analysées dans cette étude se produisent également chez l'homme et Tétrahymène génomes. Généralement, la présence de structures G-quadruplexes dans tout organisme est une source de limitations au cours du cycle de vie. Par conséquent, une meilleure compréhension de l'influence de la substitution de bases sur la variabilité structurelle des G-quadruplexes serait d'une valeur scientifique considérable.

1. Introduction

Les séquences d'ADN riches en G peuvent former des quadruplexes G intra- et intermoléculaires basés sur l'association d'un ou plusieurs brins d'ADN. Les nucléotides qui interviennent entre les séquences G forment des boucles de structures G-quadruplex repliées qui peuvent adopter une variété de formes topologiques différentes [1, 2]. Lorsque les trajets de guanine sont orientés dans la même direction, les boucles d'inversion à double chaîne (hélice) relient deux brins parallèles adjacents pour former une structure parallèle [3]. Lorsque les faisceaux de guanine sont orientés dans des directions opposées, les boucles edgewise ou diagonales relient deux brins antiparallèles pour former un G-quadruplex antiparallèle [4]. En hybride antiparallèle ou dit (

), un seul brin est orienté dans une direction différente des autres [5–7]. Un pli de type roman ( ) qui a été récemment décrit par Marušič et al. présente une conformation dans laquelle les trois types de boucles se produisent dans une seule conformation : les boucles d'inversion sur les bords, en diagonale et à double chaîne [8]. De plus, des G-quadruplexes multimériques intermoléculaires peuvent être formés par l'association de deux ou plusieurs brins [9].

Ces structures soulignent le degré élevé de polymorphisme structurel des G-quadruplexes, un phénomène qui dépend de nombreux facteurs différents : la longueur et la séquence de l'acide nucléique, et les conditions environnementales présentes lors de la réaction de repliement telles que le tampon, le pH, le cation stabilisant, la température. , et la présence d'agents provoquant la déshydratation [10-14]. Les séquences riches en G ayant la propension à former des structures G-quadruplexes peuvent être localisées dans de nombreuses régions de l'ADN génomique humain, en particulier dans plusieurs régions biologiquement importantes, y compris la fin des télomères eucaryotes linéaires [15, 16]. Cependant, les séquences putatives riches en G ne sont pas distribuées au hasard dans un génome, de telles séquences se produisent principalement dans les régions proto-oncogènes (qui favorisent la prolifération cellulaire) et sont appauvries en gènes suppresseurs de tumeurs (qui maintiennent la stabilité génomique) [17]. Il est très peu probable que ces séquences putatives puissent former in vivo et la preuve directe de leur existence dans des cellules vivantes est toujours un sujet de discussion [18-20]. Sans aucun doute, les séquences de formation de G-quadruplex les plus étudiées sont celles situées aux extrémités 3' des télomères humains. Les séquences télomériques et les complexes nucléoprotéiques spécialisés qui coiffent les extrémités des chromosomes linéaires sont essentiels pour la stabilité chromosomique et l'intégrité génomique [21-23]. Les télomères des mammifères sont constitués de répétitions en tandem de séquences riches en G,

. Plusieurs kilobases de cette séquence sont bicaténaires, mais plus d'une centaine de nucléotides restent non appariés et forment des surplombs 3' monocaténaires [24], un état qui offrirait des conditions favorables à la formation d'un ou plusieurs G-quadruplexes in vivo [22]. La structure et la stabilité des télomères jouent un rôle important dans le développement du cancer et le vieillissement cellulaire [25, 26]. Il existe également des preuves que les télomères servent de type d'horloge biologique, car les structures des télomères semblent devenir plus courtes à chaque cycle cellulaire successif. Dans les cellules immortalisées et dans les cellules cancéreuses, cependant, une télomérase est activée pour maintenir la longueur du télomère en réallongeant la séquence télomérique aux extrémités des chromosomes [27, 28]. Il a également été démontré que les quadruplexes G formés par l'ADN télomérique humain simple brin inhibent l'activité de la télomérase [29], et cette découverte a conduit à un intérêt accru pour les structures en tant que cibles potentielles attrayantes pour les médicaments [30].

Un large éventail d'études sur les G-quadruplexes télomériques humains a été réalisée en utilisant une grande variété de techniques différentes [1]. À ce jour, des structures à haute résolution de quatre topologies de repliement distinctes avec trois couches de tétrades G ont été identifiées pour les quatre répétitions télomériques humaines [1–7]. De plus, une structure supplémentaire constituée de seulement deux couches G-tétrade a également été révélée, ce qui met en évidence le polymorphisme structurel des G-quadruplexes télomériques [31]. La structure de l'ADN télomérique humain dans les solutions surpeuplées a également été étudiée par de nombreux auteurs [11], mais cette structure est probablement le résultat d'une déshydratation plutôt que d'un surpeuplement moléculaire [12, 32, 33]. La grande variété de structures identifiées à ce jour peut également être attribuée à la présence de nucléotides flanquants en dehors de la séquence centrale G3(T2AG3)3 et la concentration d'ions et à l'utilisation de différentes méthodes et conditions expérimentales [1, 34].

Une série d'études systématiques concernant les dérivés de séquence de répétitions télomériques humaines ont été menées par Vorlícková et al. [35-38], et ces études antérieures se sont concentrées sur la substitution de la guanine à l'adénine, l'introduction de sites abasiques, la 8-oxoadénine remplaçant l'adénine et la substitution du 5-hydroxyméthyluracile à la thymine dans les répétitions télomériques [39-41] . Cependant, dans cette étude, une stratégie opposée est appliquée, la substitution de l'adénine à la guanine (voir Figure 1). L'objectif principal est d'obtenir la conversion totale de quatre répétitions humaines en Tétrahymène des répétitions qui conservent la capacité de former des G-quadruplexes intramoléculaires. Fait intéressant, des répétitions riches en G contenant des imperfections ont également été trouvées chez l'homme et Tétrahymène génome voir Tableau 1 et Supports.

coefficient d'extinction à 257 nm.

Dans cette étude, nous examinons les structures formées par les Tétrahymène séquence télomérique, dG4(T2g4)3, qui diffère de la séquence humaine par un seul remplacement G-pour-A dans chaque répétition [42]. Les G étant essentiels à la formation des G-quadruplexes, nous avons systématiquement substitué chacune des trois adénines aux guanines dans les boucles TTA de la séquence G-quadruplexe G3(T2AG3)3, augmentant ainsi le nombre de guanines jusqu'à trois guanines par oligonucléotide. La spectroscopie de dichroïsme circulaire (CD) et l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) ont été utilisées pour observer l'effet de la ou des substitutions de bases sur la formation, la stabilité thermique et la conformation des G-quadruplexes. Les mesures ont été effectuées en présence à la fois d'ions Na + et K + et avec des concentrations de PEG-200 ou d'acétonitrile à 0, 15, 30 et 50 % en poids à différentes températures. De plus, la formation de structures G-quadruplex a été vérifiée et confirmée à l'aide de Thiazole Orange (TO). TO est une excellente sonde de fluorescence d'ADN pour les formes structurelles d'ADN en raison de son rendement quantique de fluorescence élevé [43]. Ce ligand stabilise la structure du G-quadruplex et peut également induire des changements topologiques [44, 45]. Le complexe G-quadruplex-TO offre un profil caractéristique de spectre de dichroïsme circulaire induit dans des tampons contenant des cations sodium [44].

2. Matériels et méthodes

Toutes les expériences ont été réalisées dans un tampon Britton-Robinson modifié (mRB), 25 mM d'acide phosphorique, 25 mM d'acide borique, 25 mM d'acide acétique, et complété par 50 mM de KCl ou NaCl, PEG-200 (polyéthylène glycol avec une moyenne poids moléculaire de 200) et le pH de l'acétonitrile (Fisher Slovaquie) a été ajusté par Tris à une valeur finale de 7,0. Les oligonucléotides avec les séquences présentées dans le tableau 1 ont été achetés auprès de Metabion international AG. Les échantillons d'ADN lyophilisés ont été dissous dans de l'eau bidistillée avant utilisation pour donner des solutions mères 1 mM. Les concentrations d'ADN simple brin ont été déterminées en mesurant l'absorbance à 260 nm à haute température (95°C).

2.1. Spectroscopie CD

Les spectres CD et UV-vis ont été mesurés en utilisant un spectropolarimètre Jasco modèle J-810 (Easton, MD, USA). La température du support de cuve était régulée par un contrôleur de température PTC-423L. Les analyses ont été effectuées sur une plage de 220 à 600 nm dans un volume de réaction de 300 ??l dans une cuvette avec un trajet optique de 0,1 cm et une vitesse de balayage de l'instrument de 100 nm/min, un pas de 1 nm et une bande passante de 1 nm, avec un temps de réponse de 2 s. Les données du CD représentent trois balayages moyens effectués à une plage de température de 0 à 100 °C. Tous les échantillons d'ADN ont été dissous et dilués dans des tampons appropriés contenant des concentrations appropriées d'ions et d'agent déshydratant. La quantité d'oligomères d'ADN utilisés dans les expériences a été maintenue à près de 25 ??M de concentration de brin d'ADN. Les échantillons ont été chauffés à 95°C pendant 5 minutes puis laissés refroidir à la température initiale avant chaque mesure. Les spectres CD sont exprimés comme la différence d'absorption molaire de la lumière polarisée circulairement à droite et à gauche (Δ??) en unités de M -1 ·cm -1 . La molarité était liée aux oligomères d'ADN. Un spectre de ligne de base tampon a été obtenu en utilisant la même cuvette et soustrait des spectres d'échantillon. La stabilité thermique de différents quadruplexes a été mesurée en enregistrant l'ellipticité CD à 295 et 265 nm en fonction de la température [14, 46]. La température variait de 0 à 100°C, et la vitesse de chauffage était de 0,25°C/min. La température de fusion (

) a été définie comme la température du point médian de transition. a été estimée à partir de la valeur maximale de la dérivée première de la courbe ajustée. Le titrage de l'ADN a été effectué avec des concentrations croissantes de TO. Le TO a été solubilisé dans du DMSO pour atteindre une concentration finale de solution mère de 10 mM. La concentration d'ADN et de TO dans une cellule de quartz de 1 mm était de 30 ??M et 0–200 ??M, respectivement, et l'incrément de TO était

67 ??M. Chaque échantillon a été mélangé vigoureusement pendant 3 min après l'ajout de TO CD/UV. Les spectres ont été mesurés immédiatement.

2.2. Électrophorèse

Échantillons constitués de 0,3 ??1 mM de solutions mères ont été séparés en utilisant une PAGE non dénaturante dans un appareil électrophorétique à température contrôlée (Z375039-1EA Sigma-Aldrich, San Francisco, CA) sur des gels d'acrylamide à 15 % (19:1 acrylamide/bisacrylamide). L'ADN a été chargé sur

cm gels. L'électrophorèse a été effectuée à 10°C pendant 4 heures à 125 V (

8 V.cm -1 ). Chaque gel a été coloré avec StainsAll (Sigma-Aldrich). Le gel a également été coloré en utilisant la procédure de coloration à l'argent afin d'améliorer la sensibilité de la visualisation de l'ADN [44].

2.3. Spectroscopie de fluorescence

Les spectres de fluorescence ont été acquis avec un spectrophotomètre de fluorescence Varian Cary Eclipse à 22 ± 1°C équipé d'un circulateur à température contrôlée. Une cuvette en quartz avec une longueur de trajet de 3 mm a été utilisée dans toutes les expériences. Dans les mesures de fluorescence, les fentes d'excitation et d'émission étaient de 5 nm et la vitesse de balayage était de 240 nm/min. 66 ??M de TO a été titré avec de l'ADN (3,3, 6,6 et 13,2 ??M) dans un tampon mRB en présence et en absence de cations métalliques monovalents. Les rapports molaires entre l'ADN et le ligand étaient de 1 : 20, 1 : 10 et 1 : 5. La longueur d'onde d'excitation a été ajustée à 452 nm.

3. Résultats et discussion

3.1. Conception de séquences et spectres de CD

La séquence dérivée de la séquence télomérique humaine d(G3(T2AG3)3) et des dérivés substitués dans différentes conditions sont étudiés. Les séquences d'ADN et les abréviations utilisées dans cette étude sont résumées dans le tableau 1. Les points 1, 2 et 3 indiquent les positions de la substitution de base dans les première, deuxième et troisième boucles de la séquence HTR, respectivement. Le point 0 indique une guanine flanquante à l'extrémité 5' de l'oligonucléotide, figure 1. Dans les oligonucléotides d'ADN dérivés de HTR, la guanine (G)-pour-adénine (A) dans la boucle TTA a été substituée avec l'attente que la modification Les séquences conserveraient la capacité de former spontanément des G-quadruplexes, bien qu'avec des topologies différentes de celles trouvées dans les séquences HTR. Les dérivés HTR ont été analysés en présence à la fois de 50 mM de NaCl et de KCl, Figure 2. Le premier groupe représente des oligonucléotides contenant uniquement des mutations ponctuelles à différentes positions HTR1, HTR2, et HTR3 (lignes noires sur la figure 2). Le deuxième groupe représente des oligonucléotides contenant deux mutations ponctuelles (spectres indiqués en bleu sur la figure 2). Les deux premières boucles ont été modifiées en HTR1,2, la première et la dernière boucles ont été modifiées en HTR1,3 et les deuxième et troisième boucles ont été modifiées en HTR2,3. Oligonucléotides HTR0,1,3, HTR0,2,3, et HTR1,2,3 contenait trois substitutions G-pour-A (spectres en vert). Le spectre et les températures de fusion du HTR0,1,2 séquences sont très similaires à celles du HTR0,2,3 séquence (non montrée dans cette étude), tandis que le HTR0,1,2,3 est équivalente à la séquence THR.

1 h à la température initiale à laquelle l'échantillon a été conservé au début de la mesure [14].

Les séquences substituées ont également été comparées aux séquences HTR et THR non modifiées. En termes généraux, chacun des résidus de guanine dans n'importe quelle séquence G pourrait être impliqué dans la formation de tétrades G. Dans le cas de la formation de quadruplexes G-tétrades à trois couches, les longueurs de boucle variaient lorsque la substitution de base était introduite dans les séquences HTR. Les boucles pouvaient consister en trois ou quatre nucléotides en fonction de l'emplacement et du nombre de substitutions. Cependant, nous ne pouvons pas exclure la possibilité de formation de quadruplexes G à quatre couches pour des séquences contenant trois substitutions, mais il est important de noter que de telles structures devraient consister en au moins un hétéronucléotide-tétrade dans lequel l'adénine est également présente. À ce jour, la structure 3D des séquences THR pleine longueur en présence de potassium n'a pas été déterminée. La seule facette de la structure connue est la structure tétramère G-quadruplex formée de quatre séquences plus courtes d(TTGGGGT) (PDB : 139D) [47]. Cette structure se compose de quatre tétrades G et ne peut pas être déclarée comme représentant la structure réelle d'un oligonucléotide de pleine longueur. Néanmoins, la structure 3D de la THR n'a été établie qu'en présence de sodium (PDB : 186D) [48]. Cette structure se compose de trois tétrades G empilés, de deux boucles latérales et d'une boucle à double inversion de chaîne. Malgré le fait que les séquences de THR et HTR ne diffèrent que pour un seul des six nucléotides, leurs topologies 3D sont assez différentes car HTR dans le sodium adopte une structure à trois G-tétrades composée de deux boucles latérales et d'une boucle diagonale centrale (PDB : 143D) [4]. Cependant, la séquence HTR peut également adopter une conformation stable de type panier en présence de potassium constitué de seulement deux couches de tétrades G (PDB : 2KF8) [31].

Plusieurs séquences HTR naturelles ont été identifiées à ce jour. Les formes 1 (PDB : 2HY9) et 2 (2JPZ) sont constituées de trois tétrades G, mais l'ordre des boucles diffère. Il existe une certaine similitude avec les G-quadruplexes THR qui se forment en solution en présence de sodium [48]. La forme 3 est représentée par un G-quadruplex parallèle avec trois boucles d'inversion de chaîne double (PBD : 1KF1) [3]. Récemment, Lim et al. ont également confirmé la structure d'un dérivé HTR de 27 nt en présence de sodium qui diffère significativement de celles mentionnées ci-dessus (PBD : 2MBJ) [1]. Bien que les deux structures HTR connues résolues dans le sodium possèdent les mêmes orientations de brin relatives, elles diffèrent dans les directionnalités des liaisons hydrogène et dans l'arrangement des boucles. La structure 2MBJ se compose à nouveau de deux boucles à bord et d'une boucle à double inversion de chaîne.

La séquence dérivée du télomère d'Oxytricha d[G4(T4g4)3] (PDB : 201D et 230D) adopte une structure avec des types de boucles similaires à ceux trouvés dans HTR dans le sodium deux boucles latérales et une diagonale centrale [4, 51, 52]. Cependant, la séquence Oxytricha forme un quadruplexe G-tétrade à quatre couches. Au moment de la rédaction, la structure solution de la séquence Oxytricha d[G4(T4g4)3] dans la solution contenant du K + n'avait pas encore été déterminé. La raison principale à cela pourrait être le fait que cette séquence et la THR en présence de potassium peuvent adopter des formes topologiques différentes qui coexistent en solution des bandes supplémentaires sont observées lors de la séparation électrophorétique [14]. Fait intéressant, les quadruplexes G à quatre couches sont très stables, présentant des températures de fusion particulièrement élevées en présence de potassium [14]. Récemment, la structure de d(GGGGCC)4 en présence de potassium a également été déterminé la séquence contient des cytosines à la place des résidus thymine et une 8-bromodésoxyguanosine (PDB : 2N2D) [53]. La structure G-quadruplex adoptée par cette séquence pourrait être étroitement liée à celle du THR dans le potassium. Cette structure antiparallèle est composée de quatre quatuors G qui sont reliés par trois boucles C-C sur chant. Les résultats des spectres CD montrent de nombreuses signatures en commun avec la séquence THR. L'une des cytosines de chaque boucle est empilée sur le quatuor G, ce qui donne une structure très compacte et stable. De même, la température de fusion de la structure est supérieure à 90°C.

Il est généralement admis que la spectroscopie CD est une méthode très utile et rentable pour offrir un premier aperçu de l'architecture des G-quadruplexes repliés. Les spectres CD des G-quadruplexes peuvent être utilisés pour indiquer si l'ADN s'est replié dans une conformation parallèle ou antiparallèle [36, 54].

Bien qu'il existe jusqu'à 25 topologies génériques de repliement des G-quadruplexes, il est possible de classer les structures en trois groupes en fonction de la séquence d'angles de liaison glycosidique adoptée par les guanosines du G-quadruplexe [55]. Le groupe I est constitué de G-quadruplexes parallèles avec des brins orientés dans la même direction et avec des guanosines des mêmes angles de liaison glycosidiques. Les G-quadruplexes parallèles (Groupe I) partagent les mêmes caractéristiques qu'ils contiennent trois ou quatre boucles : un maximum positif intense à

240 nm. Les groupes II et III sont constitués de G-quadruplexes antiparallèles. Le groupe II peut être caractérisé par des guanosines d'angles de liaison glycosidiques dans des orientations telles que anti-anti et syn-syn et aussi syn-anti et anti-syn, tandis que le groupe III est constitué de guanosines empilées d'angles de liaison glycosidiques distincts. Les G-quadruplexes antiparallèles montrent une bande positive à

295 nm. Signaux CD positifs et négatifs à

240 nm, respectivement, sont caractéristiques du groupe II, tandis que le groupe III présente des pics inversés. En revanche, les spectres CD de l'architecture G-quadruplex hautement ordonnée des formes du groupe III présentent des signaux négatifs et positifs à 240 nm et

Les profils CD correspondant à des conformations distinctes du G-quadruplex sont déterminés empiriquement. Par conséquent, l'interprétation des spectres CD de séquences présumées inconnues du G-quadruplex peut être ambiguë. Un certain nombre d'autres facteurs peuvent également entraîner un degré d'incertitude sur l'évaluation des spectres CD, y compris, par exemple, la présence de populations mixtes de divers conformères et/ou la présence de conformations multimères en solution [9, 14, 44, 46 ].

Les mesures de CD montrent clairement que les substitutions G-pour-A ont eu un impact considérable sur le profil spectral de chaque séquence. La présence de l'échafaudage G-quadruplex formé à partir de la séquence HTR non modifiée est caractérisée par un pic positif à

295 nm avec deux épaules à environ

250 nm en présence de potassium (Figure 2(a), ligne rouge). D'après les spectres CD, ces signatures sont caractéristiques des G-quadruplexes antiparallèles du groupe II. Ce spectre est indicatif de la formation d'une structure de type panier à deux couches [31, 55]. La séquence HTR adopte une conformation G-quadruplex antiparallèle claire de type Groupe II en présence de sodium (Figure 2(d), ligne rouge). La structure est caractérisée par un grand maximum positif à

295 nm, un plus petit près

245 nm, et un pic CD négatif à

265 nm. Des études antérieures ont rapporté que ces séquences forment un G-quadruplex intramoléculaire antiparallèle de type panier [4]. Chaque séquence montre un pic clair à

295 nm qui est caractéristique d'une topologie G-quadruplex antiparallèle. Le premier ensemble d'oligomères avec une seule substitution par oligonucléotide en présence de potassium montre deux pics séparés à

265 nm le signal est dominant à 295 nm (spectres représentés en noir). Cependant, les dérivés THR et HTR contenant une ou plusieurs substitutions G-pour-A en présence de potassium montrent une augmentation du pic à

265 nm (figures 2(b) et 2(c)). Cela indique la coexistence de plus d'une structure topologique, c'est-à-dire des configurations à la fois parallèles et antiparallèles, voir également les résultats électrophorétiques de la figure 7. Le polymorphisme structurel augmente avec l'augmentation du nombre de G dans la séquence d'ADN. Le signal CD à

265 nm (spectres représentés en vert) était prédominant pour les oligonucléotides contenant trois substitutions (figure 2(c)).

En présence de sodium, seul le HTR2 séquence avec une substitution dans la deuxième boucle présentait un spectre CD identique à celui de HTR, bien que même cette correspondance présentait des amplitudes plus faibles (spectres en pointillés noirs sur la figure 2(d)). HTR1 et HTR3 les séquences avec des substitutions dans la première et la troisième boucle, respectivement, présentaient également un maximum positif à 295 nm, mais les pics négatifs à 265 nm étaient moins profonds et légèrement décalés vers des longueurs d'onde plus longues par rapport aux résultats de la séquence non modifiée. Malgré ces différences, ils sont néanmoins susceptibles de former des G-quadruplexes du groupe III. Seuls les spectres CD de la séquence THR montrent des signatures de types du groupe II.

Les échantillons du deuxième groupe présentaient un maximum positif à

295 nm avec un léger décalage vers des longueurs d'onde inférieures dans le cas du HTR1,2 et HTR1,3 (Groupe III, spectres représentés en bleu sur la figure 2(b)). Ces deux séquences affichaient l'absence d'un pic négatif à 265 nm, et le plus petit pic positif à environ 245 nm était légèrement décalé vers des longueurs d'onde plus longues (figure 2(e)). HTR2,3 montre un signal négatif à

245 nm et un signal positif à 265 et 295 nm, résultats qui sont révélateurs de la formation de G-quadruplexes antiparallèles du groupe II.

Les spectres CD de HTR0,2,3 sont proches de ceux des G-quadruplexes du groupe II tandis que le CD de HTR0,1,3 et HTR1,2,3 ressemblent à ceux des G-quadruplexes du groupe III. Tous les échantillons avec trois mutations présentaient un maximum positif à

295 nm. HTR0,1,3 présente des signaux négatifs à 235 et 275 nm en présence de sodium (Figure 2(f)), tandis que HTR0,2,3 montre des signaux positifs à 265 et 295 nm.

En général, toutes les séquences modifiées en présence à la fois de Na + et de K + se sont avérées différer dans une certaine mesure du spectre HTR et se sont également avérées différentes les unes des autres. Les profils spectraux CD variables d'un échantillon à l'autre sont le résultat de légers changements dans la topologie G-quadruplex. Cependant, il n'a pas été possible de déterminer le groupe ou la structure des G-quadruplexes avec un certain degré de certitude sur la base des seuls profils spectraux CD en raison de la coexistence de diverses formes topologiques, une conclusion qui a été confirmée par les résultats électrophorétiques discutés dans la section 3.5.

3.2. Spectres CD en présence de PEG-200 et d'acétonitrile

En présence de K + , l'agent déshydratant PEG-200 est connu pour induire un changement de conformation des G-quadruplexes télomériques, principalement la transition d'une structure antiparallèle à un arrangement parallèle [2, 9, 11, 13, 14, 56] . Par conséquent, l'influence du PEG-200 et d'un autre agent déshydratant acétonitrile sur les résultats spectraux CD et la stabilité des dérivés HTR ont également été étudiées. Les spectres CD représentatifs de HTR et THR en présence de différentes concentrations d'agents déshydratants (15, 30 et 50 % en poids) et de KCl 50 mM sont illustrés à la figure 3. Les deux types d'ADN se sont avérés former des structures G-quadruplex. avec une disposition parallèle en forme d'hélice en présence de K + . Cependant, lorsque les séquences ont été étudiées en présence de sodium sans potassium présent, aucune conversion structurelle n'a été observée, ce résultat est resté constant pour tous les dérivés HTR et THR étudiés. Fait intéressant, à une concentration de PEG-200 de 50 % en poids, les pics positifs à 295 nm ont disparu et un signal CD à 265 nm a été enregistré qui a été

2 fois plus élevé que sans la présence de PEG-200. Le même effet a été observé pour l'acétonitrile. Il s'agit d'une propriété intrinsèque de toute molécule G-quadruplex convertie. Dans une étude récente, notre groupe a présenté une hypothèse qui explique ce fait que le signal CD dépend du nombre et de l'orientation des liaisons glycosylées empilées [9, 14, 57]. Nous avons également montré précédemment que le PEG-200 provoque la dimérisation de HTR [9] donc une analyse électrophorétique des séquences en présence de PEG-200 a également été réalisée, Figure 8.

La température de fusion du HTR et de la grande majorité des structures G-quadruplexes est connue pour augmenter en présence de PEG-200. Afin de vérifier ce fait, les températures de fusion ont été déterminées en présence de PEG-200 sur la base de courbes de fusion CD. Les résultats sont résumés dans le tableau 2 et confirment clairement que le PEG-200 augmente les températures de fusion des dérivés HTR. Dans une méthodologie, qui a été utilisée dans nos études précédentes, des mesures à double longueur d'onde ont été effectuées pour les cas dans lesquels les spectres affichaient des pics à la fois à 295 et 265 nm, respectivement [9, 11]. Un A de 63,2°C a été obtenu dans un tampon mRB contenant 50 mM de KCl, comparé à une valeur de 50,4°C dans un tampon avec 50 mM de NaCl pour HTR à 295 nm. L'image globale qui se dégage des données thermodynamiques est que la stabilité des G-quadruplexes des dérivés HTR augmente avec l'augmentation du nombre de substitutions G-pour-A dans les solutions Na + et K +. La valeur la plus faible de HTR a été enregistrée à la fois dans 50 mM de KCl et 50 mM de NaCl. La concentration des dérivés HTR s'est avérée plus élevée en KCl qu'en NaCl. Toutes les séquences étudiées montrent une valeur plus élevée en présence des deux agents déshydratants. Les résultats indiquent que le PEG-200 stabilise les G-quadruplexes avec ou sans la mutation A-pour-G. Les températures de fusion proposées résumées dans le tableau 2 démontrent clairement qu'à la fois le nombre de résidus de guanine dans un tractus G et la nature de l'ion stabilisant sont des facteurs déterminants importants dans la stabilité thermique des G-quadruplexes.

3.3. Mesures de titrage

Notre groupe a récemment développé une nouvelle méthodologie expérimentale pour l'identification de séquences formant des G-quadruplexes à l'aide du colorant cyanine Thiazole Orange (TO). TO est une excellente sonde fluorescente d'ADN pour divers motifs structuraux en raison de son rendement quantique de fluorescence élevé [58]. Cette technique expérimentale peut également être utilisée pour étudier l'hypothèse que les dérivés HTR adoptent des conformations G-quadruplexes. TO interagit avec diverses structures secondaires de l'ADN, mais il a une affinité de liaison plus forte avec les structures triplex et G-quadruplex qu'avec d'autres motifs structuraux [43, 45]. Bien que le TO soit optiquement inactif, les complexes TO-quadruplexes sont chiraux et présentent un profil unique du spectre CD induit (ICD) dans la région visible [44]. Récemment, nous avons décrit les caractéristiques communes de l'ICD partagées par de nombreuses structures G-quadruplexes différentes. Les résultats de l'interaction TO-quadruplex sont les pics positifs à 265 et 295 nm (plage UV), et les trois pics dans la région visible à

473 nm dans la solution soit sans la présence de cations métalliques, soit en présence de Na + [44]. Le TO facilite la formation de structures G-quadruplex même sans la présence d'autres cations, mais la topologie adoptée induite avec le TO peut varier par rapport à la présence de sodium ou de potassium en solution, le profil CD dans la région UV peut être différent. Un profil ICD complètement différent du complexe TO-ADN a été observé pour les séquences incapables d'adopter la structure G-quadruplex [44]. Cependant, d'autres ligands G-quadruplex testés dans notre laboratoire n'étaient pas adaptés à cette fin et ont fourni des résultats ambigus par exemple, Thioflavin T, dérivés de porphyrine, Hoechst 33342, et Hoechst 33258. Cette méthodologie est destinée à être utilisée comme technique supplémentaire car elle étend les possibilités des méthodes spectrales de base en termes de distinction des structures G-quadruplex sans l'utilisation de méthodes plus coûteuses et plus longues. La surveillance ICD peut être appliquée dans différentes conditions, mais elle est la plus sensible dans les solutions sans présence de cations métalliques, elle peut également être appliquée avec une sensibilité légèrement réduite dans les solutions contenant du Na + ou de faibles concentrations de K + (<5 mM). Il convient de noter ici que l'interprétation du profil ICD à une concentration plus élevée de K + n'est en aucun cas sans ambiguïté. Néanmoins, nous avons également effectué les expériences de titrage en présence de 50 mM de KCl car cette condition est plus biologiquement pertinente.

Les résultats de l'analyse de titrage en présence de 50 mM de NaCl sont illustrés à la figure 4. Les résultats de l'ICD affichent les signaux positifs attendus à

510 nm et signaux négatifs à

475 nm, signatures caractéristiques des G-quadruplexes. De plus, la séquence G4C2 a été analysée en raison de sa structure 3D dans des solutions contenant du potassium. Comme prévu, cet oligonucléotide s'est également avéré former des G-quadruplexes dans les conditions données. Des signaux correspondant à ceux des structures antiparallèles G-quadruplex ont également été clairement détectés dans la région UV. En augmentant la concentration de TO, les signaux à 295 et 265 nm diminuent et augmentent, respectivement, phénomènes qui indiquent une conversion d'un repliement antiparallèle à un repliement parallèle. Cet effet a également été observé sous l'influence du PEG-200, figure 3.

Comme indiqué ci-dessus, des mesures de titrage dans 50 mM de KCl ont également été effectuées, figure 5.Les signaux observés dans la région UV suggèrent clairement que des structures G-quadruplexes se sont formées en présence de potassium, mais l'effet de conversion structurelle a été significativement supprimé. Un signal ICD intensif avec un maximum d'environ 500 nm est connu pour correspondre à la formation de complexes entre l'ADN et les ligands. Cependant, il y avait un manque flagrant de l'une des caractéristiques communes claires qui sont typiquement observées pour les profils obtenus en présence de sodium. Il est intéressant de noter que l'ICD de la séquence THR était inversé, et nous suggérons donc que le mode de liaison de TO avec THR est différent de celui avec les dérivés HTR. Une autre explication est que THR forme au moins deux conformations topologiques distinctes en solution et que l'une de ces formes peut se lier plus efficacement à TO. Comme cela a été rapporté dans notre étude précédente, la THR forme au moins trois structures différentes en présence de potassium [14] nous avons donc décidé de vérifier cette hypothèse par séparation électrophorétique.

Il est important d'exclure l'effet secondaire potentiel de l'utilisation du DMSO pendant les expériences de titrage TO. La solution mère de TO contient du DMSO, un solvant aprotique polaire qui peut produire un effet similaire à celui du PEG-200 [56]. La concentration de DMSO utilisée dans nos expériences ne dépassait pas 4,5% en poids. Afin d'éliminer l'effet déshydratant que le DMSO peut provoquer dans les expériences de titrage TO, l'analyse du titrage a également été réalisée en présence de DMSO seul. Cependant, aucun effet significatif n'a été observé à des concentrations inférieures à 5 % en poids en l'absence de Na + , K + et d'ions. Néanmoins, la présence de DMSO dans une solution contenant du K + pourrait expliquer les légères différences des profils ICD à des concentrations de K + supérieures à 5 mM.

3.4. Analyse de fluorescence

Les complexes ADN-TO présentent une absorption claire mais large à environ 500 nm. Un seul pic positif de TO a été observé à 452 nm et cette longueur d'onde a été utilisée pour l'excitation du complexe ADN-TO. Les spectres de fluorescence des séquences HTR et THR sont présentés sur la figure 6. Les mesures ont été réalisées dans trois environnements différents : (i) un tampon mRB sans cations métalliques, (ii) un tampon mRB supplémenté avec 50 mM de NaCl, et (iii) mRB additionné de 50 mM de KCl. Pour les deux oligomères, l'amélioration de la fluorescence a atteint le rendement le plus élevé dans la solution sans cations métalliques. Le rendement de fluorescence de HTR était supérieur au rendement de THR dans les trois conditions testées. Le but de cette expérience était de démontrer que le profil de fluorescence n'est pas fortement dépendant de la séquence d'ADN oligonucléotidique pour ce ligand. L'augmentation de la fluorescence de TO peut induire la formation de tout type de structure G-quadruplex.

3 ??M). La ligne S représente la mobilité du mélange d'oligonucléotides : d

3 ??M). Le tampon de chargement contenait 50 % en poids de PEG-200.

3.5. Électrophorèse en présence de Na + , K + et TO

L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide non dénaturant (PAGE) est une technique accessible qui est utilisée pour compléter les données spectroscopiques lorsque la présence de plusieurs espèces de G-quadruplexes ne peut pas être facilement identifiée sur la base des spectres CD seuls. La mobilité de l'échantillon d'ADN dépend de nombreux facteurs différents, notamment la conformation, la charge et la masse moléculaire. La séparation électrophorétique peut fournir des informations précieuses sur la molécularité des G-quadruplexes. Les G-quadruplexes intramoléculaires ont une structure compacte et migrent donc plus rapidement à travers un gel contenant des cations que leurs homologues linéaires, tandis que les G-quadruplexes intermoléculaires migrent plus lentement en raison de leur poids moléculaire plus élevé [9, 14, 44]. Oligomères d(AC)9, d(CA)14, et d(AC)18 ont été utilisés comme normes en raison de leur manque de structures secondaires. Ces normes ont servi de références pour comparer la mobilité de différents modèles électrophorétiques. Étant donné qu'aucune des séquences utilisées n'était plus longue que 22 nt., les oligonucléotides qui ont été observés ont migré plus rapidement que d(AC)9 pourrait être identifié comme ayant formé des G-quadruplexes intramoléculaires. Il est également raisonnable de supposer que les oligonucléotides qui se sont déplacés plus lentement ou à une vitesse similaire à d(AC)18 avait adopté des structures G-quadruplex d'ordre élevé. La figure 7 montre les enregistrements électrophorétiques de gels de polyacrylamide natifs à 15 % illustrant les mobilités relatives des oligomères en présence de 50 mM de NaCl et de KCl à 10°C (figures 7(a) et 7(c)). De plus, les résultats électrophorétiques correspondants, où les gels et les tampons de charge contiennent 2 équivalents molaires de TO, sont présentés sur les figures 7(b) et 7(d). En général, des tendances claires se dégagent. L'électrophorèse sur gel réalisée en présence de sodium montre que tous les oligonucléotides s'étaient déplacés en un seul bloc, avec des bandes uniques migrant plus rapidement que d(AC)18 dans chaque colonne. Cet effet a également été observé lorsque le TO était présent dans le gel. Ces résultats indiquent que tous les oligonucléotides d'ADN forment des G-quadruplexes intramoléculaires antiparallèles dans ces conditions. Ces résultats sont en accord avec les résultats obtenus par spectroscopie CD. Il est important de noter que des structures intramoléculaires se sont formées exclusivement en présence de sodium malgré l'introduction de mutations dans les séquences HTR augmentant la possibilité de formation de différentes topologies de G-quadruplexes. L'électrophorèse n'a révélé aucune mobilité anormale significative des séquences d'oligomères avec la même longueur se sont avérées se déplacer plus ou moins également.

Contrairement au sodium, la présence de potassium a conduit à la formation d'arrangements intra et intermoléculaires (figures 7(b) et 7(d)). Dans le premier groupe, le HTR1 quadruplex avec une substitution dans la première boucle présentait la bande de migration la plus rapide par rapport à celle de HTR. Une seule frottis a également été observée pour le HTR2 séquence. Les frottis surviennent généralement lorsque deux conformères distincts peuvent être formés. Une isomérisation lente entre les deux conformères au cours de la séparation électrophorétique est la principale source de frottis de bande. La mobilité des HTR et HTR3 séquences avec des substitutions dans la troisième boucle est similaire. Les oligonucléotides contenant deux substitutions par oligomère présentaient des niveaux élevés de polymorphisme. Ces oligonucléotides forment plusieurs conformères coexistants car chaque ligne contient plusieurs bandes se déplaçant à des vitesses différentes. Fait intéressant, le HTR1,2 et HTR1,3 les séquences affichent deux bandes plus rapides bien reconnues, des résultats qui correspondent à la formation de conformères intramoléculaires, et des bandes plus lentes représentant des structures multimères. L'ajout de TO a également provoqué la fusion des conformères les plus rapides et la diminution des structures les plus lentes. HTR2,3 produit une espèce intermoléculaire plus rapide et plus lente (dimère et tétramère). De manière surprenante, les oligonucléotides avec trois substitutions par oligomère se sont avérés légèrement moins polymorphes par rapport aux séquences contenant deux substitutions, ne présentant que des bandes de plus faible amplitude correspondant à la formation de G-quadruplexes multimoléculaires dans le cas du HTR.0,1,3 et HTR1,2,3 séquences. Le TO s'est avéré n'exercer qu'un effet limité sur les formes multimères de ces oligonucléotides.

3.6. Electrophorèse en présence de PEG-200

La dépendance de la dimérisation HTR sur la concentration de PEG 200 a été analysée dans des études antérieures [9]. La formation à la fois de dimères intermoléculaires et de monomères intramoléculaires a été observée dans le tampon contenant une concentration de PEG-200 de 15 % en poids. Les dérivés de HTR contenant 2 et 3 substitutions se sont avérés se convertir facilement en structures dimères à migration plus lente même à des concentrations plus faibles de PEG-200. À une concentration de PEG-200 de 50 % en poids et 50 mM de KCl, la conversion structurelle complète en un G-quadruplex dimère parallèle a été induite, figures 3 et 8. Cet effet n'a pas été observé dans les tampons ne contenant pas de potassium [9, 14 ]. Les mesures de CD à 50 % en poids de PEG-200 n'ont montré aucun signal à

295 nm. Sur la base de nos études précédentes, les espèces intermoléculaires qui migrent plus lentement sont révélatrices de la formation de dimères [2, 9, 14]. La structure 3D de HTR contenant une séquence flanquante dans une condition analogique a été déterminée par RMN [11]. Les résultats montrent une structure G-quadruplex parallèle intramoléculaire (PDB : 2LD8), mais les nucléotides en surplomb peuvent provoquer un encombrement stérique pour la dimérisation de cette structure.

4. Conclusion

Dans cette étude, nous démontrons clairement que l'augmentation du nombre de guanines dans les régions de boucle des séquences HTR soutient la formation de structures G-quadruplex. Toute substitution de A-pour-G augmente la température de fusion, tandis que l'introduction de plusieurs substitutions s'est avérée faciliter la coexistence de plusieurs conformères en présence de potassium. L'introduction systématique de ces substitutions conduit finalement à la formation de séquences qui se produisent dans le Tétrahymène télomère. De plus, des séquences similaires ont également été trouvées dans le génome humain. Ces constatations soulèvent un point intéressant. Pourquoi le Tétrahymène télomères nécessitent des séquences qui peuvent adopter des structures G-quadruplexes aussi hautement stables ? En général, les G-quadruplexes très stables sont généralement une source de problèmes dans les cellules au cours du cycle de vie d'un organisme. La séquence THR est plus polymorphe que HTR, elle forme deux conformères monomères et un dimère différents, comme cela a été montré ici et dans nos études précédentes [14]. Notre analyse s'est concentrée sur des séquences composées de quatre séquences G sans aucun nucléotide en surplomb aux deux extrémités. Ce type d'arrangement n'est pas un modèle idéal pour l'extrapolation aux répétitions télomériques naturelles qui se composent généralement de dizaines à des milliers de répétitions.

Nos résultats démontrent que tous les dérivés de HTR, y compris THR, peuvent être convertis de plis antiparallèles à plis parallèles en présence de potassium et de PEG-200. Les spectres ICD indiquent que le mode de liaison de TO avec THR en présence de KCl pourrait être différent de ceux observés pour les dérivés HTR, et c'est une découverte qui pourrait également être importante pour d'autres molécules reconnaissant la structure THR dans la nature. Cela suggère que la structure de la THR présente certaines caractéristiques structurelles qui sont différentes de celles de la HTR et des dérivés de la HTR en présence de potassium. La confirmation de la signification biologique de ce fait reste un sujet ouvert.

Les conflits d'intérêts

Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par l'Agence slovaque de recherche et de développement dans le cadre des contrats nos. APVV-0280-11 et APVV-0029-16, Coopération européenne en science et technologie (COST CM1406), Slovak Grant Agency (1/0131/16 et 002UPJŠ-4/2015) et bourses universitaires internes (VVGS-PF-2017 -251 et VVGS-2016-259). Les auteurs remercient G. Cowper pour la lecture critique et la correction du manuscrit.

Les références

  1. K. W. Lim, V. C. M. Ng, N. Martín-Pintado, B. Heddi et A. T. Phan, « Structure du télomère humain dans une solution Na+ : un échafaudage G-quadruplex antiparallèle (2+2) révèle une diversité supplémentaire » Recherche sur les acides nucléiques, vol. 41, non. 22, pp. 10556–10562, 2013. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  2. V. Víglaský, K. Tlučková et Ľ. Bauer, « La première dérivée d'une fonction des spectres de dichroïsme circulaire : étude biophysique du G-quadruplex télomérique humain », Revue Européenne de Biophysique, vol. 40, non. 1, pp. 29-37, 2011. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  3. G. N. Parkinson, M. P. H. Lee et S. Neidle, « Structure cristalline des quadruplexes parallèles de l'ADN télomérique humain » La nature, vol. 417, non. 6891, pp. 876-880, 2002. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  4. Y. Wang et D. J. Patel, « Structure de la solution de la répétition télomérique humaine d[AG3(T2AG3)3] G-tétraplexe », Structure, vol. 1, non. 4, pp. 263–282, 1993. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  5. A. Ambrus, D. Chen, J. Dai, T. Bialis, R. A. Jones et D. Yang, « La séquence télomérique humaine forme une structure intramoléculaire G-quadruplex de type hybride avec des brins parallèles/antiparallèles mélangés dans une solution de potassium » Recherche sur les acides nucléiques, vol. 34, non. 9, pp. 2723–2735, 2006. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  6. K. N. Luu, A. T. Phan, V. Kuryavyi, L. Lacroix et D. J. Patel, « Structure du télomère humain dans la solution K+ : un échafaudage intramoléculaire (3 + 1) G-quadruplex », Journal de l'American Chemical Society, vol. 128, non. 30, pp. 9963–9970, 2006. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  7. A. T. Phan, V. Kuryavyi, K. N. Luu et D. J. Patel, « Structure de deux G-quadruplexes intramoléculaires formés par des séquences de télomères humains naturels dans une solution K + », Recherche sur les acides nucléiques, vol. 35, non. 19, pp. 6517–6525, 2007. Afficher sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  8. M. Marušič, P. Šket, L. Bauer, V. Viglasky et J. Plavec, « Structure à l'état de solution d'un G-quadruplex intramoléculaire avec boucles d'hélice, diagonales et de bord » Recherche sur les acides nucléiques, vol. 40, non. 14, pp. 6946-6956, 2012. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  9. P. Tóthová, P. Krafčíková et V. Víglaský, « Formation de multimères hautement ordonnés dans les G-quadruplexes », Biochimie, vol. 53, non. 45, pp. 7013–7027, 2014. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  10. N. Smargiasso, F. Rosu, W. Hsia et al., « Assemblages d'ADN G-quadruplex : longueur de boucle, identité cationique et formation de multimères » Journal de l'American Chemical Society, vol. 130, non. 31, pp. 10208-10216, 2008. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  11. B. Heddi et A. T. Phan, « Structure de l'ADN télomérique humain dans une solution surpeuplée », Journal de l'American Chemical Society, vol. 133, non. 25, pp. 9824–9833, 2011. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  12. M. C. Miller, R. Buscaglia, J. B. Chaires, A. N. Lane et J. O. Trent, « L'hydratation est un déterminant majeur de la stabilité et de la conformation des G-quadruplexes de la séquence humaine des télomères 3 de d(AG 3(TTAG3)3) » Journal de l'American Chemical Society, vol. 132, non. 48, pp. 17105-17107, 2010. Afficher sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  13. D. Miyoshi, A. Nakao et N. Sugimoto, « L'encombrement moléculaire régule le changement structurel du G-quadruplex de l'ADN » Biochimie, vol. 41, non. 50, pp. 15017–15024, 2002. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  14. V. Víglaský, L. Bauer et K. Tlučková, « Caractéristiques structurelles des G-quadruplexes intra- et intermoléculaires dérivés de répétitions télomériques » Biochimie, vol. 49, non. 10, pp. 2110-2120, 2010. Afficher sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  15. J. L. Huppert et S. Balasubramanian, « Prévalence des quadruplexes dans le génome humain », Recherche sur les acides nucléiques, vol. 33, non. 9, pp. 2908–2916, 2005. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  16. A. K. Todd, M. Johnston et S. Neidle, « Motifs de séquence quadruplex putatifs hautement répandus dans l'ADN humain » Recherche sur les acides nucléiques, vol. 33, non. 9, pp. 2901–2907, 2005. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  17. J. Eddy et N. Maizels, « La fonction des gènes est en corrélation avec le potentiel de formation d'ADN G4 dans le génome humain », Recherche sur les acides nucléiques, vol. 34, non. 14, pp. 3887–3896, 2006. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  18. A. Henderson, Y. Wu, Y. C. Huang et al., « Détection de l'ADN G-quadruplex dans les cellules de mammifères » Recherche sur les acides nucléiques, vol. 42, non. 2, pp. 860-869, 2014. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  19. R. F. Hoffmann, Y. M. Moshkin, S. Mouton et al., « Les structures quadruplexes de la guanine se localisent à l'hétérochromatine », Recherche sur les acides nucléiques, vol. 44, non. 1, pp. 152-163, 2016. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  20. V. S. Chambers, G. Marsico, J. M. Boutell, M. Di Antonio, G. P. Smith et S. Balasubramanian, « Séquençage à haut débit des structures G-quadruplex de l'ADN dans le génome humain » Biotechnologie naturelle, vol. 33, non. 8, pp. 877-881, 2015. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  21. E. H. Blackburn, « États des télomères et destins cellulaires », La nature, vol. 408, non. 6808, pp. 53-56, 2000. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  22. M. J. McEachern, A. Krauskopf et E. H. Blackburn, « Telomeres and their control », Revue annuelle de génétique, vol. 34, pp. 331–358, 2000. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  23. N. Grandin et M. Charbonneau, « Protection contre la dégradation des chromosomes au niveau des télomères », Biochimie, vol. 90, non. 1, pp. 41-59, 2008. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  24. W. E. Wright, V. M. Tesmer, K. E. Huffman, S. D. Levene et J. W. Shay, « Les chromosomes humains normaux ont de longs surplombs télomériques riches en G à une extrémité » Développement de gènes et d'amplis, vol. 11, non. 21, pp. 2801–2809, 1997. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  25. J. A. Londoño-Vallejo, « Instabilité des télomères et cancer », Biochimie, vol. 90, non. 1, pp. 73-82, 2008. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  26. C. B. Harley, « Perte de télomères : horloge mitotique ou bombe à retardement génétique ? Recherche de mutation ADNging, vol. 256, non. 2–6, pp. 271-282, 1991. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  27. A. J. Sfeir, W. Chai, J. W. Shay et W. E. Wright, « Telomere-end processing : The terminal nucleotidesof human chromosomes », Cellule moléculaire, vol. 18, non. 1, pp. 131-138, 2005. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  28. L. M. Colgin et R. R. Reddel, « Mécanismes de maintenance des télomères et immortalisation cellulaire », Opinion actuelle en génétique et développement d'amp, vol. 9, non. 1, pp. 97-103, 1999. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  29. A. M. Zahler, J. R. Williamson, T. R. Cech et D. M. Prescott, "Inhibition de la télomérase par les structures d'ADN G-quartet," La nature, vol. 350, non. 6320, pp. 718-720, 1991. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  30. S. Neidle et G. Parkinson, « Maintenance des télomères en tant que cible pour la découverte de médicaments anticancéreux », Nature examine la découverte de médicaments, vol. 1, non. 5, pp. 383-393, 2002. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  31. K. W. Lim, S. Amrane, S. Bouaziz et al., « Structure du télomère humain dans une solution K + : un G-quadruplex de type panier stable avec seulement deux couches G-tétrade » Journal de l'American Chemical Society, vol. 131, non. 12, pp. 4301–4309, 2009. Afficher sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  32. R. Buscaglia, M. C. Miller, W. L. Dean et al., "La liaison au polyéthylène glycol modifie la structure des télomères humains G-quadruplex par sélection conformationnelle", Recherche sur les acides nucléiques, vol. 41, non. 16, pp. 7934–7946, 2013. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  33. L. Petraccone, A. Malafronte, J. Amato et C. Giancola, « G-quadruplexes d'ADN télomérique humain : combien de conformations dans des solutions contenant du PEG ? » Le Journal de Chimie Physique B, vol. 116, non. 7, pp. 2294-2305, 2012. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  34. V. Viglasky, L. Bauer, K. Tluckova et P. Javorsky, « Évaluation des G-quadruplexes télomériques humains : l'influence des séquences en surplomb sur la stabilité et le repliement des quadruplexes » Journal des acides nucléiques, vol. 2010, Numéro d'article 820356, 2010. Afficher sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  35. M. Vorlícková, M. Tomasko, A. J. Sagi, K. Bednarova et J. Sagi, « 8-Oxoguanine dans un quadruplex de la séquence d'ADN des télomères humains » Journal de la FEBS, vol. 279, non. 1, pp. 29-39, 2012. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  36. D. Renčiuk, I. Kejnovská, P. Školáková, K. Bednářová, J. Motlová et M. Vorlíčková, « Arrangements du quadruplex de l'ADN des télomères humains dans des solutions K+ physiologiquement pertinentes » Recherche sur les acides nucléiques, vol. 37, non. 19, pp. 6625–6634, 2009. Afficher sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  37. M. Tomaško, M. Vorlíčková et J. Sagi, « Substitution de l'adénine par la guanine dans la séquence d'ADN des télomères humains formant un quadruplex G3 (T2AG3)3 », Biochimie, vol. 91, non. 2, pp. 171-179, 2009. Afficher sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  38. M. Vorlíčková, J. Chládková, I. Kejnovská, M. Fialová et J. Kypr, « La topologie du tétraplexe guanine de l'ADN des télomères humains est régie par le nombre de répétitions (TTAGGG) » Recherche sur les acides nucléiques, vol. 33, non. 18, pp. 5851–5860, 2005. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  39. I. Kejnovská, K. Bednářová, D. Renčiuk et al., « Les lésions abasiques en cluster modifient profondément la structure et la stabilité des G-quadruplexes télomériques humains » Recherche sur les acides nucléiques, vol. 45, non. 8, pp. 4294-4305, 2017. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  40. H. Konvalinová, Z. Dvořáková, D. Renčiuk et al., « Divers effets des lésions de base naturelles sur la structure et la stabilité du quadruplex de l'ADN des télomères humains » Biochimie, vol. 118, article n. 4773, pp. 15-25, 2015. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  41. M. Babinský, R. Fiala, I. Kejnovská et al., « La perte d'adénines en boucle modifie le repliement quadruplex du télomère humain d(AG(3)(TTAG(3))(3)) », Recherche sur les acides nucléiques, vol. 42, non. 22, pp. 14031–14041, 2014. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  42. C. W. Greider et E. H. Blackburn, « Une séquence télomérique dans l'ARN de Tétrahymène télomérase requise pour la synthèse des répétitions des télomères », La nature, vol. 337, non. 6205, pp. 331–337, 1989. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  43. I. Lubitz, D. Zikich et A. Kotlyar, « Liaison spécifique à haute affinité de l'orange thiazole à l'ADN triplex et g-quadruplex » Biochimie, vol. 49, non. 17, pp. 3567–3574, 2010. Afficher sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  44. P. Krafčíková, E. Demkovičová et V. Víglaský, « G-quadruplexes dérivés du virus Ebola : interaction avec le thiazole orange » Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Généralités, vol. 1861, n. 5, pp. 1321–1328, 2016. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  45. J. Mohanty, N. Barooah, V. Dhamodharan, S. Harikrishna, P. I. Pradeepkumar et A. C. Bhasikuttan, « La thioflavine T en tant qu'inducteur efficace et capteur fluorescent sélectif pour l'ADN télomérique humain G-quadruplex » Journal de l'American Chemical Society, vol. 135, non. 1, pp. 367-376, 2013. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  46. J. B. Chaires, « G-quadruplex télomérique humain : études thermodynamiques et cinétiques de la stabilité du quadruplex télomérique », Journal de la FEBS, vol. 277, non. 5, pp. 1098-1106, 2010. Afficher sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  47. Y. Wang et D. J. Patel, « Structure de la solution d'un ADN G-Quadruplex à brins parallèles », Journal de biologie moléculaire, vol. 234, non. 4, pp. 1171-1183, 1993. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  48. Y. Wang et D. J. Patel, « Structure de la solution de la répétition télomérique de Tetrahymena d(T2G4)4 G-tétraplex », Structure, vol. 2, non. 12, pp. 1141-1156, 1994. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  49. J. Dai, C. Punchihewa, A. Ambrus, D. Chen, R. A. Jones et D. Yang, « Structure du G-quadruplex télomérique humain intramoléculaire dans une solution de potassium : une nouvelle triple formation d'adénine » Recherche sur les acides nucléiques, vol. 35, non. 7, pp. 2440–2450, 2007. Afficher sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  50. J. Dai, M. Carver, C. Punchihewa, R. A. Jones et D. Yang, « Structure du G-quadruplex télomérique humain intramoléculaire de type hybride-2 en solution K+ : aperçu du polymorphisme de structure de la séquence télomérique humaine » Recherche sur les acides nucléiques, vol. 35, non. 15, pp. 4927–4940, 2007. Afficher sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  51. Y. Wang et D. J. Patel, "Structure de la solution du G-tétraplexe OxytrichaTelomer Repeat d[G4(T4G4)3]", Journal de biologie moléculaire, vol. 251, non. 1, pp. 76-94, 1995. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  52. F. W. Smith, P. Schultze et J. Feigon, « Structures de solution de quadruplexes unimoléculaires formées par des oligonucléotides contenant Oxytricha répétitions des télomères », Structure, vol. 3, non. 10, pp. 997-1008, 1995. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  53. J. Brčić et J. Plavec, "Structure de solution d'un quadruplex d'ADN contenant une répétition GGGGCC liée à l'ALS et à la FTD stabilisée par une substitution de 8-bromodésoxyguanosine", Recherche sur les acides nucléiques, vol. 43, non. 17, pp. 8590-8600, 2015. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  54. J. Kypr, I. Kejnovská, D. Renčiuk et M. Vorlíčková, « Dichroïsme circulaire et polymorphisme conformationnel de l'ADN », Recherche sur les acides nucléiques, vol. 37, non. 6, pp. 1713-1725, 2009. Afficher sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  55. A. I. Karsisiotis, N. M. Hessari, E. Novellino, G. P. Spada, A. Randazzo et M. Webba Da Silva, « Caractérisation topologique des G-quadruplexes d'acides nucléiques par absorption UV et dichroïsme circulaire » Angewandte Chemie Édition Internationale, vol. 50, non. 45, pp. 10645–10648, 2011. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  56. D. Miyoshi, T. Fujimoto et N. Sugimoto, « L'encombrement moléculaire et la régulation de l'hydratation de la formation de G-quadruplex », Sujets en chimie actuelle, vol. 330, pp. 87-110, 2013. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  57. D.M. Gray, J.-D. Wen, C. W. Gray et al., « Spectres CD mesurés et calculés de quatuors G empilés avec des polarités identiques ou opposées » Chiralité, vol. 20, non. 3-4, pp. 431-440, 2008. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar
  58. C. Allain, D. Monchaud et M.-P. Teulade-Fichou, « FRET modelé par l'ADN G-quadruplex : une interaction ternaire spécifique utilisant une paire originale de partenaires donneurs/accepteurs », Journal de l'American Chemical Society, vol. 128, non. 36, pp. 11890–11893, 2006. Voir sur : Site de l'éditeur | Google Scholar

Droits d'auteur

Copyright © 2017 Erika Demkovičová et al. Il s'agit d'un article en libre accès distribué sous la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation, une distribution et une reproduction sans restriction sur n'importe quel support, à condition que l'œuvre originale soit correctement citée.


MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Culture de cellules

Des fibroblastes de prépuce BJ ont été cultivés dans un mélange 4:1 de DMEM et de milieu 199 contenant 10 % de sérum de veau supplémenté en fer (Hyclone, Logan, UT) et de la gentamicine (25 g/ml Sigma, St. Louis, MO) à 37°C en 5% de CO2. Environ 30 doublements avant la sénescence, certaines cellules ont été infectées par un rétrovirus pLXSN exprimant les protéines HPV16 E6 et E7 (Halbert et al., 1992) et sélectionné sur G418 (400 μg/ml) pendant 10-14 jours.

Préparation de la propagation de la métaphase et analyse cytogénétique

Les cellules ont été incubées avec du colcemid (Invitrogen, Carlsbad, CA) pendant 4 h, trypsinisées, traitées avec du tampon KCl hypotonique (0,075 M) pendant 30 min à 37°C, et lavées plusieurs fois avec du méthanol-acide acétique (3:1) jusqu'à ce que un culot de globules blancs propre a été obtenu. Les pastilles ont été stockées à -20°C jusqu'à ce qu'elles soient déposées sur des lames et fixées au GTG en utilisant des méthodes standard (Gustashaw, 1997). Les images de métaphase ont été analysées à l'aide du logiciel CytoVision (Applied Imaging, San Jose, CA) au laboratoire de cytogénétique, University of Texas Southwestern Medical Center.

Hybridation in situ par fluorescence et analyse comparative d'hybridation génomique

Les lames d'un jour ont été réhydratées dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,5) pendant 15 min à température ambiante, fixées dans du formaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant 2 min, puis lavées dans du PBS trois fois pendant 5 min. Les lames ont été traitées avec de la pepsine (1 mg/ml, pH 2,0) à 37°C pendant 10 min et lavées deux fois pendant 2 min dans du PBS. Les lames ont été à nouveau fixées dans du formaldéhyde pendant 2 min, lavées trois fois dans du PBS, puis déshydratées par des incubations en série de 2 min dans de l'éthanol à 70, 90 et 100 % et séchées à l'air. Les lames ont été dénaturées 10 min à 78°C dans un mélange d'hybridation (20 l) contenant 70% de formamide, 15 ng 3'-Cy3-conjugué (CCCTAA)3 2'-désoxyoligonucléotide N3-P5′ sonde télomérique phosphoramidate, 0,25% (wt/vol) réactif bloquant (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) et 5% MgCl2 dans du Tris 10 mM, pH 7,2, puis recuit pendant 2 h à température ambiante. Après deux lavages avec 70 % de formamide, 0,1 % d'albumine de sérum bovin et 10 mM de Tris, pH 7,2, et deux lavages avec 0,15 M de NaCl, 0,05 % de Tween-20 et 0,05 M de Tris, les lames ont été déshydratées par une série de 2 minutes. incubations dans l'éthanol et séchées à l'air dans l'obscurité. Les lames ont ensuite été hybridées sans dénaturation dans la même solution d'hybridation que ci-dessus mais contenant l'oligonucléotide télomérique complémentaire (3'-Cy3-conjugué (TTAGGG)3 2'-désoxyoligonucléotide N3-P5′ Sonde télomérique phosphoramidate, pendant 2 h à température ambiante. Les lames ont été à nouveau lavées en utilisant les mêmes étapes de lavage que ci-dessus, déshydratées par une série d'éthanol et séchées à l'air dans l'obscurité. Les chromosomes ont été contre-colorés avec du Vectashield contenant du 4,6-diamidino-2-phénylindole-dichlorhydrate (DAPI, concentration finale de 0,6 ug/ml, Vector Laboratories, Burlingame, CA) pour l'identification des chromosomes.

Les lames ont été scannées et les propagations de métaphase ont été automatiquement trouvées en utilisant le mode Msearch du système logiciel Metafer (MetaSystem Hard and Software, Altlussheim, Allemagne). Les images de métaphase ont été capturées automatiquement sous forme de 90 piles séparées de 0,2 m par un microscope Zeiss Axioplan 2 (63 ×, objectif à immersion dans l'huile Plan-Apochromat 1,4 NA Thornwood, NY) avec des ensembles de filtres à passe unique Cy3 et DAPI en utilisant le mode AutoCapt du Metafer système logiciel. L'image DAPI inversée de chaque propagation de métaphase a été caryotypée à l'aide du système d'analyse d'images numériques ISIS (MetaSystem) et l'intensité du signal des télomères a été mesurée par un logiciel d'analyse CGH modifié (MetaSystem). Les extrémités des télomères ont été interprétées comme des extrémités sans signal des télomères lorsque le rapport rouge (télomère) à bleu (DAPI) était nul (Figure 1).

Figure 1. Identification des télomères les plus courts. Les métaphases BJ à PD84 ont été hybridées en série à des sondes télomériques riches en C et en G pour maximiser la détection de petites régions télomériques. (A) Les télomères si courts qu'ils n'ont pas réussi à donner un signal observable (extrémités sans signal) ont été identifiés par analyse CGH. (B) La fréquence des extrémités sans signal pour 100 métaphases est indiquée pour toutes les extrémités télomériques à partir d'une analyse de 403 métaphases. Les BAC à moins de 100 kb des extrémités des télomères indiqués par des flèches verticales ont été utilisés dans l'analyse illustrée à la figure 2.

Pour les études de fluorescence bicolore des répétitions de variantes télomériques, 20 ng de la sonde variante de séquence télomérique (soit Cy3-conjugué (TCAGGG)3 ou (TGAGGG)3 2'-désoxyoligonucléotide N3-P5′ phosphoramidate) a été combiné avec 15 ng 3′-FITC-conjugué (TTAGGG)3 2'-désoxyoligonucléotide N3-P5Sonde phosphoramidate et traitée comme ci-dessus avec une étape de dénaturation de 10 min et une hybridation de 16 h à 37°C. Après le lavage et la coloration DAPI, les étalements de métaphase ont été capturés numériquement avec des ensembles de filtres passe-bande Cy3/FITC/DAPI de précision.

Analyse d'hybridation in situ par immunofluorescence et fluorescence

Les cellules ont été cultivées sur des lames de chambre en verre pendant au moins 96 h avant immunocoloration pour les protéines γH2AX et 53BP1 afin de minimiser le stress survenant pendant la trypsinisation. Les cellules ont été brièvement lavées avec du PBS et fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % fraîchement préparé dans du PBS pendant 15 min à température ambiante. Après trois lavages avec du PBS, les cellules ont été perméabilisées pendant 15 min avec du PBS contenant 0,2 % de Triton X-100, bloquées pendant 1 h avec du sérum de chèvre à 1,5 % (Vector Laboratories) dans du PBS et doublement colorées avec 50 ng/μl de monoclonal de souris. anti-53BP1 (aimablement fourni par le Dr Chen, Mayo Clinic) et 10 ng/μl d'antiphospho-H2AX de lapin (Ser 139 Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) à 37°C pendant 1 h. Les cellules ont ensuite été lavées trois fois pendant 5 min avec du PBS et incubées pendant 1 h avec des anticorps anti-lapin conjugués Alexa Fluor 568 (1:200) et Alexa 488-conjugués anti-souris (1:200 Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA Molecular Probes, Eugene, OR) à température ambiante. Après avoir lavé les cellules trois fois pendant 5 min avec du PBS, les cellules ont été déshydratées par une série d'éthanol (70, 90 et 100 %) pendant 1 min chacune et contre-colorées avec du Vectashield contenant du DAPI pour l'identification nucléaire. Les lames ont été numérisées et les noyaux positifs ont été automatiquement trouvés et capturés par un microscope Zeiss Axioplan 2 (63 ×, objectif à immersion dans l'huile Plan-Apochromat de 1,4 NA) avec des ensembles de filtres à passe unique Texas Red, FITC et DAPI en utilisant le mode AutoCapt de le système logiciel Metafer. Les images ont été enregistrées sous forme de quatre-vingt-dix piles z séparées de 0,2 µm.

Les lames ont ensuite été traitées pour une analyse par hybridation in situ en fluorescence (FISH) en utilisant les sondes BAC RP3-416J7 (6pter), RP11-1197K16 (17qter), RP4-764O12 (7qter), RP11-1260E13 (17pter), RP11-974F22 ( 9qter) et RP11-81L3 (9q21, 62 Mo du 9qter Children's Hospital Oakland Research Institute). Tous les BAC sauf 9q21 étaient à moins de 100 kb du télomère. Les ADN BAC ont été extraits à l'aide d'un kit de grande taille (Qiagen, Chatsworth, CA) et marqués avec du dUTP conjugué Spectrum-orange ou Spectrum-green après un protocole de kit de traduction de pseudo (Vysis, Downers Grove, IL). Après lavage trois fois pendant 5 min avec du PBS, les cellules ont été déshydratées à travers une série d'éthanol comme ci-dessus et séchées à l'air. L'ADN a été dénaturé pendant 10 min à 70°C dans un tampon d'hybridation contenant 70 % de formamide (Sigma) et des solutions 2 x SSC (pH 7,0). Après dénaturation, les cellules ont été déshydratées par une série d'éthanol froid et séchées à l'air. Les cellules ont été soumises à deux autres étapes de dénaturation et de déshydratation ci-dessus pour éliminer complètement les anticorps fluorescents γ-H2AX et 53BP1. Un mélange de 100 ng d'une sonde BAC conjuguée Spectrum-orange- et une sonde Spectrum-vert-verte dans un tampon d'hybridation contenant 50 % de formamide, 10 % de sulfate de dextrane et 1× SSC a été dénaturé à 78°C pendant 5 min puis hybridé aux cellules pendant 16 h à 37°C en chambre humidifiée. Les lames ont été lavées pendant 2 min avec 0,4 x SSC/0,3 % NP-40 à 70°C et 1 min dans 2 x SSC/0,1 % NP-40 à température ambiante. Après avoir été séchées à l'air, les cellules ont été contre-colorées avec du DAPI. Les mêmes noyaux identifiés pour la coloration γH2AX/53BP ci-dessus ont été automatiquement trouvés et capturés avec des ensembles de filtres à passe unique Spectrum-orange, Spectrum-green et DAPI en utilisant le mode AutoCapt du système logiciel Metafer. Les images ont été enregistrées sous forme de 90 piles z séparées de 0,2 µm. Les noyaux ont été analysés à l'aide du système d'analyse d'images numériques ISIS (MetaSystem). La même lame a ensuite été resondée avec un ensemble différent de sondes BAC après avoir à nouveau éliminé les signaux précédents avec les étapes de dénaturation décrites ci-dessus. Les sites de cartographie physique de ces BAC ont été confirmés à l'aide d'une analyse FISH régulière d'au moins 20 propagations en métaphase de cellules fibroblastiques normales par BAC, et aucun polymorphisme n'a été observé.


Matériel électronique supplémentaire

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Fichier de données supplémentaires 1 : La séquence p-arm telle qu'elle est donnée était attachée à la coordonnée p-arm, et le complément inverse des séquences q-arm était attaché aux coordonnées q-arm indiquées (PDF 12 Ko)

13059_2007_1632_MOESM2_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 2 : les modules Duplicon ont été définis en traitant les résultats des recherches BLAST de séquences de requêtes subtélomériques organisées en interne (voir texte et Matériaux et méthodes). Des paires colinéaires et correctement orientées de correspondances BLAST avec la séquence de requête ont été jointes en une chaîne si elles n'étaient pas séparées de plus de 25 ko et n'étaient pas interrompues par d'autres résultats de la même séquence de requête. Des groupes de coups de souffle enchaînés couvrant environ 1 kb de la séquence du sujet ont été définis comme des duplicons. Ces méthodes étaient tolérantes aux insertions et aux suppressions d'une taille de <25 kb (par exemple, des rétrotransposons) mais ne toléraient pas les réarrangements. (PDF 61 Ko)

13059_2007_1632_MOESM3_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 3 : Chaque module est défini par un ensemble d'alignements par paires, et chaque séquence de référence dans ces ensembles est représentée par une seule ligne dans ce tableau. La première colonne (module) contient un identifiant pour la copie particulière du module (duplicon) indiqué dans les trois colonnes suivantes. Ces colonnes (séquence de requête) listent l'emplacement subtélomérique de la séquence de requête définissant le module (voir Matériels et méthodes). La colonne « séquences alignées » indique les emplacements des autres duplicons dans ce module, mis en correspondance par la requête. Les coordonnées dans cette colonne se réfèrent soit à nos assemblages subtélomériques publiés (désignés par chromosome et bras p ou q) soit à la construction du génome humain 35 (toutes les autres désignations). L identitéchaque est le pourcentage d'identité de séquence nucléotidique à travers l'alignement par paires enchaîné, à l'exclusion de la séquence masquée. L identitémoy est le pourcentage moyen d'identité de tous les alignements par paires dans le module. Il s'agit du nombre utilisé pour %ID dans les graphiques et les analyses de cet article.La dernière colonne affiche un 1 si le module contient des correspondances de séquences intrachromosomiques non subtélomériques, et 0 si ce n'est pas le cas. (PDF 772 Ko)

13059_2007_1632_MOESM4_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 4 : Ce tableau indique les nombres de modules duplicons définis par sous-télomère. La liste complète de ces modules est incluse dans le fichier de données supplémentaires 3. La colonne 'subtélomérique' indique le nombre total de modules pour chaque région subtélomérique (puisque chaque module est défini par un ensemble de coordonnées subtélomériques). La colonne « non subtélomérique » répertorie le sous-ensemble de ces modules avec une homologie avec les régions dupliquées qui se trouvent à l'extérieur des sous-télomères. Une comparaison de ces duplicons non subtélomériques aux copies subtélomériques est incluse dans la figure 3 et dans le fichier de données supplémentaires 5. La colonne « intra-chromosomique » indique le sous-ensemble de modules présentant une homologie avec une région différente sur le même chromosome. (PDF 27 Ko)

13059_2007_1632_MOESM5_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 5 : les régions subtélomériques correspondent à l'ensemble de séquences de requête énumérées dans le fichier de données supplémentaires 1 et au pourcentage moyen d'identité à travers les séquences sur lesquelles chacune est alignée. Les régions non subtélomériques correspondent aux séquences alignées qui tombent en dehors des régions subtélomériques (le sous-ensemble répertorié dans le fichier de données supplémentaires 2). (PDF 42 Ko)

13059_2007_1632_MOESM6_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 6 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web de Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 846 Ko)

13059_2007_1632_MOESM7_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 7 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des faisceaux (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 543 Ko)

13059_2007_1632_MOESM8_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 8 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des faisceaux (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 531 Ko)

13059_2007_1632_MOESM9_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 9 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 602 Ko)

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Fichier de données supplémentaires 10 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des faisceaux (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 474 Ko)

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Fichier de données supplémentaires 11 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 758 Ko)

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Fichier de données supplémentaires 12 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web de Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 552 Ko)

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Fichier de données supplémentaires 13 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 630 Ko)

13059_2007_1632_MOESM14_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 14 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web de Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 564 Ko)

13059_2007_1632_MOESM15_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 15 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 793 Ko)

13059_2007_1632_MOESM16_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 16 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des faisceaux (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 657 Ko)

13059_2007_1632_MOESM17_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 17 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 654 Ko)

13059_2007_1632_MOESM18_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 18 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web de Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 693 Ko)

13059_2007_1632_MOESM19_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 19 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 472 Ko)

13059_2007_1632_MOESM20_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 20 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 718 Ko)

13059_2007_1632_MOESM21_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 21 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 474 Ko)

13059_2007_1632_MOESM22_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 22 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 532 Ko)

13059_2007_1632_MOESM23_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 23 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 641 Ko)

13059_2007_1632_MOESM24_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 24 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche.La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 544 Ko)

13059_2007_1632_MOESM25_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 25 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Internet du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 607 Ko)

13059_2007_1632_MOESM26_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 26 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 834 Ko)

13059_2007_1632_MOESM27_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 27 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 513 Ko)

13059_2007_1632_MOESM28_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 28 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 520 Ko)

13059_2007_1632_MOESM29_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 29 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 501 Ko)

13059_2007_1632_MOESM30_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 30 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 538 Ko)

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Fichier de données supplémentaires 31 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 542 Ko)

13059_2007_1632_MOESM32_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 32 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 659 Ko)

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Fichier de données supplémentaires 33 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 551 Ko)

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Fichier de données supplémentaires 34 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 978 Ko)

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Fichier de données supplémentaires 35 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 531 Ko)

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Fichier de données supplémentaires 36 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 594 Ko)

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Fichier de données supplémentaires 37 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 690 Ko)

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Fichier de données supplémentaires 38 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web de Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 504 Ko)

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Fichier de données supplémentaires 39 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Internet du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 790 Ko)

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Fichier de données supplémentaires 40 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 556 Ko)

13059_2007_1632_MOESM41_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 41 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 503 Ko)

13059_2007_1632_MOESM42_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 42 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 661 Ko)

13059_2007_1632_MOESM43_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 43 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct.Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 596 Ko)

13059_2007_1632_MOESM44_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 44 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 627 Ko)

13059_2007_1632_MOESM45_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 45 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 508 Ko)

13059_2007_1632_MOESM46_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 46 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 548 Ko)

13059_2007_1632_MOESM47_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 47 : Les séquences subtélomériques présentées sont les assemblages publiés précédemment [6] et sont disponibles sur le site Web du Riethman Lab [47]. L'extrémité télomérique de chaque assemblage de séquence est située à gauche. La distance entre la fin de la séquence et le début du réseau de répétitions terminales est indiquée par la flèche verticale à l'extrémité télomérique de la séquence. La position et l'orientation des voies (TTAGGG)n sont représentées par des flèches noires. Panneaux supérieurs : les segments génomiques dupliqués sont identifiés par chromosome (couleur) et s'ils sont subtélomériques (rectangles délimités), non subtélomériques (rectangles non délimités) ou intrachromosomiques (situés au-dessus des coordonnées subtélomériques). Chaque rectangle représente un duplicon distinct. Panneaux inférieurs : les segments génomiques dupliqués sont les mêmes que dans les panneaux supérieurs, mais identifiés par la similarité de la séquence nucléotidique avec la séquence des sous-télomères de la requête (schéma de couleurs comme indiqué dans la clé). (PDF 562 Ko)

13059_2007_1632_MOESM48_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 48 : ce tableau montre des blocs de modules qui se produisent exclusivement dans les régions subtélomériques. La première colonne donne un identifiant pour chaque bloc. Les trois colonnes suivantes (séquence de requête) donnent l'emplacement subtélomérique qui définit le bloc (qui sera composé d'un ou plusieurs modules adjacents). Par souci d'exhaustivité, dans certains cas, des séquences alignées ont été incluses dans ces blocs même si elles étaient inférieures aux seuils de définition de module. Le pourcentage d'identité des alignements chaînés entre les séquences est indiqué (hors séquence masquée). Les gènes/familles de gènes nommés qui ont des transcrits correspondant à une partie ou à la totalité des blocs de duplicon respectifs sont répertoriés dans la dernière colonne. Le bloc 7 est la répétition en tandem D4Z4 sur les sous-télomères 4q et 10q, pour laquelle aucun pourcentage d'identité n'est calculé en raison du très grand nombre et des diverses identités en pourcentage des alignements BLAST parmi les répétitions en tandem D4Z4. (PDF 22 Ko)

13059_2007_1632_MOESM49_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 49 : Ce tableau montre des blocs de modules adjacents aux extrémités des télomères finis (voir Matériaux et méthodes). Les colonnes décrivent les mêmes catégories d'informations que celles indiquées dans le fichier de données supplémentaires 48. Il existe un ensemble limité de copies non subtélomériques de duplicons sous-terminaux (fichier de données supplémentaires 49). Leurs emplacements génomiques suggèrent des sites de réarrangements chromosomiques ancestraux associés aux télomères, y compris une fusion de télomères bien documentée en 2q13-q14 [37] qui contient des représentants des familles de duplicons subterminales A, B, C et D (Fichier de données supplémentaires 49). Le site non subtélomérique d'un duplicon de la famille D à 3p12.3 est la pointe d'une région de duplication étendue l'ADN sur le flanc centromérique de ce site contient une homologie subtélomérique 4q et 10q, y compris une structure de répétition satellite bêta ressemblant à une partie de la répétition D4Z4 . La famille subterminale F contient plusieurs sites non subtélomériques de duplicons, ceux des chromosomes 22q, 14q et 12p sont très proches des centromères respectifs (Fichier de données supplémentaires 49), indiquant une inversion ancestrale potentielle d'un bras chromosomique suivie d'une duplication des séquences péricentromériques comme un mécanisme de genèse des copies non subterminales de cette famille de séquences subterminales. La similarité de séquence entre les copies de duplicons subterminales au sein d'une famille est principalement de l'ordre de 90 à 96 % pour les blocs subterminaux A, B et D (tableau 2, voir le fichier de données supplémentaires 49 pour les rares exceptions.). Comme pour les blocs subtel uniquement, certains de ces duplicons ne correspondent qu'à une partie de la séquence du bloc subterminal. Il existe également un certain chevauchement dans les séquences occupées par les blocs de duplicons subterminaux A, B et D, ce qui se reflète dans leur occupation de parties des mêmes familles de transcrits RPL23A7 et FAM41C (tableau 2). Les homologies interfamiliales entre les blocs sous-terminaux A, B et D sont également dans la plage d'identité de 90 à 96 %, mais les positions des duplicons dans les blocs varient et sont situées à différentes distances du tractus (TTAGGG)n également, il Il existe plusieurs organisations alternatives d'éléments répétitifs à copie élevée (masqués et non examinés en détail dans cette étude) au sein de ces blocs subterminal. Ainsi, il pourrait y avoir un brassage plus fréquent des séquences subterminales que des séquences situées plus centromériquement, au moins dans un sous-ensemble d'allèles subtélomériques, cette idée est largement cohérente avec un modèle antérieur de structure subtélomérique comportant des compartiments avec des propriétés fonctionnelles distinctes [9]. Un raffinement supplémentaire de la classification de ces familles subterminales semble possible et bénéficiera d'un échantillonnage plus étendu de séquences adjacentes (TTAGGG)n à partir d'allèles supplémentaires. Le bloc subterminal F contient un duplicon sur 10p avec une similitude très élevée avec la séquence de requête 18p, suggérant un événement de duplication très récent, les duplicons restants étaient tous dans la plage d'identité de 91 à 94 %. Le bloc C a la similarité de séquence la plus élevée parmi toutes les familles de séquences de duplicons subterminales et a une copie au locus de fusion 2q. Le bloc E (96 à 97 %) est inhabituel en ce qu'il correspond à une partie de la famille de duplicons subtélomériques uniquement 6 (tableau 1), et est la seule famille de séquences de duplicons subterminales avec des propriétés de subtel uniquement. Cet allèle séquencé particulier de 17p pourrait s'être formé par la troncature d'une extrémité chromosomique au sein de ce grand duplicon composé uniquement de sous-télomères, car il existe des preuves cartographiques de plusieurs allèles plus longs du télomère 17p (H Riethman, non publié). Il est intéressant de noter que les segments (TTAGGG)n à 17p et, en effet, sur cet allèle particulier de 17p ont tendance à être systématiquement parmi les plus courts du génome humain [19, 51]. (PDF 44 Ko)

13059_2007_1632_MOESM50_ESM.pdf

Fichier de données complémentaires 50 : Comparaison des blocs duplicon subtel-only et subterminal définis dans ce travail avec les blocs d'homologie subtélomérique rapportés dans Linardopoulou et al. [12] (PDF 17 Ko)

13059_2007_1632_MOESM51_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 51 : Les transcriptions des candidats ont été identifiées en explosant les séquences de requêtes représentatives des sous-télomères uniquement (Fichier de données supplémentaires 48) contre la base de données NCBI RefSeq mrna (téléchargée le 24 juillet 2006) [52]. Les ARNm humains avec 90 % ou plus d'homologie ont été analysés par Spidey [53] contre l'ensemble de représentants de blocs de duplicon uniquement subtélomères. Ce tableau a été filtré pour les hits au-dessus de 95% d'identité selon les prédictions de Spidey. Les première et deuxième colonnes indiquent le bloc subtélomérique uniquement et l'accession RefSeq qui s'alignent l'un sur l'autre. La troisième est la ligne de description de la base de données RefSeq. Les quatrième et cinquième colonnes sont le pourcentage d'identité et le pourcentage de couverture de l'ARNm aligné tel que rapporté par Spidey. (PDF 29 Ko)

13059_2007_1632_MOESM52_ESM.pdf

Fichier de données supplémentaires 52 : Les transcriptions des candidats ont été identifiées en explosant les séquences de requêtes subterminales représentatives (Fichier de données supplémentaires 49) contre la base de données NCBI RefSeq mrna (téléchargé le 24 juillet 2006) [52]. Les ARNm humains avec 90 % ou plus d'homologie ont été analysés par Spidey [53] contre l'ensemble des représentants du bloc duplicon subterminal. Les première et deuxième colonnes indiquent le bloc subterminal et l'accession RefSeq qui s'alignent l'un sur l'autre. La troisième est la ligne de description de la base de données RefSeq. Les quatrième et cinquième colonnes sont le pourcentage d'identité et le pourcentage de couverture de l'ARNm aligné tel que rapporté par Spidey. (PDF 72 Ko)